UNIVERSIDAD CENTRAL DE VENEZULA

FACULTAD DE CIENCIAS
ESCUELA DE BIOLOGA
LABORATORIO AVANZADO DE BIOQUMICA
SEMESTRE I-2013

Inhibicin de la actividad amiloltica del gorgojo de arroz

(Sitophilus oryzae L.) por extractos de caraotas (Phaseolus
vulgaris L.), variedades blanca y negra.
Rircardo Romero
CI 20093640
Profesor
Alexander Laurentn

Caracas, Noviembre de 2013

Introduccin
Las alfa-amilasas constituyen una familia de hidrolasas encargadas de escindir
los enlaces -D-(1,4)-glucano del almidn, glucgeno y otros carbohidratos
relacionados (Pereira, 1999). Est presente tanto en plantas, insectos, hongos y
animales. Es la ms imprtate enzima digestiva de muchos insectos que se
alimentan exclusivamente de granos durante su estado larval y adulto, ya que el
clivaje del almidn por la alfa-amilasa es el primer paso en la degradacin
enzimtica de polisacridos, que es esencial para la asimilacin de carbohidratos.
El gorgojo de arroz (Sitophilus oryzae L.) cae dentro de este grupo. Hallar e aislar
inhibidores para esta enzima puede ser una herramienta para el control de la
poblacin de este insecto, que es considerado una plaga por las prdidas que
provoca a la industria agrcola. El inhibidor prevendra el crecimiento del insecto a
travs de la inhibicin de la digestin del almidn en el intestino. Trayendo como
resultado que las larvas muriesen de hambre (Yamada y col, 2001).
La caraota es la especie ms conocida del gnero Phaseolus en la familia de la
Fabceas. Se han encontrado en los granos de caraotas inhibidores para alfaamilasa pancretica bovina y porcina (Szwarchbort, 1998; Antn-Le Berre y col,
1998). Esto motiv el estudio de este inhibidor sobre la alfa amilasa del gorgojo de
arroz.
Es importante manejar algunos conceptos para afrontar la lectura de este
trabajo:
Se define la actividad enzimtica como la cantidad de enzima, es nuestro
caso, medida en L que cataliza la conversin de 1 mol de sustrato en producto
Almidn en maltosa en nuestro ensayo- en unidad de tiempo.
La actividad especfica es la actividad enzimtica por kilogramo de
protena. Esta ltima es proporcional a la pureza de la enzima. (Nelson y Cox,
2006).

Objetivos
1. Ensayar mtodos tiles para el estudio de la actividad enzimtica, como:
cuantificacin de glucosa, azcares reductores y protenas.
2. Obtener extractos del gorgojos de arroz (Sitophilus oryzae, L) y de caraotas
negras y blancas (Phaseolus vulgaris, L.), y estimar su concentracin de
protenas.
3. Estimar cuantitativamente el efecto inhibitorio de los extractos obtenidos
sobre la actividad amiloltica del gorgojo de arroz (Sitophilus oryzae, L) y
sobre la alfa-amilasa pancretica porcina.
Materiales y Mtodos
Curva de calibracin de Glucosa oxidasa/peroxidasa
Se utiliz el estuche comercial glucosa oxidasa/peroxidasa de la marca
Invelab; este inclua el reactivo de trabajo y el patrn de glucosa (1 g/L), cabe
sealar que el reactivo haba expirado. Se prepar, por duplicado, cinco puntos
para la curva de calibracin con sus respectivos blancos (20 L, 15 L, 10 L, 5 L
y blanco). Fue necesario atemperar el reactivo de trabajo y el patrn de glucosa
antes de cada ensayo. Para preparar cada muestra se agreg, en el siguiente
orden, la cantidad patrn de glucosa necesario en la muestra, agua destilada (si
se requera) y 1 mL de reactivo de trabajo; para obtener 1,02 mL de volumen final.
Se mezcl en vrtex y se dej reposar a temperatura ambiente por 30min. Por
ltimo, se ley la absorbancia a 510 nm.
La reaccin que ocurre es la siguiente:

Curva de calibracin de maltosa

Para la realizacin de este ensayo se us como patrn maltosa 10 g/L. Se
prepar, por duplicado seis puntos para la curva con su respectivo blanco (2,6 mg;
1,6 mg; 1,2 mg; 0,8 mg; 0,4 mg; blanco). Se agreg las cantidades de maltosa y
agua destilada respectivas para cada muestra y 1 mL de DNS, hasta obtener 2 mL
de volumen final. Luego, se llevaban a bao de Mara en ebullicin por 10 min, y
ulteriormente a bao de Mara a temperatura ambiente por 2 min. Se aadieron 15
mL de agua destilada a cada tubo y, por ltimo, se ley la absorbancia a 530nm.

Curva de calibracin de BSA

Para la realizacin de este ensayo se us como patrn de BSA a 0,5 g/L.
Se prepar, por duplicado cinco puntos para la curva con su respectivo blanco (20
g, 40 g, 60 g, 80 g y blanco). Se prepar la solucin de cobre alcalino
agregando, en este orden, CuSO4 al 1 %, tartrato Na/K 2 % y NaCO3 2 % en
NaOH 0,1 mol/L. Se agreg las cantidades de BSA y agua destilada respectivas
para cada muestra hasta un volumen final de 0,5 mL y 2,5 mL de solucin de
cobre alcalino; inmediatamente despus se pas por vortex. Luego se esper 10
min. En este tiempo se hizo una dilucin 1:1 de reactivo de Folin-Ciocateu y agua.
Pasado los 10 min, se agreg 0,25 mL del reactivo a las muestra y se pas por
vortex inmediatamente. Se esper 30 min y por ultimo se ley la absorbancia a
580 nm.
Extraccin de enzima alfa-amilasa
En el presente estudio se utiliz gorgojos adultos de arroz, Sitophilus
oryzae L. (Coleptera: Curculionidae), mantenidos en el Laboratorio de
Polisacridos Vegetales, Instituto de Biologa Experimental, Universidad Central de
Venezuela.
Se colect 90 gorgojos y se colocaron en fro durante 5min. Luego se
pasaron en un homogenizador Potter-Elvehjem tipo D, agregndosele 6 mL de
buffer acetato pH 5,01. Se aplicaron golpes de homogenizador hasta que no
fueron reconocibles partes de gorgojos, en nuestro caso, fueron necesarios 30
golpes; todo esto, se mantuvo la temperatura del homogenato a aproximadamente
4C. La suspencin se centrifug a 16000 x g por 5 min. El sobrenadante obtenido
se guard, en alcotas de 2 mL, en el refrigerador para su uso posterior. La
cuantificacin de protenas de este extracto se realiz con el mtodo de Lowry y
col. (1951).
Extraccin de inhibidor
Las leguminosas usadas para la extraccin de inhibidor fueron caraotas
blancas negras y negras Phaseolus vulgaris L., esta ltima se extrajo bajo dos
condiciones distintas: con testa y sin testa; la caraota blanca slo se extrajo con
testa.
Para a extraccin, se molieron los cotiledones de las caraotas hasta obtener
una harina fina. Luego se suspendieron 5 g de esta harina en 25 mL de buffer
acetato pH 5,1 y se sometieron a agitacin por 2 horas a temperatura ambiente.
Se centrifug esta suspensin a 2000 rpm por 15 min y luego se filtr. El filtrado se
guard en eppendorf en alicotas de 0,5 mL dentro del refrigerador. La
cuantificacin de protenas de este extracto se realiz con el mtodo de Lowry y
col. (1951).

Ensayo de actividad alfa-amilasa

Se prepararon ensayos duplicando la concentracin de inhibidor, desde un
factor de dilucin de 32 hasta 1, una muestra de patrn de maltosa y el blanco de
esta, cada una por duplicado. En cada tubo se coloc 40 L de extracto
enzimtico sin diluir y 40 L de inhibidor con la dilucin respectiva a la muestra,
excepto al control, que careca de inhibidor. Se esper 5 min para la formacin del
cctel enzima-inhibidor, luego se agreg la cantidad de buffer acetato pH 5,1
correspondiente a la muestra para alcanzar un volumen de 500 L, y se llev a
bao de Mara a 45 1 C por, al menos 15 min. Durante este tiempo se prepar
el almidn al 5%: en una fiola de 125 mL se agreg 0,5 g de almidn soluble en
agua y 10 mL del mismo buffer usado anteriormente, se tap con una metra, y se
calent en un plancha de calentamiento por 1 min a mxima capacidad (o hasta
que las paredes de la fiola estuvieran empaadas), luego se disminuy la
intensidad de la plancha hasta la mitad durante 5 min (o hasta que la solucin se
tornase transparente). Por ultimo, la solucin de almidn se colocaba en bao de
Mara a 45 1 C. A cada muestra se le aadi 500 L de almidn, para iniciar la
reaccin, y luego de 3 min se agreg 1ml de DNS (3,5- acido dinitrosaliclico) para
detener la reaccin. Las muestras eran llevadas a bao de Mara en ebullicin por
10 min, luego a agua a temperatura ambiente por 2 min, ulteriormente a cada
muestra se le agreg 15 mL de agua destilada y por ultimo se ley la absorbancia
a 530nm.
En los ensayos con alfa amilasa pancretica se realiz el mismo protocolo
pero, en ves de buffer acetato pH 5,1, se us buffer fosfato pH 7 y se realizaron
ensayos hasta un factor de dilucin del inhibidor de 4. La concentracin de la
enzima fue 0,2 g/L.
Actividad enzimtica
La actividad enzimtica (ASA), de cada ensayo, fue determinada a travs
de siguiente frmula:
ASA (mmol/s.L)= mg de maltosaa x 10^6b x 1000c
1000d x 40 Le x 342f x 180g
a= Producto de la reaccin amiloltica. Estimado experimentalmente mediante una
curva de calibracin.
b= Factor de conversin: L a L.
c= Factor de conversin: moles a mmol.
d= Factor de conversin: mg a g.
e= Alicota de extracto enzimtico en L.
f= Masa molecular de la maltosa; en gramos por mol.
g= Tiempo de la reaccin en segundos.

Actividad enzimtica especfica

La actividad enzimtica especfica (ASAe), de cada ensayo, fue
determinada a travs de siguiente formula:
ASAe (mol/s.kg)= mg de maltosaa x 10^9b
1000d x g de protenae x 342f x 180g
a= Producto de la reaccin amiloltica. Estimado experimentalmente mediante una
curva de calibracin.
b= Factor de conversin: g a g.
d= Factor de conversin: mg a kg.
e= Contenido de protenas en la alcuota de 40 L, medida en g.
f= Masa molecular de la maltosa, en gramos por mol.
g= Tiempo de la reaccin en segundos.
Resultados
Figura 1-. Curva de calibracin de Glucosa oxidasa/peroxidasa

0,00197

La figura 1 muestra la curva de calibracin de la glucosa oxidasa/peroxidasa.

Las barras de error representan la desviacin estandr (n=3).

Figura 2-. Curva de calibracin de maltosa

0,00737

La figura 2 muestra la curva de calibracin de maltosa.

Las barras representan la desviacin estndar (n=3).

Figura 3-. Curva de calibracin de BSA.

y = 0,00402 + 0,00197

La figura 3 muestra la curva de calibracin de BSA.

Esta se realiz con el mtodo de Lowry y col (1951). Las barras representan la
desviacin estndar (n=5)

Tabla 1-. Concentracin de protenas en extractos.

Concentracin de protena de los distintos extractos obtenidos y usadas en los
ensayos amilolticos.
Extracto
1. Caraota blanca*
2. Caraota blanca*
3. Caraota negra sin testa
4. Caraota negra sin testa
5. Caraota negra con testa
A. Insecto*
B. Insecto
C. Insecto
*
=Extrado por Noymar Luque.

= Extrado en agua
N/D= No determinado

[protena] g/L
26,96
34,94
13,16
N/D

23,33
0,85
0,71
0,97

Tabla 2-. Actividad enzimtica (ASA).

Tabla comparativa de la actividad enzimtica de alfa- amilasa de
gorgojos con distintos inhibidores extrados de caraotas, bajo distintas
condiciones y variando la concentracin de dichos inhibidores.
Dilucin del inhibidor
Inhibidor
4. Caraota negra sin testa

Control 1/32
A

1/16

1/8

1/4

1/2

44,1

52,2

51,2

53,9

54,9

60,4

66,8

76,5

72,2

72,4

68,4

74,3

72,4

73,0

3. Caraota negra sin testa, segundo ensayo B

84,6

89,3

82,8

84,6

89,4

91,4

140,1

1. Caraota blanca*

116,9

111,6

116,8

116,8

116,0

N/D

N/D

89,2

93,4

3. Caraota negra sin testa, primer ensayo

5. Caraota negra con testa

C
81,7
76,8
85,4
85,2
87,5
Los valores estn expresados en mmol/s.L (n=1)
*
= No se realiz muestras en este ensayo con esa concentracin de inhibidor.

= En esta condicin, el inhibidor se extrajo en agua (y no en buffer).

N/D= No determinado.
Extracto de insecto en el coctel de reaccin: A:136,00 mg/L; B: 28,40 mg/L; C: 38,80 mg/L

Tabla 3-. Actividad enzimtica especfica (ASAe).

Tabla comparativa de la actividad enzimtica especfica, de alfa- amilasa
de gorgojos, con distintos inhibidores extrados de caraotas, bajo
distintas condiciones y variando la concentracin de dichos inhibidores.

Dilucin del inhibidor

Inhibidor

Control 1/32
A

4. Caraota negra sin testa

1/16

1/8

1/4

1/2

62,5

74,1

72,6

76,4

77,8

85,6

94,6

108,5

102,3

102,6

97,0

105,3

102,7

103,5

3. Caraota negra sin testa, segundo ensayo B

120,0

126,6

117,4

120,0

126,7

129,5

198,6

1. Caraota blanca*

121,0

115,6

120,9

120,9

120,1

N/D

N/D

5. Caraota negra con testa

C
84,6
79,5
88,4
88,2
90,6
Los valores estn expresados en mol/s.kg (n=1)
*
= No se realiz muestras en este ensayo con esa concentracin de inhibidor.

= En esta condicin, el inhibidor se extrajo en agua (y no en buffer).

N/D= No determinado.
Extracto de insecto en el coctel de reaccin: A:34,00 mg/L; B: 28,40 mg/L; C: 38,80 mg/L

92,3

96,7

3. Caraota negra sin testa, primer ensayo

Tabla 4-. Actividad enzimtica (ASA) de alfa-amilasa pancretica.

Tabla comparativa de la actividad enzimtica, de alfa-amilasa
pancretica, con dos inhibidores extrados en agua de caraotas blancas y
negras respectivamente, variando la concentracin de dichos
inhibidores.
Inhibidor

Control

32

Dilucin del inhibidor

16
8

Caraotas blancas
13,9
8,8
Caraotas negras sin testa
17,4
15,3
Los valores estn expresados en mmol/s.L (n=1)
La -amilasa pancretica porcina (Sigma) fue preparada a 0,2 g/L
* Extrado por Noymar Luque.
Extrado en agua.
Enzima en el coctel de reaccin: 8 mg/L

8,5
14,6

8,9
15,4

4
9,9
16,0

Tabla 5-. Actividad enzimtica especfica (ASA) de alfa-amilasa

pancretica.
Tabla comparativa de la actividad enzimtica especfica, de alfa-amilasa
pancretica, con dos inhibidores, extrados en agua, de caraotas blancas
y negras respectivamente variando la concentracin de dichos
inhibidores.
Inhibidor
Caraotas blancas*
Caraotas negras sin testa

Control
69,7
87,1

Dilucin del inhibidor

32
16
8
44,2
76,5

42,5
72,8

44,4
77,2

4
49,7
80,0

Los valores estn expresados en mol/s.kg (n=1)

La -amilasa pancretica porcina (Sigma) fue preparada a 0,2 g/L
* Extrado por Noymar Luque.
Extrado en agua.
Enzima en el coctel de reaccin: 8 mg/L

Discusin
La finalidad del ensayo con glucosa fue adiestrar al estudiante en el manejo
de los equipos necesarios para el estudio de la actividad amiloltica. Cabe
recordad que el estuche comercial de glucosa oxidasa haba claudicado. Tal vez
por esto la pendiente de la ecuacin de la recta, de la curva de calibracin, es 17
% superior (ver figura 1) a las reportadas por Gonzles (2013) y Martn (2010):
y=0,0307x + 0,001 (R2=0,999) y y=0,0294x (R2=0,9729) respectivamente.
La realizacin de una curva de calibracin de maltosa tambin tuvo la
finalidad de adiestrar al estudiante para los ensayos de actividad amiltica, y para
tener un patrn para determinar la cantidad de maltosa producida en los ensayos
de amillisis aunque cada ensayo tuvo su propio patrn de maltosa-. La ecuacin
de la recta, ver figura 2, fue parecida a la reportada por Gonzles (2013):
y=0,3809x 0,011 (R2=0,999).
La curva de calibracin de BSA fue necesaria para la determinacin de la
concentracin de protena de los extractos utilizados en los ensayos de actividad
amiloltica (ver tabla 1). La pendiente es similar a la reportada por Martn (2010):
y=0,0038x (R2=0,9978) (ver figura 3).
Si vemos la tabla 1, notaremos que los extractos de caraotas con testa
tienen una concentracin de protenas ms altas que los extractos de caraota sin
testa. Esto se debe a qu la testa contiene protenas, adems de taninos, fibra y
varios compuestos fenlicos (Gonzales y col, 2005). Al comparar el extracto 1 con
el extracto 2, notamos que el extrado el buffer tiene una menor concentracin de
protenas que el extrado en agua. Esto puede deberse a que, al pH en que se
encontraba el buffer (pH 5,01) algunas protenas estaban en su punto isoelctrico
y precipitaron. La concentracin de protenas en los extractos de insectos
obtenidos fueron mayor a la reportada por Szwarcbart, (1980); el report 0,4 g/L
en su extracto de gorgojos adultos, pero hay que tener en cuenta que este autor
us una relacin de 2 gorgojos por mL de buffer.
Para que se pueda afirmar que ocurri inhibicin en algn ensayo
enzimtico, la actividad enzimtica (ASA) de las muestras con inhibidor debe ser
menor que la ASA del control. Al fijarnos en la Tabla 2, notamos que en ninguna de
las muestras ocurri inhibicin, de manera significativa, de la actividad amiloltica
de la enzima. La Tabla 3, referente a la actividad enzimtica especfica, denota
estos mismos resultados: los extractos de caraotas (Phaseolus vulgaris) no
inhiben a la enzima alfa amilasa de gorgojo de arroz (Sitophilus oryzae). Se podra
pensar que el cido tnico presente en la testa de las caraotas podra actuar como

un inhibidor inespecfico de la enzima del gorgojo (Jaffe, 1973), pero no fue as; no
se observ diferencias relevantes entre la ASA del ensayo con extracto de
caraotas negras sin testa, en buffer, como inhibidor y el ensayo con caraotas
negras con testa. Trabajos previos han descrito que los granos de leguminosa
poseen inhibidores especficos para amilasas como, por ejemplo, la pancretica
bovina y la de cerdo (Jaffe, 1973; Szwarcbart, 1980; Antn-Le Berre y col, 1998).
Adems, los ensayos realizados con alfa-amilasa pancretica (ver tabla 4 y 5)
concuerdan con esos resultados. Todo esto nos lleva a pensar que la actividad
amiloltica del gorgojo no es inhibida por estos inhibidores. Esta sentencia es
consistentes con los resultados obtenidos por Szwarcbart, (1980).
Existen inhibidores que actan tanto en alfa amilasas de insectos como en
de mamferos (Strobl y col, 1998); inhibidores que actan contra alfa amilasas de
insectos pero no contra la de mamferos (Pereira y col, 1998), y, como indican
estos resultados, inhibidores que no afectas la alfa amilasa de insectos pero s la
de mamferos.
Distintos estudios (Silano y col, 1975; Ming-Shun Chen y col ,1992) sealan
que la alfa amilasa del gorgojo del arroz es inhibida por inhibidores presentes en el
trigo. Este dato es indispensable para la posible explicacin de por qu los
inhibidores de las caraotas no afectan a la enzima del insecto: Las plantas, por
seleccin natural, desarrollan defensas contra depredadores, como inhibidores de
alfa amilasa. Extractos de insectos devoradores de trigo tienen una actividad
amiloltica mayor en ensayos con inhibidores presentes en el trigo, que de insectos
que no devoran trigo (Silano y col, 1975). Probablemente, la razn de que este
ltimo grupo no devore trigo sea por dichos inhibidores. Probablemente este
grupo de insectos anteriormente fueron devoradores de trigo, pero la seleccin
natural fij en las plantas de trigo inhibidores especficos para ese grupo, que tuvo
que cambiar circunstancialmente su dieta. Siguiendo esta lnea de razonamiento y
viendo los resultados obtenidos, se esperara que el gorgojo de arroz fuera un
vido devorador de caraotas; pero no as, se ha reportado en otros estudios que el
gorogojo de arroz no logra sobrevivir con una dieta compuesta por caraotas
(Szwarchbort, 1980). Creemos que las caraotas no han sido seleccionados como
mecanismo de defensa inhibidores especficos contra alfa amilasas de gorgojos de
arroz, pero s otro tipo de defensa, como los taninos en sus testa.
Pasemos a discutir otro punto lgido de la tabla 2 y 3: Las diferencias entre
el extracto de caraotas negra sin testa en agua (extracto 4) y el extracto de
caraotas negras sin testa en buffer (extracto 3). La actividad ASA del extracto 3 es
casi el doble que el suspendido en agua. Esta diferencia puede deberse a que la
enzima usada para el ensayo cuyo inhibidor usado fue CNSTA fue extraa casi 6
meses antes de dicho ensayo (fue extraa el 9/11/12 y el ensayo fue realizado el
8/5/2013), y la enzima usada en los ensayos con extracto 3 como inhibidor fue
extraa el mismo da de uno de los ensayos y 3 das antes del otro. Resumiendo,
la enzima usada en ensayo con extracto 3 era ms activa, probablemente, porque
estaba recin extrada. De otro modo no se explica por qu habra una diferencia
tan grande de las ASA entre las condiciones del inhibidor ya que, tal como se
explico prrafos atrs, el inhibidor no afecta a la enzima del gorgojo de arroz.

Pero ahora analicemos los resultados del ensayo con amilasa pancretica
(Tablas 4 y 5): la actividad enzimtica (ASA) disminuy, en cada una de las
diluciones del inhibidor, con respecto al control. En el ensayo con caraotas
blancas, las muestras con inhibidor mostraron una ASA similar, excepto la muestra
con el inhibidor ms concentrado, cuya actividad ASA fue mayor. Cmo no se
realizaron replicas de este ensayo, no se puede comprobar si este resultado es
producto de un error experimental o si esta diferencia es significativa respecto al
resto. Se esperaba que a medida que la concentracin del inhibidor disminuyera,
la ASA aumentara (Yamada, T y col, 2001); pero no se observ eso, es probable
que no se diluyera suficientemente el inhibidor para observar esa tendencia. Hay
que acotar que no se trabaj en la temperatura ptima de la enzima, que son 37
C, sino a 45 C.
Conclusin

Aparentemente la enzima alfa-amilasa del gorgojo de arroz no es blanco

para los inhibidores presentes en las caraotas crudas, pero la alfa-amilasa
pancretica s es blanco para estos inhibidores.
Al parecer, las curvas de calibracin de glucosa realizadas con reactivos
caducados presentan una pendiente mayor a las reportadas en otros
estudios, con el reactivo en buen estado.
Las curvas de calibracin de maltosa y BSA fueron similares a las
reportadas en estudios previos.
Al parecer, los extractos de caraotas negras con testa presentan una mayor
concentracin de protenas que los extractos sin testa.

Bibliografa
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