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DOI: 10.1590/1808-1657001192012
RESUMO: Vrios estudos esto sendo conduzidos para a descoberta de novos agentes antimicrobianos provenientes de plantas, para
que possam ser utilizados em produtos farmacuticos, cosmticos
e na indstria alimentcia. A ausncia de padronizao de mtodos
utilizados para a avaliao de extratos vegetais com potencial antimicrobiano dificulta a comparao de resultados. Considerando a
necessidade de estabelecer um mtodo com resultados consistentes
para avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos vegetais, este
trabalho props-se a avaliar a atividade antimicrobiana e determinar
a concentrao mnima inibitria de extratos de plantas da famlia
Myrtaceae sobre diferentes micro-organismos, utilizando trs mtodos para avaliao de antimicrobianos. Os mtodos empregados
foram microdiluio em caldo e difuso em gar por disco e poo.
Foram avaliados os extratos de Psidium guajava, Myrciaria cauliflora
e Syzygium cumini sobre bactrias Gram-positivas, negativas e levedura. Em geral, a inibio promovida pelos extratos no teste de difuso em gar por poo foi maior do que os valores obtidos por disco,
independentemente do extrato vegetal testado. Contudo, a atividade
inibitria de todos os micro-organismos s pde ser determinada
com o mtodo de microdiluio em caldo, que tambm apresentou
os resultados mais reprodutveis, e mostrou-se o mais econmico e
confivel para se avaliar a atividade antimicrobiana de extratos vegetais quando comparado aos outros mtodos.
so; microdiluio.
Centro de Cincias Biolgicas e da Sade, Laboratrio de Biotecnologia; Universidade Estadual do Oeste do Paran (UNIOESTE) Cascavel (PR), Brasil.
Centro de Cincias Biolgicas e da Sade, Laboratrio de Farmacognosia; UNIOESTE Cascavel (PR), Brasil.
3
Laboratrio de Microbiologia; Universidade Federal da Fronteira Sul Realeza (PR), Brasil.
*Autor correspondente: fabiana.pinto@unioeste.br
Recebido em: 13/11/2012. Aceito em: 06/02/2014
1
2
218
INTRODUO
Diversos estudos vm sendo desenvolvidos e direcionados
descoberta de novos agentes antimicrobianos provenientes de
extratos vegetais e outros produtos naturais, com o objetivo
de descobrir compostos com atividade comparada dos tradicionalmente utilizados, porm, com menor toxicidade, mais
eficazes contra a resistncia de micro-organismos patognicos
e com menor impacto ambiental.
Na avaliao da atividade antibacteriana e antifngica
dos extratos diferentes mtodos podem ser utilizados, sendo
os seguintes os mais conhecidos: mtodo de difuso em gar
por poo, disco-difuso e mtodos de macrodiluio e microdiluio, os quais so realizados em caldo. Os mtodos de
difuso em gar ou em caldo so igualmente aceitveis para
medir quantitativamente a atividade in vitro de um agente
antimicrobiano contra um determinado isolado bacteriano
(Clsi, 2008). Na determinao da Concentrao Inibitria
Mnima (CIM) ou da Concentrao Bactericida Mnima
(CBM) de extratos vegetais, tem-se utilizado mais frequentemente o mtodo de microdiluio em caldo (Ostrosky
etal., 2008).
O mtodo de disco-difuso foi proposto por vrios autores
para verificar a atividade antimicrobiana de extratos vegetais,
como Nascimento etal. (2000) e Karaman etal. (2003). J
Ostrosky etal. (2008) mencionaram o mtodo de microdiluio em caldo como sendo o mais confivel para avaliar
agentes antimicrobianos, por fornecer resultados quantitativos e no ser influenciado pela velocidade de crescimento do
micro-organismo. Por outro lado, Othman etal. (2011) propuseram que, tanto o uso em base caldo como em base gar
so necessrios para obteno de resultados confiveis da atividade antimicrobiana de extratos de plantas.
Embora geralmente sejam utilizadas as normatizaes
internacionalmente conhecidas do Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI) como base para testes de suscetibilidade antimicrobiana, as diretrizes so direcionadas para
antimicrobianos com parmetros j conhecidos. H poucos
estudos comparativos relatando qual o melhor mtodo a ser
utilizado para avaliar a atividade antimicrobiana de extratos
vegetais, mesmo no que se refere s metodologias usualmente
utilizadas. Alm disso, h a necessidade da uniformizao dos
mtodos de extrao e testes in vitro, para que a pesquisa possa
ser mais eficiente, e a interpretao dos resultados, mais facilitada e confivel (Cowan, 1999).
A ausncia de padronizao das metodologias limita as
pesquisas sobre atividade antimicrobiana de extratos vegetais no que tange comparao de resultados obtidos por
diferentes pesquisadores, que avaliam a mesma amostra com
diferentes metodologias. Isso est relacionado a um carter
multifatorial que pode modificar a inibio in vitro de crescimento de micro-organismos, como o mtodo de obteno dos extratos, a espcie de micro-organismo utilizada, a
MATERIAL E MTODOS
Plantas e extratos
As folhas das plantas P. guajava (goiabeira branca voucher 6900), M. cauliflora (jabuticabeira 6882) e S. cumini
(jambolo voucher 6898) foram coletadas nas primeiras horas da manh, nos meses de janeiro e fevereiro, em
propriedades rurais no municpio de Medianeira (PR).
Foram identificadas no herbrio da Universidade Estadual
do Oeste do Paran (UNIOESTE), Cascavel (PR), sendo
que uma exsicata de cada planta foi depositada no herbrio com o registro do exemplar voucher apresentado adjacente ao nome popular.
As folhas das plantas coletadas foram secas a 40C e trituradas em moinho de facas do Tipo Willye, at a obteno
de p de granulometria inferior a 0,42 mm. Foram preparados os extratos com base na metodologia de Santurio etal.
(2007), com modificaes. Para obteno do extrato etanlico adicionou-se p ao lcool etlico PA na proporo de
2:10 (p/v) para macerao por 24 horas, em shaker rotativo,
a 180rpm, a 23C. Realizou-se a concentrao do extrato em
rota-evaporador a 40C. O extrato obtido foi diludo com gua
destilada estril contendo 10% de dimetilsulfxido (DMSO)
para a proporo final de 200 mg.mL-1 e esterilizado por filtrao em membrana filtrante com porosidade de 0,45 mm.
Para a obteno do extrato aquoso, a macerao foi realizada
utilizando-se como solvente extrator a gua destilada estril, contendo 10% de DMSO, seguindo os mesmos padres
de proporo, armazenamento e filtragem do extrato etanlico. Outra filtrao a vcuo foi realizada, tal como citado.
219
Determinao da atividade
antimicrobiana
Os testes foram realizados com cepas padro de Bacillus
subtilis subsp. spizizenii CCCD B005, Candida albicans
ATCC 10231, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella
pneumoniae ATCC 13883, Salmonella enterica subsp. enterica Typhimurium ATCC 14028; Pseudomonas aeruginosa ATCC
27853 e Staphylococcus aureus ATCC 25923. Os extratos
foram diludos e avaliados nas concentraes que variaram
de 100 a 0,04 mg.mL-1.
Foram utilizados os mtodos microdiluio em caldo, com
base na metodologia de Santurio etal. (2007), com modificaes, e as metodologias de difuso em gar por poo e por
disco, realizadas conforme recomendaes do Clsi (2009a).
Utilizaram-se como controle positivo os antimicrobianos cloranfenicol, gentamicina e nistatina (CLSI, 2009b).
Avaliao da atividade
antimicrobiana pela metodologia de
difuso em gar por disco e poo
Previamente realizao dos experimentos, as amostras bacterianas foram recuperadas em caldo Brain Heart Infusion (BHI)
a 36C por 18 horas. Avaliou-se a suscetibilidade antimicrobiana de acordo com o mtodo de disco-difuso, de acordo
com recomendaes do Clsi (2009a), com adaptaes. Para
tal, discos estreis de papel filtro (6 mm ) receberam uma
alquota de 20 L de cada extrato a ser testado e, em seguida,
o disco foi aplicado com pina estril sobre uma placa de Petri
contendo gar Mueller-Hinton (MH), previamente inoculada
com o micro-organismo a ser testado. Para o teste de difuso
em disco foram considerados com atividade inibitria os halos
com dimetro 6 mm.
220
O teste de difuso por poo foi realizado conforme atualizaes do Clsi (2009a), com adaptaes, que diferencia-se
do teste de disco pela realizao de trs orifcios de 6 mm de
dimetro no meio de cultura gar MH em placas de Petri, com
o auxlio de um molde formando os poos. As placas foram
inoculadas na superfcie pelos micro-organismos com o uso
de um suabe e, ento, os poos foram preenchidos com 20L
do extrato na concentrao a ser testada.
Em ambos os testes, as placas foram incubadas a 35C
por 24 horas. Os halos de inibio do crescimento microbiano foram medidos em milmetros, com auxlio de uma
rgua milimetrada.
Os dados obtidos nas avaliaes de difuso em gar foram
submetidos anlise de varincia (ANOVA), sendo as mdias
das medidas dos halos comparadas pelo teste Tukey, ambos
a 5% de significncia, utilizando-se o programa SISVAR
(Ferreira, 2007).
RESULTADOS E DISCUSSO
Avaliao da atividade antimicrobiana
por difuso em gar pelas tcnicas de
disco e de poo
Nos bioensaios de difuso em gar pelo mtodo do poo, verificou-se que todos os extratos inibiram a maioria das bactrias,
com formao de halos de inibio ao redor dos poos onde
foram depositadas as solues testadas. Na tcnica do disco,
foi possvel observar que o nmero de bactrias inibidas pelos
extratos foi menor quando comparado ao poo (p<0,05).
Noentanto, no foi verificada a inibio da levedura C.albicans
por nenhuma tcnica de difuso em gar (Tabela 1).
Verificou-se a presena do halo de inibio nas concentraes dos extratos entre 50 e 100 mg.mL-1, e, para a comparao das medidas dos halos entre as tcnicas de difuso por
poo e por disco, utilizou-se a mdia do dimetro dos halos
na concentrao de 100 mg.mL-1, em teste de Tukey (significncia de 5%) (Tabela 1).
Observou-se que em 13,5% das medidas dos halos de inibio, utilizando a metodologia de disco, e 52% da metodologia do poo, o coeficiente de variao ficou abaixo de 5%.
Houve diferena significativa em 74% das medidas dos halos
de inibio entre as metodologias testadas, observando melhor
performance dos extratos com a utilizao da tcnica de poo
(Tabela1). A diferena entre os mtodos ficou mais evidente
quando analisados os extratos frente S. Typhimurium e K.pneumoniae (Gram-negativas).
Verificou-se ainda diferena significativa entre os halos de
inibio observados na metodologia do poo e do disco para a
maioria das bactrias testadas em relao aos extratos aquosos e
etanlicos de jambolo. Loguercio etal. (2005), ao avaliarem a
atividade antimicrobiana do extrato etanlico de S. cumini sobre
cepas bacterianas de referncia (P.aeruginosa, S. aureus, C. albicans
e K. pneumonia), pelo mtodo de disco-difuso em concentraes
entre 50 e 300 mg.mL-1, tambm observaram halo de inibio.
Atravs dos resultados do teste de difuso em gar pela
metodologia de poo, foi possvel verificar a presena de halos
de inibio para todos os extratos frente S. Typhimurium.
Chattopadhyay etal. (1998) obtiveram resultado semelhante
ao atual trabalho utilizando a tcnica de disco-difuso para testar a atividade de extratos de jambolo. Os autores atribuem
esta atividade inibitria presena de polifenis derivados do
cido glico e elgico. Ambos os trabalhos demonstraram atividade inibitria dos extratos, principalmente os etanlicos,
em concentraes variveis, frente s bactrias Gram-positivas
(S. aureus e B.subtilis) e para a maioria das Gram-negativas
(como E.coli, S. Typhimurium e P. aeruginosa).
Em relao aos extratos de jabuticabeira, a tcnica de poo
avaliada com o extrato aquoso apresentou diferena estatstica
frente tcnica de disco para S. enterica e S. aureus. O mesmo
se observou entre as tcnicas quando avaliou-se o extrato
Metodologia de microdiluio
em caldo e determinao das
Concentrao Inibitria Mnima e
Concentrao Fungicida Mnima/
Concentrao Bactericida Mnima
Em geral, a CIM variou entre 0,39 e 100 mg.mL-1, sendo que
para as bactrias Gram-positivas a variao das CIMs foi entre
6,25 e 100 mg.mL-1 e de 0,39 a 25 mg.mL-1 para as Gramnegativas, indicando estas como sendo as bactrias mais suscetveis. J a CIM para a levedura C. albicans variou de 6,25
a 12,5 mg.mL-1 (Tabela 2).
Com exceo do extrato etanlico de S. cumini, todos
os demais apresentaram atividade bactericida somente para
as Gram-negativas, com CBM entre 0,39 e 50 mg.mL-1
(Tabela2). Esses resultados discordam de Sanches etal.
(2005), que verificaram os maiores efeitos bactericidas
dos extratos hidroalcolicos de P. guajava sobre as bactrias Gram-positivas S. aureus e B. subtilis. Esses resultados
discrepantes podem estar relacionados ao uso de diferentes
221
Ca
0,0 0,0 a
0,0 0,0 a
0,0 0,0 a
0,0 0,0 a
0,0 0,0 a
0,0 0,0 a
0,0 0,0 a
0,0 0,0 a
Ec
8,6 1,1 b
cv = 9,16 %
0,0 0,0 a
9,6 0,5 a
cv = 8,03 %
11,0 1,7a
cv = 5,66 %
0,0 0,0 a
0,0 0,0 a
12,0 1,7 a
cv = 9,59 %
13,6 1,1a
cv = 4,49 %
Kp
0,0 0,0 a
11,0 1,7 b
cv = 5,14 %
0,0 0,0 a
16,0 1,7 b
cv = 4,71 %
0,0 0,0 a
0,0 0,0 a
0,0 0,0 a
19,3 1,5 b
cv = 4,08 %
Pa
12,3 2,3a
cv = 7,32 %
14,0 3,4 a
cv = 8,3 %
11,0 1,0 a
cv = 36 %
25,3 2,5 b
cv = 5,00 %
6,6 1,1 a
cv = 4,53 %
7,3 2,3 a
cv = 6,24 %
13,0 1,7 a
cv = 5,53 %
15,6 0,5 a
cv = 1,35 %
ST
8,0 1,0 a
cv = 10,81 %
18,6 1,5 b
cv = 5,47 %
8,3 0,5 a
cv = 9,56 %
17,3 0,5 b
cv = 4,43 %
8,6 0,5 a
cv = 10,17 %
21,0 1,7 b
cv = 5,59 %
9,3 1,1 a
cv = 9,25 %
18,3 2,3 b
cv = 6,88 %
Sa
13,0 2,6 a
cv = 12,91 %
23,3 2,0 b
cv = 5,30 %
15,0 2,6 a
cv = 9,31 %
18,0 0,0 a
cv = 1,56 %
11,3 2,3 a
cv = 12,63 %
25,0 1,0 b
cv = 2,75 %
11,6 2,8 a
cv = 9,96 %
23,6 0,5 b
cv = 1,99 %
Bs
0,0 0,0 a
0,0 0,0 a
20,0 3,0 b
cv = 9,11 %
13,6 1,1 a
cv = 5,95 %
0,0 0,0 a
0,0 0,0 a
11,6 1,5 a
cv = 9,86, %
16,3 1,5a
cv = 8,46 %
Micro-organismos
Micro-organismos
Tabela 1. Comparao entre as medidas dos dimetros dos halos de inibio do crescimento microbiano (mm) obtidas pelas
metodologias de disco e poo utilizando extratos de plantas aquosos e etanlicos (Syzygium cumini, Myrciaria cauliflora e Psidium
guajava) e antimicrobianos comerciais (nistatina, cloranfenicol e gentamicina) frente a micro-organismos padro.
Jambolo
Jabuticaba
Aquoso
Etanlico
Aquoso
Etanlico
Goiabeira
Nistatina
Aquoso
D
Cloranfenicol
Gentamicina
Etanlico
P
Ca
Ec
9,3 0,5 a
cv = 8,10 %
15,0 1,0 b
cv = 4,19 %
27,0 2,0 a
cv = 7,41 %
46,6 1,5 b
cv = 3,27 %
Kp
0,0 0,0 a
12,0 0,0 b
cv = 2,53 %
0,0 0,0 a
14,0 0,0 b
cv = 2,44 %
36,0 1,0 a
cv = 2,78 %
44,0 1,0 b
cv = 2,27 %
Pa
0,0 0,0 a
12,6 1,1 b
cv = 2,83 %
10,3 1,5 a
cv = 2,62 %
16,3 0,5 b
cv = 3,52 %
ST
7,6 0,5 a
cv = 9,23 %
13,3 1,5 b
cv = 6,01 %
8,3 1,1 a
cv = 9,29 %
16,6 0,5 b
cv = 4,48 %
29,0 2,6 a
cv = 9,12 %
41,0 1,7 b
cv = 4,22 %
Sa
28,0 2,6 a
cv = 9,45 %
34,3 0,5 b
cv = 1,68 %
Bs
0,0 0,0 a
0,0 0,0 a
D: disco; P: poo; cv: coeficiente de variao; Letras distintas na mesma linha indicam diferena significativa entre as metodologias de acordo
com o teste de Tukey ( : 0,05); (0) no apresentou inibio; (-) : teste no aplicvel; Ca: Candida albicans ATCC 10231; Ec: Escherichiacoli ATCC
2592; Kp: Klebsiella pneumoniae ATCC 13883; Pa: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853; ST: Salmonella enterica subsp entericaTyphimurium
14028; Sa: Staphylococcus aureus ATCC 25923; Bs: Bacillus subtilis subsp spizizenii CCCD B005.
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Tabela 2. Concentrao Inibitria Mnima, Concentrao Funcida/Bactericida Mnima (mg.mL-1) dos extratos de Myciaria cauliflora,
Psidium guajava e Syzygium cumini e antimicrobianos comerciais frente a micro-organismos padro
Extratos
Candida
albicans
Escherichia
coli
Klebsiella
pneumoniae
Bacillus subtilis
CIM
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
CIM
CBM
CFM
Etanlico
6,25
ND
0,39
0,39
0,39
0,78
12,5
ND
6,25
ND
Aquoso
12,5
ND
3,13
3,13
3,13
6,25
25
ND
75
ND
Etanlico
12,5
ND
1,56
1,56
1,56
1,56
12,5
ND
6,25
ND
Aquoso
12,5
ND
3,13 6,25
6,25
6,25
6,25
12,5
50
ND
100
ND
Etanlico
6,25
ND
0,78
6,25
12,5
100
6,25
ND
Aquoso
6,25
ND
1,56
1,56
1,56
3,13
25
ND
100
ND
Cloranfenicol
0,04
0,04
Gentamicina
Syzygium
cumini
Psidium
guajava
Myrciaria
cauliflora
CIM
Nistatina
0,04 0,04
CBM
25
25
50
0,04
0,09
0,04
0,09
0,04
0,04
223
CONCLUSES
Ao comparar os resultados da atividade antibacteriana dos
extratos aquosos e etanlicos utilizando-se o mtodo de difuso
em gar, observou-se que houve diferena significativa entre
as metodologias de difuso em gar analisadas, sendo que o
ensaio de difuso em gar pela tcnica do poo demonstrou
melhor desempenho, j que houve inibio da maioria das
bactrias testadas. Embora esta tenha sido a melhor tcnica
de difuso observada neste estudo, pode-se considerar que o
mtodo de microdiluio em caldo foi a melhor opo para
determinar a atividade antimicrobiana, por fornecer dados
quantitativos, alm de ser mais confivel e econmico para
determinar a atividade antimicrobiana dos extratos vegetais.
AGRADECIMENTOS
Coordenao de Aperfeioamento de Pessoal de Nvel
Superior (CAPES), pela concesso de bolsa de mestrado,
ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e
Tecnolgico (CNPq) e Fundao Araucria pelo financiamento da pesquisa.
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