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1.1.3.4.

Citometria de Flujo
La citometria de flujo (CMF) es una tcnica de anlisis celular
multiparametrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensin de
partculas (generalmente clulas) alineadas y de una en una por delante de un
haz de lser focalizado. La citometra de flujo es una tecnologa (proceso) que
permite la medida simultnea de mltiples caractersticas fsicas de una sola
clula. Estas medidas son realizadas mientras las clulas (partculas) pasan en
fila, a una velocidad de 500 a 4000 clulas por segundo, a travs del aparato de
medida en una corriente de fluido (1).

EL CITOMETRO NECESITA UN SISTEMA


COMBINADO DE :

Fluidos, para introducir y


restringir las clulas para
anlisis

Optica , una fuente de


excitacin y un sistema
coleccin para generar y recoger
las seales luminosas. El
sistema de excitacin consiste
en un lser, lentes y prismas
para dirigir el rayo. El sistema
de coleccin consiste en espejos
pticos y filtros para encaminar determinadas longitudes de onda
hacia detectores pticos determinados.

Electrnica, para convertir las seales pticas en seales


electrnicas proporcionales y digitalizarlas para anlisis
computacional.

SISTEMA HIDRAULICO: Controles neumtico y fluidos para establecer un flujo


laminar que permita a la suspensin celular atravesar la cmara de flujo.
SISTEMA OPTICO: Lser (Argn con luz monocromtica de 488nm , filtros ,
lentes y detectores.
SISTEMA ELECTROINFORMATICO: Convierte la luz dispersa en seales
elctricas y las procesa para su anlisis.

Sistema optico

El impacto de cada clula con el rayo de luz


produce seales que corresponden a
diferentes parmetros de la clula y que son
recogidos por distintos detectores.

clula : Inmunofenotipo.

PARAMETROS
Caractersticas Morfolgicas de la
clula : tamao y complejidad del
citoplasma
Caractersticas antigenicas de la

PARAMETROS FISICOS

Su tamao relativo (forward scatter-FSC)

Su granularidad relativa o complejidad interna ( side scatter


SSC).

FLUORESCENCIA RELATIVA (FL1, FL2, FL3)

Determinacin cuantitativa de caractersticas antignicas,


bioqumicas y biofsicas de clulas individuales (1,2).

OBJETIVOS PRINCIPALES DE
LA CITOMETRIA DE FLUJO
Identificar y enumerar subpoblaciones celulares nicas y definidas.
Seleccionar y separar fsicamente subpoblaciones de clulas deseadas (por
defleccin electrosttica ; esta tecnologa de separacin se llama "electronic cell
sorting")
Medir capacidad funcional de subpoblaciones celulares definidas
COMO SE DETECTAN ESTAS CARACTERISTICAS
El citmetro de flujo detecta como las clulas interactan con un rayo lser
en trminos de cmo la clula :
desva la luz incidente (parmetros FSC y SSC)
emite fluorescencia (parmetros FL1. FL2. FL3)(1).
LAS PROPIEDADES DE DISPERSION DE LA LUZ UNA CELULA NOS DA
INFORMACION ACERCA DEL TAMAO CELULAR Y GRANULARIDAD
SEALES DE DISPERSION
Forward Scatter (FS) :luz dispersada frontalmente en ngulo cnico pequeo (0-10
grados ) coincidente con luz incidente y es proporcional a tamao de la partcula
que produce la dispersin.
La luz es desviada a bajos ngulos entre 1 y 10 grados
Generalmente proporcional al tamao celular
Detectada a lo largo del eje del rayo de luz incidente en direccin delantera
Side Scatter (SSC) : luz dispersada lateralmente es proporcional al la complejidad
de la estructura celular.
Luz es desviada a altos ngulos
Proporcional a la granularidad de la clula y su complejidad
Detectado a 90 grados del eje de luz incidente.
FLUORESCENCIA

Un fluorocromo es una molcula qumica que absorbe la luz a una


determinada longitud de onda (ENERGIA ) energa de excitacin y emite a una
longitud superior (MENOR ENERGIA)
Interacciona con la luz de excitacin procedente de el lser. Se utiliza unido a
anticuerpos especficos (monoclonales ) para antgenos de la clula. La cantidad
de fluorescencia con la cual una clula se tie es proporcional a la cantidad de
sitios de unin.
Cmo se obtiene la luz fluorescente.
Unin de sitios especficos con
anticuerpos marcados con fluorocromos
El fluorocromo absorbe energa del lser
El fluorocromo libera energa absorbida
por :
Vibracin y disipacin del calor.
Emisin de fotones a una mayor
longitud de onda llamada fluorescencia (1,2,3).
REACTIVOS FLUORESCENTES
Marcadores fluorescentes de unin covalente: Isoticianato de Fluoresceina,
Picoeritrina, rodamina, rojo texas, cianinas.
Marcadores fluorescentes de unin no covalente: Hoechst, DAPI, Naranja de
acrimina, yoduro de propidio, rh12.
Los marcadores fluorescentes son sensibles al medio ambiente .
Pequeas molculas orgnicas (FITC, biotina): unin covalente directa con
grupos amino libres en anticuerpos
Protenas fluorescentes (ficoeritrina, aloficocianina): se unen a anticuerpos a
travs de algunos reactivos.

REALIZACIN DE CITOMETRIA DE FLUJO

Se hace en 3 etapas independientes :


Fase pre-citometra: preparacin de los
reactivos, preparacin de las clulas, diseo
del protocolo y coloracin de las clulas con
los reactivos fluorescentes.
Fase de citometra de flujo : involucra el
procesamiento de las clulas marcadas y la
recoleccin de los datos para cada una de las
medidas (parmetros) realizados en cada
clula individual.
Fase de anlisis: anlisis de los datos
recolectados
La mezcla de clulas teidas con
diferentes fluorocromos es forzada a pasar a travs de una aguja creando una
delgada fila de lquido que contiene las clulas. A medida que cada clula pasa en
frente del lser, desva el rayo incidente y las molculas teidas unidas a la clula
van a ser excitadas y emiten luz fluorescente. Tubos fotomultiplicadores detectan
tanto la luz desviada y las emisiones fluorescentes, la informacin es digitalizada
y procesada por el computador. Los resultados son presentados a manera de
histogramas o "dot-plots" (2).
APLICACIONES DE LA CITOMETRIA DE FLUJO

Hematologa : tipificacion y conteo de clulas , reticulocitos y


anlisis de medula sea .

Farmacologa :estudios de cintica celular

Inmunologa :subpoblaciones de linfocitos ,tipaje tisular

Oncologa :Diagnostico y pronostico ,monitores de tratamientos

Microbiologa :diagnostico bacteriano y virico ,estudios de


sensibilidad a los antibiticos

Gentica : Cariotipo y diagnostico de portador y diagnostico


prenatal.

INMUNOTIPIFICACIN
Es el proceso para determinar marcadores expresados en la superficie
celular.
Esta deteccin se hace empleando anticuerpos monoclonales antgeno-especficos
marcados con un fluorocromo dirigidos al marcardor que queremos evaluar.

Para esto, es necesario aislar previamente las clulas a analizar ( por


ejemplo linfocitos, a partir de sangre total, por gradiente de ficoll ). Las clulas
son luego estimuladas a producir los marcadores ponindolas en contacto con un
antgeno capaz de estimular su sntesis.
Posteriormente estas son incubadas con una sustancia denominada brefeldina
A (BFA) cuya funcin es impedir que las clulas expulsen las citoquinas que estn
sintetizando, haciendo entonces que se acumulen en su interior.Despus las
clulas son fijadas, permeabilizadas y finalmente marcadas con los anticuerpos
especficos. Una vez realizado este ltimo procedimiento, las clulas estn listas
para ser ledas en el citmetro (2, 5).
ENSAYO DE CAPTURA DE SECRECION
Se ha utilizado para cuantificar la secrecin de
citoquinas a partir de linfocitos T
El procedimiento utilizado es :
Encapsulacin de la clula en una microgota de agarosa con biotina
Incorporacin de un anticuerpo dirigido contra la citoquina que queremos
detectar
Unin no especfica y retencin del anticuerpo en la matriz de agarosa
Incorporacin de un segundo anticuerpo que reconoce la unin antgenoanticuerpo ya formada. Este segundo anticuerpo est marcado con un
fluorocromo
Las microgotas se analizan en el citmetro, midiendo la fluorescencia emitida
por el fluorocromo, que es proporcional a la unin antgeno-anticuerpo (6).
DETERMINACION DEL CONTENIDO CELULAR DE DNA
Una suspensin de clulas es coloreada con un colorante fluorescente que
se une estequiomtricamente con el DNA. La cantidad de colorante unido es
entonces proporcional a la cantidad de DNA. Las clulas coloreadas se introducen
entonces en el citmetro y la luz fluorescente emitida es proporcionarle al
contenido de DNA de cada clula.
Este anlisis nos da informacin adems sobre la distribucin de las clula
en las diferentes fases del ciclo celular (G1, S, G2 o M). Sin embargo no es posible
diferenciar G2 y M ya que en las dos se encuentra el mismo contenido de DNA. Se
han desarrollado modelos matemticos para establecer el porcentaje de clulas
que se encuentran en cada fase. Esta informacin puede complementarse
utilizando antgenos cuya expresin est restringida a un momento del ciclo
celular en particular. Por ejemplo en las fases G1 y S tempranas hay un
incremento en la excrecin del antgeno celular nuclear proliferante (PCNA) : por
otra parte el antgeno Ki-67 es una protena nuclear que se incrementa
linealmente a travs de todo el ciclo celular alcanzando la concentracin mxima

en G2 y M. Al marcar ests protenas con anticuerpos especficos unidos a un


fluorocromo, podemos entonces establecer con mayor precisin la fase del ciclo
celular en que se encuentra la clula.
La medida del contenido de DNA tambin ha sido utilizada para determinar
el grado de aploida de clulas malignas y el porcentaje de estas que se
encuentran en fase S. Algunos autores sugieren que esta informacin es til para
conocer el tamao del tumor, el estado nodal y el estado de expresin de
marcadores para ayudar a establecer el pronstico del tumor
(5,7).
APOPTOSIS
La apoptosis es la muerte celular programada. Hay
varias enzimas implicadas en este proceso celular. Dichas
enzimas pueden ser determinadas por citometra de flujo al
ser unidas a anticuerpos marcados con fluorocromos (por
ejemplo la dipeptidilpeptidasa, calpaina, aminopeptidasa y catepsina D , las dos
ltimas implicadas en el proceso de apoptosis inducido por citoquinas y
expresadas en la superficie celular) (7).
FAGOCITOSIS
Marcando bacterias con un colorante fluorescente, se puede
analizar el proceso de facocitosis de estas por parte de macrfagos y
neutrfilos (7).
VENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
Anlisis de un nmero estadsticamente significativo de clulas ( 1000 a ms
de 100.000 clulas).
Mltiples marcajes de una sola clula.
Anlisis de alto numero de partculas en corto tiempo (5.000 eventos /seg. ).
Alta sensibilidad y objetividad.
Medidas separadas de cada clula (no slo el promedio).
Medidas cuantitativas : discriminacin de las clulas segn la cantidad de
marcador.
Mltiples parmetros : define subpoblaciones complejas.
Miles de clulas por segundo (1).
DESVENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
Poca informacin morfolgica de la clula
No proporciona informacin de la localizacin celular en un tejido
Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones de
clulas / hora)
Necesita suspensin de clulas individuales (1).
Costos de la tecnologa

Mtodo destructivo.
Incapacidad de visualizar las clulas que se analizan.