TCNICAS DE GENTICA MOLECULAR

INTEGRANTES

CORPORACION UNIVERSITARIA RAFAEL NUEZ

FACULTAD DE MEDICINA
GENETICA MDICA
CARTAGENA
2015

La gentica molecular es el campo de la gentica que estudia la estructura y la funcin de

los genes a nivel molecular. La gentica molecular emplea los mtodos de la gentica y la
biologa molecular con el objetivo de comprender las mutaciones genticas que pueden
causar ciertos tipos de enfermedades, determinar los patrones de descendencia y por
tanto, la correcta clasificacin cientfica de los organismos, realizar terapia gentica entre
otras aplicaciones. En las tcnicas utilizadas por la gentica molecular encontramos como
las ms utilizadas a la reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR, la
electroforesis, las trasferencias y los microarreglos, que describiremos a continuacin:

PCR O REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA

Es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis. Consiste en la
amplificacin in vitro de un fragmento de ADN especfico dado que su objetivo es obtener
un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en
teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde para replicarlo
masivamente.
Aplicacin
Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN, de ah su utilidad y es que tras la
amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad, virus o
bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas o cadveres o hacer
investigacin cientfica sobre el ADN amplificado.
Fundamento
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar
hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas
para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a
continuacin, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas
nuevamente.

Tipos de PCR:

PCR anidada: Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una

amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con
cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir,
cuando tenemos el primer amplicn se pueden unir los cebadores y se hace de
nuevo una amplificacin dentro del amplicn inicial.

PCR in situ: consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o

clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de
amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la
tcnica de PCR in situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y luego
deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de ADN/ARN.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): Es una variante de la PCR en la que

usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa
inversa (como Tth) para realizar la sntesis de un ADN complementario al ARN
(ADNc).

Componen necesarios para la tcnica de PCR

Para realizar la tcnica se necesitan:

Los 4 desoxirribonucletidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo

ADN.

Dos cebadores o iniciadores, que son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta
nucletidos, normalmente de dieciocho a veintids, que permiten que la polimerasa
inicie la reaccin.

Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2.

Iones monovalentes, como el potasio.

Una

solucin tampn o buffer que

mantiene

el pH adecuado

para

el

funcionamiento de la ADN polimerasa.

ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima

alrededor de 70 C (la ms comn es la polimerasa Taq).

ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.

Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de

las etapas que conforman un ciclo.

Pasos para realizar la tcnica:

Una vez tenemos todos los componentes en nuestro tubo de reaccin (Figura 1), tenemos
que favorecer de alguna forma que ocurra la sntesis de ADN. Para ello, lo primero que
debemos hacer es facilitar la desnaturalizacin del ADN. A continuacin, permitir el
alineamiento de los primers (apareamiento con su regin complementaria) y, por ltimo,
facilitar que la polimerasa lleve a cabo la sntesis de ADN utilizando como cebadores los
extremos 3 de los primers utilizados. As, nuestra reaccin constara de 3 pasos:
1. Desnaturalizacin. Se conseguira elevando la temperatura del tubo de reaccin
hasta 94oC, durante, por ejemplo, un minuto (este tiempo puede variar entre minuto y
2 minutos)
2. Alineamiento. Se desciende la temperatura hasta una temperatura que puede oscilar
entre 40 oC y 60 oC (dependiendo de diversos parmetros como la secuencia de los
primers, su especificidad,...). La duracin de este paso puede oscilar entre minuto y 2
minutos.
3. Extensin. Se vuelve a aumentar la temperatura hasta los 72 oC y se deja actuar a la
Taq polimerasa durante 1 2 minutos.
Estos tres pasos constituyen un ciclo. La repeticin de este ciclo unas 40 veces, por
ejemplo, permite obtener, como resultado de un experimento de amplificacin, millones de
copias del fragmento de inters.
Todo esto, por supuesto, se realiza de forma automatizada. Para ello, los tubos de
reaccin se introducen en un termociclador que de forma automtica realiza los 40 ciclos
de amplificacin.

ELECTROFORESIS
La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de
stas en un campo elctrico.1 La separacin puede realizarse sobre la superficie hidratada
de un soporte slido (p. ej., electroforesis en papel o en acetato de celulosa), a travs de
una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolucin (electroforesis libre).
Dependiendo de la tcnica que se use, la separacin obedece en distinta medida a la
carga elctrica de las molculas y a su masa.
Dentro de los tipos de electroforesis la ms utilizada es la electroforesis de gel de
agarosa.
Uso de la tcnica
Mediante la electroforesis podemos separar fragmentos de ADN y ARN en funcin de su
tamao, visualizarlos mediante una sencilla tincin, y de esta forma determinar el
contenido de cidos nucleicos de una muestra, teniendo una estimacin de su
concentracin y grado de entereza. Podemos adems extraer del gel los fragmentos de
ADN que sean de inters, para posteriormente utilizarlos en diferentes aplicaciones.
Protocolo Electroforesis de ADN en gel de agarosa
Equipo

Cmara

horizontal

conectar

de

electroforesis con los accesorios

correspondientes

(molde

para

la

fuente

de

alimentacin)
Fuente de alimentacin o de
poder

hacer el gel, peine, cables para

Transiluminador (fuente de luz

ultravioleta)

Equipo fotogrfico que permita

tomar fotos del gel

Material

Micropipetas
Puntas para micropipeta
Tubos
tipo
eppendorf
Herramientas

Un matraz, probetas y vasos de

precipitados para la preparacin

34

moleculares

aplicadas en ecologa

de soluciones
Esptulas
Guantes impermeables para el
manejo del bromuro de etidio

Reactivos

Agarosa
Tris

(hidroximetil)-1,3-propanodiol)
cido actico glacial
EDTA(cido

base

(2-amino-2-

ilendiaminotetraactico)

cido brico
NaOH
Sacarosa
Glicerol (CAS N 56-81-5)
Azul de bromofenol
Xileno cianol
Bromuro de etidio

Soluciones y buffers: Como buffer de electroforesis y para la preparacin del gel

puede utilizarse opcionalmente TAE (Tris-Acetato EDTA) o TBE (Tris-Borato
EDTA).

Mtodo

1. Preparacin del gel de agarosa

Pesar la cantidad de agarosa

necesaria

para

obtener

la

concentracin deseada (ver Tabla

Aadir la agarosa al buffer (TAE

1x o TBE 0.5x) en un matraz.

Calentar la mezcla en un horno
de microondas hasta que se

1) en funcin del volumen de gel.

observe que toda la agarosa se

que se va a hacer el gel sellando

ha fundido.
Dejar enfriar

los bordes con cinta masking, o

la

solucin

de

colocndolo

el

dispositivo

previsto para ello, y colocando el

de unos 50 C (Nota: si se opta

peine en la posicin deseada.

Verter
cuidadosamente

por aadir el BrEt al gel debe

en

agarosa hasta una temperatura

la

realizarse en este momento, a

solucin de agarosa sobre el

una concentracin final de 0.5

molde

g/ml).
Mientras la solucin de agarosa

solidifique durante al menos 30

nivelado

dejar

que

min.

se enfra, preparar el molde en el

2. Preparacin de las muestras

Mezclar tanto las muestras de ADN como el marcador de tamao con 0.2
volmenes del buffer de carga 6x. El volumen total estar determinado por el
tamao de los pocillos, habitualmente 15-30 l.

3. Carga de las muestras y corrida del gel

Una vez que el gel ha solidificado

calentar a 65C las muestras

retirar el sellado de los bordes y

durante 3-5 min y enfriarlas en

colocar el molde con el gel en la

cmara de electroforesis.
Aadir buffer de electroforesis

hielo antes de cargarlas.

Conectar los cables a la fuente
alimentacin y aplicar un voltaje

(TAE 1x o TBE 0.5x) hasta que

de

cubra el gel unos 3-5 mm.

Retirar cuidadosamente el peine

acuerdo a la distancia entre los

para

es muy variable dependiendo de

que

queden

libres

los

pocillos para las muestras.

Cargar en los pocillos

las

20-150

(1-5

V/cm

de

electrodos). El ajuste del voltaje

la cmara y de los tamaos que
se

muestras que se prepararon en el

pretenden

separar,

se

recomienda voltajes no muy altos

paso 7. Nota: Dependiendo del

para tamaos muy grandes del

tipo de muestra y del marcador,

ADN. Nota: Debe tenerse en

frecuentemente es conveniente

cuenta que el ADN migra hacia el

nodo,

por

debe

a una distancia del borde de

la

aproximadamente un 25% de la

orientacin del gel y de los

longitud total del gel. En ese

cables.
Correr el

momento

disponerse

lo

que

correctamente

gel

hasta

que

el

debe

detenerse

la

electroforesis.

colorante azul de bromofenol est

4.
5.
6.
7. Tincin del gel y visualizacin del ADN

Si no se aadi el BrEt al gel,

ste

debe

teirse

una

Colocar

el

gel

sobre

un

vez

transiluminador y encender la

finalizada la electroforesis. Para

lmpara de luz ultravioleta (

ello se saca el gel de su molde y

300 nm), el ADN se visualizar

se sumerge en una solucin de

como

BrEt (0.5 g/ml) durante al menos

15 min. Nota: Ambas formas de

tincin

rinden

de

color

anaranjado.
(Opcional) Si hay bandas de
tamao

resultados

bandas

pequeo

que

no

se

similares, pero se recomienda la

visualizan bien puede hacerse

tincin

una etapa de desteido con H2O

una

vez

finalizada

la

electroforesis para mantener el

molde, peine y cmara libres de

o 1 mM MgSO4 durante 20 min.

Fotografiar el gel con el sistema
fotogrfico disponible.

BrEt.

MICROARREGLO DE ADN

Un microarreglo de ADN (tambin denominado DNA chip, oligonucleotide DNA

chip o gene chip) consiste en mltiples fragmentos de ADN complementario (cada
uno de los cuales representa un gen diferente) adheridos a un soporte fsico
concreto (vidrio, plstico, silicona, etc.) y agrupados de manera ordenada (filas y
columnas) segn su funcin (receptores, hormonas, factores de transcripcin,
citocinas, etc.

Utilidad de un microarreglo de ADN

Un microarreglo de ADN sirve para determinar la expresin gen- tica completa de

un tejido en un momento determinado. Esta foto gentica transversal de un tejido
concreto se denomina transcriptoma. El transcriptoma, al contrario que el
genoma (conjunto de todos los genes existentes en una clula), cambia

continuamente en respuesta a cambios en las condiciones microambientales

celulares o tisulares (temperatura, pH, PO2 , citocinas, hormonas, etc.). Por tanto,
la interpretacin del transcriptoma objeto de estudio requiere necesariamente de
su comparacin con el de un tejido control. El microarreglo de ADN permite esta
comparacin, que se conoce con el nombre de differential display.

Metodologa del microarreglo de ADN

El procedimiento para comparar el transcriptoma del tejido o cultivo celular objeto

de estudio con el transcriptoma control es relativamente simple (Fig. 1). En primer
lugar, se debe aislar el ARNm de ambos tejidos y, a partir de cada uno de ellos,
obtener sus correspondientes ADNc. Estas molculas de ADNc deben marcarse
con un compuesto fluorescente, que ser diferente en los tejidos objeto de estudio
y el control. En general, el ADNc del tejido objeto de estudio se marca con el
compuesto fluorescente Cy3 (que emite fluorescencia a una longitud de onda de
588 nm, lo que en el espectro correspondera a un color cercano al rojo) y el del
tejido control con el compuesto Cy5 (que emite fluorescencia a una longitud de
onda de 680 nm, lo que en el espectro correspondera a un color entre naranja y
amarillo). A continuacin, se mezclan ambos ADNc marcados y se incuban juntos
en el microarreglo de ADN, para que cada especie de ADNc hibride (se una)
especficamente a su ADNc complementario inmovilizado en el microarreglo de
ADN. Cuanto mayor sea la hibridacin de una especie determinada de ADNc
marcado con el ADNc del microarreglo de ADN, mayor ser la expresin tisular
original del ARNm correspondiente (expresoma). Pero, cmo se evala la
cantidad de hibridacin existente?, Se calcula determinando la longitud de onda
emitida por cada uno de los dos ADNc incubados. Para ello, el sistema lector del
ADN microarreglo de ADN asigna un cdigo informtico de colores a la cantidad
de fluorescencia emitida. Si hay mayor hibridacin del ADNc de la condicin
patolgica (roja), el componente rojo de la emisin predominar, y viceversa,
cuando sea mayor la hibridacin del ADNc de predomine (Fig. 1). Cuando la
hibridacin del ADNc de los dos tejidos estudiados sea similar, el programa
informtico asignar un cdigo de color verde (Fig. 1). Hay que tener en cuenta
que esta diferencia de emisin debe evaluarse en cada uno de los pocillos del

microarreglo de ADN (es decir, para cada uno de los ADNc genes evaluados). De
esta manera, se compara la expresin de todos los genes representados en el
microarreglo de ADN (hasta 40 000) en el tejido estudio frente al tejido control
(differential display).

LA TRANSFERENCIA GNICA

Estrictamente hablando, la transferencia gnica es la incorporacin, en una clula,

de un gen o fragmento de material gentico de manera artificial. Este
procedimiento se puede realizar de diferentes formas; entre los mtodos de
aplicacin, debemos distinguir la transferencia ex vivo cuando los genes se
transfieren a clulas en cultivo extradas del individuo y son reincorporadas
posteriormente al organismo y la transferencia in vivo cuando los genes se

transfieren directamente al sujeto de estudio, por vas intravenosa, intramuscular o

intradrmica, por ejemplo. Una variante de esta ltima modalidad es la
transferencia in situ si el tratamiento es realizado directamente en un rgano en
particular. Desde un punto de vista terico se pueden elaborar distintas estrategias
de acuerdo con los objetivos que se persigan. La transferencia ms comn y ms
simple consiste en la insercin gnica, es decir, la introduccin en las clulas
tratadas de una copia de gen normal. Esta tcnica tambin es conocida como
terapia de aumento gnico (TAG) por el efecto que produce. En la prctica, son
muchas las dificultades para aplicar con xito la mayor parte de estas estrategias y
los resultados obtenidos hasta ahora han sido mucho ms modestos de lo que en
un principio se esperaba. El procedimiento estndar ms utilizado incluye, de
modo muy esquemtico, los siguientes pasos:

1) Identificacin, aislamiento y amplificacin del gen que va a ser utilizado para la

transferencia.

2) extraccin y cultivo in vitro de las clulas de inters.

3) transferencia del gen al interior de las clulas mediante un vector.

El gen transferido debe llevar alguna secuencia promotora que permita su

expresin y debe tambin ir acompaado de algn marcador que permita
identificar las clulas a las que se ha incorporado. A continuacin se transfieren las
clulas seleccionadas con el gen incorporado al sujeto en espera de que ejerzan la
funcin fisiolgica esperada. Uno de los pasos cruciales que mayores problemas
ha planteado hasta ahora ha sido la seleccin del vector adecuado para la
transferencia gnica. Los principales tipos de vectores son los virus, los liposomas,
los conjugados moleculares y el DNA desnudo.

BIBLIOGRAFA

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