Вы находитесь на странице: 1из 12

1RA PRCTICA BIOLOGIA CELULAR

EL MICROSCOPIO
El ojo humano no logra distinguir objetos de menos de 50 micras de dimetro ni consigue resolver dos
lneas separadas por menos de 100 micras (es decir, las ve como una sola lnea).
Para observar elementos tan pequeos es necesario disponer de lentes de aumento. Estas lentes se
conocen desde tiempos de Arqumedes, pero la ptica como disciplina se comenz a desarrollar en el
siglo XIII con el monje franciscano Roger Bacon.
Anton Van Leeuwenhoek (Holanda, 1632-1723), un pulidor de lentes aficionado, logr fabricar lentes lo
suficientemente poderosas como para observar bacterias, hongos y protozoos, a los que llam
"animlculos".
El primer microscopio compuesto fue desarrollado por Robert Hooke. A partir de ste, los avances
tecnolgicos permitieron llegar a los modernos microscopios de nuestro tiempo, los que existen de varios
tipos y son usados con diferentes fines.

TIPOS DE MICROSCOPIOS
MICROSCOPIOS PTICOS
Microscopio de campo claro: es el microscopio ptico compuesto utilizado en la mayora de los
laboratorios. Para formar una imagen a partir de un corte histolgico usa luz visible, por esto la muestra
debe ser lo bastante fina como para que los aces de luz puedan atravesarla. Tambin se usan mtodos
de tincin, segn las necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la imagen.
Microscopio de contraste de fase: posibilita la observacin de muestras sin colorear, por lo que
resulta til para estudiar especmenes vivos.
Microscopio de interferencia: es una modificacin del anterior que permite la cuantificacin de masa
en los tejidos.
Microscopio de interferencia diferencial: tambin es una modificacin del microscopio de contraste
de fase, que permite estudiar las propiedades de superficie de las clulas.
Microscopio de fluorescencia: permite la observacin de estructuras fluorescentes, ya sean naturales
o artificiales.
Microscopio de barrido confocal: se usa para estudiar la estructura de sustancias biolgicas. Combina
partes de un microscopio de campo claro con equipo fluorescente y un sistema de barrido que emplea un
rayo lser. A travs de una computadora se reconstruye la imagen tomada por planos, a una imagen
tridimensional.
Microscopio de luz ultravioleta: sus resultados se registran fotogrficamente ya que la luz U.V. no es
visible y daa la retina. Se utiliza en la deteccin de cidos nucleicos, que absorben esta luz.
Microscopio de luz polarizada: es una modificacin del microscopio de campo claro. Debido al
fenmeno de birrefringencia se pueden observar sustancias cristalinas y molculas fibrosas.

MICROSCOPIOS ELECTRNICOS
Microscopio electrnico de transmisin (MET): utiliza un haz de electrones para producir la imagen.
Permite la observacin de detalles a escala macromolecular.

Microscopio electrnico de barrido (MEB): en este caso el haz de electrones no atraviesa la


muestra, sino que choca contra su superficie. Permite una gran magnificacin de las imgenes.

EL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO


Es el principal medio que utilizaremos a lo largo de toda la materia para observar la morfologa de los
tejidos a estudiar, por lo que debemos conocer en detalle sus partes y el funcionamiento de cada una de
ellas.
Sistema Mecnico
Pie
Vastgo o columna
Tornillos de ajuste macromtrico
Micromtrico
Tubo
Platina
Subplatina
Sistema ptico

De Observacin Ocular
Objetivo
De iluminacin condensador
Espejo
Fuente de luz

SISTEMA MECNICO
Este sistema sostiene al sistema ptico y aloja los elementos necesarios para la iluminacin y enfoque
del preparado.
Pie: brinda apoyo y estabilidad al aparato.
Vstago: soporta la platina, tubo y tornillos de ajuste macro y micromtrico.
Tornillo de Ajuste: provocan el desplazamiento del tubo o la platina en sentido vertical, lo que permite
el enfoque.
Tubo: en su extremo superior se halla el ocular, y en el inferior el objetivo. Se trata de un cilindro
metlico cuyo interior se encuentra pintado de negro, lo que evita la reflexin de la luz. Normalmente
tiene una longitud de 170 mm.
Platina: es una plataforma horizontal sobre la cual se coloca y sujeta el preparado a observar, tiene un
orificio central que permite el paso de la luz y un venier que posibilita la relocalizacin de los detalles de
inters.
Subplatina: sostiene al condenador y se ubica por debajo de la platina.
SISTEMA PTICO
Se compone de un sistema ptico de observacin y un sistema ptico de iluminacin; el primero consta
de:
Objetivo: est formado por un sistema de pequeas lentes ubicadas muy cercanas una de la otra, la
que se halla en el extremo distal del objetivo se denomina lente frontal. Los objetivos pueden ser
objetivos a seco (no hay ninguna sustancia interpuesta entre la lente frontal y el preparado), u objetivos
de inmersin (entre la lente frontal y el preparado se coloca una sustancia cuyo ndice de refraccin es
muy similar al del vidrio).

Ocular: es un tubo cilndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en cada extremo, la superior
se denomina lente ocular y la inferior lente colectora.
El sistema ptico de iluminacin consta de:
Condensador: concentra el haz de luz sobre el plano del objeto que se encuentra en la platina. Debajo
de l se encuentra el diafragma iris que regula la cantidad de luz que llega al condensador.
Fuente de Luz: es una lmpara que est ubicada en la parte inferior del aparato, en caso de no
poseerla debe ubicarse una fuente de luz externa (lmpara incandescente comn) aproximadamente a
30 cm. del espejo.

CARACTERISTICAS DE LOS OBJETIVOS:


ESCALA DE REPRODUCCIN: relacin lineal que existe entre el tamao del objeto y su imagen, por
ejemplo, 4:1, 40:1, 65:1, etc.
PODER DEFINIDOR: es la capacidad del objetivo de formar imgenes de contornos ntidos.
LMITE DE RESOLUCIN: es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan
visualizarse por separado.
PODER DE RESOLUCIN: es la capacidad de mostrar la imagen en sus detalles ms finos. Est en
relacin inversa con el lmite de resolucin.
PODER DE PENETRACIN: es la propiedad de permitir la observacin simultnea de varios planos del
preparado. Es inversamente proporcional a la escala de reproduccin o aumento.
DISTANCIA FRONTAL: es la distancia del lente frontal al preparado colocado en la platina, cuando
est enfocado. Disminuye cuando aumenta la escala de reproduccin del objetivo.
AUMENTO TOTAL: Debemos notar que el ocular tambin tiene un aumento, por lo tanto el aumento
total de la imagen que observamos es el producto entre el aumento del objetivo y el del ocular. Ejemplo:
si tenemos colocado el objetivo cuya escala de reproduccin es 40:1 y nuestro ocular tiene un aumento
de 10x, entonces el aumento total ser 40 x 10 = 400.
USO CORRECTO DEL MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO
1. Lo primero es conseguir una buena fuente de iluminacin. Si la misma est incorporada al
microscopio, enfocamos con el objetivo de menor aumento, cerramos el diafragma de campo y movemos
el condensador hacia arriba y hacia abajo hasta que el contorno del diafragma se vea ntido. El
diafragma se centra con los tornillos que lo sujetan a la subplatina. Luego se quita el ocular y se verifica
que la luz est centrada. A medida que se abre el diafragma su contorno desaparece del campo
observado. Si la fuente de luz es externa, se quita el ocular, se coloca el objetivo de menor aumento, y
se mueve el espejo hasta centrar la luz. Recordemos que si tenemos condensador debemos usar la cara
plana del espejo.
2. Volvemos a colocar el ocular y, siempre con el objetivo de menor aumento, colocamos el preparado
sobre la platina. Utilizando el tornillo el ajuste macromtrico enfocamos lo ms claramente posible.
3. El condensador debe estar en la posicin ms alta y el diafragma abierto. Esto si el preparado est
coloreado, sino el diafragma debe estar cerrado.
4. Con el tornillo micromtrico se logra el enfoque fino segn nuestra visin.
5. Modificamos la apertura del diafragma hasta obtener la cantidad de luz deseada.
6. Luego de estudiado el preparado con este objetivo, podemos pasar gradualmente a objetivos de
mayor aumento, corrigiendo la apertura del diafragma para cada uno de ellos.

7. En caso de utilizar el objetivo de inmersin, se coloca una pequea gota de aceite sinttico sobre el
preparado y luego se enfoca con sumo cuidado, recordando que este objetivo es el de menor distancia
frontal y corremos el riesgo de estropear el preparado y la lente frontal. Al finalizar el uso de este
objetivo se deben retirar los restos de aceite con un papel de carilina o una gasa embebida en xilol o
solvente especial para limpieza de lentes, nunca se debe dejar sucio el objetivo.
8. Cuando se termina de utilizar el microscopio se lo debe dejar de la siguiente manera:
- fuente de luz apagada
- condensador al tope
- diafragma abierto
- platina alta
- objetivo de menor aumento en posicin
- todas las lentes limpias.

2DA PRCTICA BIOLOGIA CELULAR

INTRODUCCIN A LAS TCNICAS HISTOLGICAS


Se define tcnica histolgica al conjunto de operaciones a que se somete una
materia organizada, a fin de posibilitar su estudio al microscopio.
El examen al microscopio se hace generalmente por luz transmitida, lo que significa
que la luz debe "atravesar" el objeto a examinar para llegar, despus de haber
pasado por las distintas lentes del aparato, a impresionar a nuestro rgano visual.
Por esa causa, debe ser reducido a lminas muy delgadas y transparentes, las
cuales lograremos efectuando una serie de operaciones que sern descriptas ms
adelante.
OBTENCIN DE LA PIEZA
El material a utilizar puede ser extrado de los diversos animales de laboratorio, o
bien puede tratarse de material humano. Entre los animales de observacin se
eligen aquellos que por su semejanza con el ser humano pueden sustituirlo sin
grandes diferencias, y cuya obtencin y crianza puede ser fcilmente efectuada en
el laboratorio.
Fases en la obtencin de material animal:
- Muerte del animal: podemos producirla valindonos de un traumatismo brusco, o
por la intoxicacin a causa de una dosis exagerada de narctico.
- Extraccin de los rganos: conociendo la anatoma del animal, debemos dirigirnos
directamente a los rganos que nos interesan estudiar. En el caso de que estos
sean varios, es conveniente extraer primero los que ms fcilmente se
descomponen, estos son el pncreas y la porcin inferior del tubo digestivo.
- Reduccin a piezas: teniendo en cuenta que para el tamao de las piezas
debemos considerar muy especialmente las cualidades del fijador a usar,
hablaremos de este asunto cuando tratemos la fijacin.
Obtencin de material humano:
El hombre no es sujeto de experimentacin, esta verdad indiscutible hace que slo
en casos excepcionales se pueda obtener material humano en condiciones de ser
estudiado histolgicamente. De tres fuentes puede provenir el material humano: las
necropsias, las biopsias y las piezas operadas. De stas, slo la primera puede
darnos material normal; las dos ltimas proporcionarn tejidos patolgicos.
- Necropsias: son las piezas que se obtienen de un cadver. Para histologa normal
es necesario que se trate de un cadver fresco y que no haya sido atacado por
ninguna lesin, por lo menos el rgano que se quiere estudiar.
- Biopsias: son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto
de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnstico histopatolgico.

- Piezas operadas: los tejidos que han sido extrados de las intervenciones
quirrgicas, generalmente tumores u rganos inflamados, tambin pueden darnos
material de investigacin pero, como en el caso anterior, slo servirn para
anatoma patolgica.
FIJACIN
La fijacin tiene por objeto matar las clulas y conservarlas, hasta donde sea
posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Por lo tanto es un
mtodo histolgico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la
estructura morfolgica y qumica de las clulas y tejidos al estado vivo y que
permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloracin o de
identificacin que facilitan el completo conocimiento de su constitucin ntima.

Se llaman fijadores a las sustancias qumicas o a los agentes fsicos que se utilizan
para tal fin.
Cualidades que debe tener un fijador:
1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes de que aparezcan los
fenmenos agnicos o post-mortem (autlisis, desintegracin, etc.).
2. Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las
capas profundas de la pieza a fijar.
3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.
4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su
observacin ulterior (ejecucin de cortes, coloracin, etc.).
5. Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante la fijacin o despus
de ella.
6. No provocar o impedir la produccin de estructuras artificiales.
7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.
Manera de actuar de los fijadores
Vara con la composicin o naturaleza de los mismos: coagulando las protenas sin
combinarse con ellas (alcohol, cido pcrico, yodo, calor), formando combinaciones
qumicas con las sustancias orgnicas (cido crmico y sus sales), o reducindose
en contacto con las mismas y originando en su seno un precipitado sumamente fino
(cido smico, bicloruro de mercurio, cloruro de oro).
La mayor parte de los fijadores actan como oxidantes, favoreciendo as la
coloracin ulterior de los tejidos (recurdese que stos, en su mayora, son
reductores que muchos colorantes se transforman en leucobases incoloras al
combinar una molcula de hidrgeno con su cromforo).
Fijadores qumicos
Son los ms utilizados; pueden ser fijadores simples, constituidos por una sola
sustancia qumica, y fijadores compuestos o mezclas fijadoras cuando varias
sustancias intervienen en su constitucin.
Dra. Julissa lvarez Muoz
FIJADORES SIMPLES:

a) Formol al 10%, es el ms usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos


en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de
fijar rganos o tejidos para estudios histolgicos topogrficos.
b) Alcohol etlico absoluto o de 96%, se usa generalmente en microqumica.
c) Alcohol metlico, se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre,
mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc.).
d) cido smico al 1 2%, es poco penetrante pero enrgico, conserva muy bien
estructuras celulares.
e) Bicromato de potasio al 3-5%.
FIJADORES COMPUESTOS:
En su composicin intervienen un nmero variable de fijadores simples
racionalmente elegidos con el fin de completar la accin de cada uno de ellos o
atenuar sus defectos.
a) Lquido de Fleming, mezcla cromo-osmio-actica.
b) Lquido de Zenker, mezcla bicromato-sublimado-actica.
c) Lquido de Helly, mezcla Zenker-formol.
d) Lquido de Bouin, mezcla picro-formos-actica.
e) Liquido de Duboscq-Brasil, o Bouin alcohlico.
FIJADORES FSICOS:
1. Desecacin.
2. Calor seco.
3. Calor hmedo.
4. Fro.
5. Congelacin y desecacin.
DESHIDRATACIN E INCLUSIN EN PARAFINA
Deshidratacin
Las piezas al ser retiradas del fijador, o despus de haberlas lavado, estn
embebidas en agua; impidiendo que sean penetradas por la parafina. Por lo tanto,
en primer lugar, debemos deshidratar los tejidos sumergindolos en lquidos
anhidros, vidos de agua. Para evitar alteraciones provocadas por una
deshidratacin brusca, se aconseja proceder escalonadamente utilizando,
preferentemente, alcohol etlico de graduacin creciente.
Impregnacin por un disolvente de la parafina (aclaracin)

Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente, xilol o toluol


(este ltimo es el que nosotros utilizamos). Al agregar el toluol, no debe aparecer
ninguna turbidez. Si se pone blanco-lechoso es que la deshidratacin no ha sido
bien lograda y debemos repetir el bao de alcohol absoluto cerciorndonos que
realmente lo sea: una gota de alcohol agregada a unos ml de toluol no debe
enturbiarlo.
Penetracin de la parafina
Se sumergen las piezas en parafina (56-58 de punto de fusin), mantenida lquida
en la estufa a no ms de 62C. Despus de 1 a 2 horas se renueva la parafina.
Inclusin definitiva o formacin del bloque
En moldes de papel o de metal ad-hoc (barras de Leuckart) se vierte la parafina
fundida, del mismo punto de fusin de la que ha servido para la penetracin. Se
colocan las piezas orientndolas y luego se pone el molde en heladera.
A los 15-30 minutos la parafina se habr solidificado completamente, recortamos
los bloques en forma de pirmide cuadrangular truncada, lo adherimos a un taquito
de madera mediante una esptula calentada con la llama de un mechero y ya
podemos realizar los cortes con el micrtomo.

OBTENCIN DE CORTES
El objeto de la inclusin que hemos descrito anteriormente es hacer posible la
reduccin del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso
de la luz para examinarlo al microscopio. Los micrtomos son instrumentos de gran
precisin que nos proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable. Los
cortes ms corrientes son los de 4-6 micrones.
Consideraremos cuatro tipos de micrtomos: el de deslizamiento, el tipo Minot, el
de congelacin, y el cristato o critomo.
- Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza
por unas guas especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos
tornillos.
- Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta
a una platina, sta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela.
Permite obtener cortes seriados en forma de cinta.

- Tipo congelacin: se parece al de deslizamiento, pero la cuchilla o navaja, en


lugar de deslizarse, gira sobre un eje. Por otra parte, el aparato se caracteriza por
tener un sistema de congelacin colocado debajo de la platina que utiliza la
expansin brusca del anhdrido carbnico contenido en un cilindro con el cual se
comunica.
- Cristato: consta de un micrtomo tipo Minot incluido en una cmara de
congelacin. El volante de inercia que controla la realizacin del corte permanece
en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance estn situados

dentro de la cmara fra (normalmente a -20 C). Pese a la disposicin horizontal


de la cuchilla, la obtencin de secciones seriadas es posible gracias a la existencia
de un sistema anti-enrollamiento que obliga al corte a deslizarse sobre la superficie
de la cuchilla. En los modelos ms modernos es posible optar por el corte manual o
motorizado, as como enfriar rpidamente la muestra a -60 C gracias a la
existencia de una placa de congelacin instantnea. Frente al micrtomo
convencional de congelacin, el cristato posee la gran ventaja de permitir la
obtencin de cortes mucho ms delgados (por lo general de 4 m y, en manos
experimentadas, hasta 2 m).
Los cortes de parafina se extienden, al obtenerlos del micrtomo, en agua tibia
contenida en un cristalizador. En ese mismo agua se introducen portaobjetos,
previamente desengrasados, cubiertos con una capa de adhesivo de Mayer y, con la
ayuda de una aguja histolgica, se colocan los cortes sobre el portaobjetos y a
continuacin se lo levanta.
COLORACIN
Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloracin.
Colorantes: reciben esta denominacin las sustancias que pueden conferir color a
otros cuerpos.
Coloracin: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teido por una sustancia
colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al
preparar la solucin colorante.
Clasificacin de los colorantes:
Segn su origen se clasifican en:
COLORANTES NATURALES:
- Animales (carmn)
- Vegetales (hematoxilina, orcena, azafrn)
COLORANTES ARTIFICIALES O SINTTICOS (COLORES DE ANILINA):
- cidos: sales cuya base es incolora y su cido es coloreado (eosina o eosinato de
sodio). Son colorantes citoplasmticos.
- Bsicos: sales cuya base es coloreada y el cido es incoloro (azul de metileno o
clorhidrato de azul de metileno). Son colorantes nucleares.
- Neutros: sales en las que tanto el cido como la base son coloreados. Tien el
ncleo de un color y el citoplasma de otro.
- Indiferentes: no forman sales. Tien aquellas sustancias que tienen un poder
disolvente superior al del lquido que ha servido para preparar la solucin colorante
(Sudn lll, rojo escarlata).
Por otro lado, las coloraciones pueden ser:
- Ortocromticas: los tejidos adquieren un color igual al de la solucin colorante
empleada.
- Metacromticas: una sustancia o un componente celular se tie con un color
diferente al del colorante empleado.

Mtodos de coloracin:
- Coloracin directa: existe una verdadera afinidad entre el colorante y el objeto.
- Coloracin indirecta: requiere la intervencin de intermediarios o mordientes para
que la coloracin tenga lugar.
- Coloracin progresiva: se hace actuar el colorante hasta que llegue a su punto
ptimo.
- Coloracin regresiva: se realiza primero una sobrecoloracin y luego se elimina el
resto del colorante por medio de diferenciadores. A este proceso se lo denomina
diferenciacin.
- Coloracin simple: se colorean solamente algunos elementos del preparado
(ncleo, fibras elsticas, etc.).
- Coloracin combinada: se tien los elementos nucleares y citoplasmticos
recurrindose, generalmente, al empleo sucesivo de colores bsicos y cidos que
contrastan por sus colores.
- Coloracin panptica: es una coloracin combinada realizada sucesivamente por
colorantes neutros (May-Grnwald-Giemsa).
- Coloracin pancrmica: en un solo bao colorante actan todos los colorantes
neutros que se necesiten.
Colorantes ms utilizados en histologa humana:
HEMATOXILINA:
- Es un colorante vegetal.
- Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden
ser: el aire (varios meses de exposicin) u oxidantes artificiales (xido de mercurio,
permanganato de potasio, dicromato potsico, etc.)
- Es un colorante directo, pero en la prctica se lo utiliza en forma de lacas
hematoxilnicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para
preparar la solucin colorante), comportndose en este caso como un colorante
indirecto.
EOSINA:
- Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixantnicos halogenados con
tres grupos arilo).
- Presenta autofluorescencia espontnea.
- Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohlicas.
Para colorear se emplea generalmente una batera de coloracin.
MONTAJE
Luego de la coloracin, se deshidrata el corte y se procede a la aclaracin y
montaje definitivo, dado que nos hemos propuesto hacer un preparado en
condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro.
La deshidratacin se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes.
La aclaracin se realiza con xilol o carboxilol. El objetivo de este paso es impregnar
el corte con un disolvente del Blsamo de Canad, que al mismo tiempo le confiere
un ndice de refraccin semejante al del vidrio.

Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el


mismo una gota de Blsamo de Canad disuelto en xilol y se cubre con un
cubreobjeto.
Se deja secar unas horas antes de su observacin al microscopio.
PROTOCOLO GENERAL
A continuacin se presenta el protocolo de trabajo utilizado por nuestra ctedra
para la tcnica de Hematoxilina - Eosna para preparados de uso didctico:
I. Fijacin
En formol al 10% (1 parte de formol y 9 partes de agua destilada) por lo menos
durante 6 hs.
II. Corte
Se le da el tamao deseado a la pieza y se la coloca en una bolsa de gasa, con el
fin de enjuagarla en agua corriente durante, por lo menos, 15'.

III. Deshidratacin
1)
2)
3)
4)
5)

Alcohol 70, 1h30'.


Alcohol 96, 1h30'.
Alcohol 100 (l), 1h30'.
Alcohol 100 (ll), 1h30'.
Toluol, entre 1h30' y 3hs.

IV. Inclusin
1)
2)
3)
4)
5)
6)

Secado de la muestra con gasa.


Parafina 56 (l), 1h30'.
Parafina 56 (ll), 1h30'.
Formacin de la barra.
30' de frezzer.
Fractura del taco

V. Corte
VI. Coloracin
1) Secado de los cortes en estufa a 58C, 15'.
2) Xilol o toluol (I), 15' en estufa.
3) Xilol o toluol (II), 2'.
4) Alcohol 100, 30".
5) Alcohol 96, 30".
6) Alcohol 70, 30".
7) Alcohol 50, 30".
8) Agua destilada, 30".
9) Hematoxilina, 130".
10) Agua corriente, 2.
11) Alcohol 50, 15".

12)
13)
14)
15)
16)

Eosina, 30".
Alcohol 96, 10".
Alcohol 100, 10".
Xilol, 1 por lo menos.
Montaje con Blsamo de Canad sinttico.