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Enzimologia

Sumrio

Reaco Enzimtica a 1S, 1Complexo e 1 P

Equao de Michaelis Menten de vo = f ([So])

Esquema Reaccional
Equaes Gerais e Solues Gerais
Estado Estacionrio e Pr Estado Estacionrio
Determinao de Velocidades Iniciais em condies ptimas
Construo de Curvas experimentais de vo em funo de [S]o

Deduo da Equao - Hipteses Restritivas


Anlise da curva de vo = f ([So])
Definio dos Parmetros Concentrados VM e KM
Significado fsico de VM e KM
Determinao de VM e KM

Comparao da actividade de vrias enzimas

Valores de kcat, KM e kcat/KM para vrias enzimas

Cintica Enzimtica
Estuda a velocidade das reaces catalisadas por enzimas e a forma
como esta varia com a concentrao do substrato, condies do meio
(T, pH) e na presena de inibidores ou activadores.
Aspecto prtico:
No laboratrio vamos medir velocidades da reaco em diferentes condies.

Aspecto terico:
Vamos construir modelos matemticos que se ajustam aos resultados
experimentais. Estes modelos caracterizam-se por depender de parmetros que
tm um significado fsico definido.

A informao obtida pode:


ser til do ponto de vista experimental (aplicaes prticas das enzimas).
fornecer pistas acerca dos mecanismos e dos aminocidos envolvidos na catlise.

Como vou obter velocidades no laboratrio?


Medindo o aparecimento do produto em funo do
tempo

d [ P]
v=
dt

Medindo o desaparecimento do substrato em funo


do tempo

d[S ]
v=
dt

Curvas de evoluo temporal : concentrao P vs tempo


S

velocidade
instantnea:

d [P ]
v=
dt

A velocidade da reaco (declive da


tangente s curvas de evoluo) diminui
com o tempo at se atingir o equilbrio:
i) A reaco inversa torna-se cada vez
mais importante com a acumulao do
produto.

[P]

No equilbrio a velocidade de converso


de S em P iguala a velocidade de
converso de P em S e v=0.

tempo

i)

A enzima torna-se instvel no decurso da reaco;

ii)

O grau de saturao da enzima pelo substrato diminui


medida que o substrato consumido;

iii)

Os produtos da reaco inibem a enzima;

iv)

Qualquer combinao dos factores anteriores.

As curvas de evoluo so,


normalmente lineares at 20%
de converso de substrato em
produto.

velocidades iniciais, v0

Determinao experimental da velocidade inicial


[P] em funo do tempo
(exponencial)

vo em funo de [substrato]
(Hiprbole)

equilbrio
[P]

v4
v4
v3

v3
v2
v1

tempo

Determinao experimental da
velocidade inicial: v0 = (d[P]/dt)0
Determinam-se as tangentes na origem
das curvas [P] vs tempo, para diferentes
valores de concentrao de substrato.
A concentrao total de enzima (ET) tem
que ser constante.

v2
v1
[s1] [s2]

[s3]

[S4]

vo = f ([S]o) exibe saturao

Velocidade da reaco

Velocidade da reaco

As reaces catalisadas por enzimas exibem uma cintica de saturao

Concentrao de substrato

Concentrao de substrato

Vo=f([S]) curva Hiperblica

Vo=f([S]) curva Sigmoidal

Enzima Michaeliana

Enzima Alostrica

Modelo Michaelis-Menten

Modelo concertado de MWC


Modelo sequencial de Koshland

Uma cintica de saturao implica a existncia de um


complexo enzima-substrato
Esquema da Reaco Enzimtica
E + S

k1
k-1

ES

k2
k-2

E + P

1. Identificar Variveis
2. Identificar Parmetros
3. Definir Sistema de Equaes
4. Definir as Condies Iniciais
5. Comparar as constantes de velocidade
7

E + S

k1
k-1

k2

ES

E + P

k-2

1.

Identificar Variveis - as 4 Concentraes - unidades M: [S], [P], [E] e [ES]

2.

Identificar Parmetros - 4 constantes de velocidade - duas constantes de 1


ordem k-1, e k2 (s-1) e duas constantes de 2 ordem k1 e k-2 (M-1 s-1).

3.

Definir Sistema de Equaes: havendo 4 variveis (incgnitas), so


necessrias 4 equaes independentes

4.

Definir as Condies Iniciais:

5.

Comparar as constantes de velocidade - UNIDADES - transformar as


constantes de 2 ordem em constantes de pseudo 1 ordem s-1 k1 [S] e k-2 [P]

6.

Pode-se re-escrever o Esquema Reaccional substituindo nas setas as


constantes de 2 ordem pelas respectivas constantes de pseudo 1 ordem
(s-1 ) k1 [S] e k-2 [P]

[S]=[S]o , [E ]=[ET] [ES]=[ P]=0

k1 [S]

k-1

ES

k2
k- 2 [P]

Cintica 1S - 1ES - 1 P - Equaes Gerais


E + S

k1
k-1

ES

k2
k-2

E + P

Sistema de 4 Equaes Diferenciais


Condies Iniciais:

[S]=[S]o , [E ]=[ET]

d [S]
= k 1 [E] [S] + k 1 [ES]
dt

[ES]=[ P]=0

d [P]
= k 2 [P] [E] + k 2 [ES]
dt
d [E]
= k 1 [S] + k 2 [P] [E] +
dt
d [ES]
=
dt

k 1 [S] + k 2 [P] [E]

Equaes de Conservao
k 1 + k 2 [ES]
k 1 + k 2 [ES]

[S]o = [S]+[ES]+[P]
[ET] =[E]+[ES]

Equaes Gerais
E + S

k1
k-1

ES

Sistema de 4 Equaes

k2
k-2

E + P

Condies Iniciais:

[ES]=[ P]=0

d[S]
[S]
[S]+[ES]+[P]
o ==
k 1 [E] [S] + k 1 [ES]
dt
d[P]
[S]
d[E
T] =[E]+[ES]
= k k2 1[P]
[E][E]
[S]+ k+ 2k[ES]
=
1 [ES]
dt
dt
d [P]
= k 2 [P] [E] + k 2 [ES]
d [E]
dt = k [S]
+ k 2 [P] [E] + k 1 + k 2 [ES]
1
dt
[E]
dd[ES]
== k 1 [S] ++kk22[P]
[P] [E]
[E] + kk1
[ES]
1 ++ kk22 [ES]
dt
d [ES]
= k 1 [S] + k 2 [P] [E] k 1 + k 2 [ES]
dt
10

Solues Gerais - Variao Temporal das Concentraes


ES

E+P

concentrao

E + S

d[ES]/dt0
d[E]/dt0
tempo
11

Solues Gerais - Variao Temporal das Concentraes


Hiptese Estado Estacionrio - Garantia Experimental se [S]o >> [ET]
[S]o >>>> [ET]

concentrao

Durao do Pr Estado Estacionrio Mnima se

d[ES]/dt0
d[E]/dt0
Pr
estado
estacionrio

tempo

[S]o >> [ET]


[ET] = [E]+[ES]

d[ES]/dt 0
d[E]/dt 0

12

Solues Gerais - Variao Temporal das Concentraes

concentrao

velocidade instantnea

Pr estado
estacionrio

equilbrio

tempo

Pr estado estacionrio

Velocidade Instantnea - Tangente curva em qualquer ponto = d[P]/dt


Velocidade Inicial - Tangente curva no instante inicial = (d[P]/dt)o

Pr Estado Estacionrio Mnimo garante (d[P]/dt)o Mximo


13

e a determinao correcta da velocidade incial

[P] = f(t) - Condies de Velocidade Inicial - vo = g([S]o)

A Variao de [P] - [S]o=10, 7.5, 5, 2.5, 0.1 B Periodo de validade - velocidade inicial
5

[P]

[P]

2.5

0.5

0
0

50

100

150 sec 200

C Velocidades iniciais - (d[P]/dt) o

0.1

vo

vo
VM
0.5

2.5

7.5 sec 10 0

10

20

[S] mM

14

Para simplificar a anlise vamos considerar duas


hipteses restritivas:
1 condio de velocidade inicial (vo)
as velocidades so determinadas a partir da tangente na origem da curva
[P] vs. tempo. Nestas condies pode-se desprezar a reaco de converso
de produto em ES porque a concentrao de produto muito baixa.

2 Hiptese de estado estacionrio ([So]>>>>ET)


Se a concentrao de substrato for muito superior concentrao de
enzima, a concentrao do intermedirio ES sempre muito baixa e pode
considerar-se constante ao longo do tempo (d[ES]/dt = 0).

No laboratrio necessrio garantir que as experincias so


feitas nestas condies!

Modelo geral

k1

E + S
Hipteses restritivas:

k-1

ES

k2
k-2

E + P

Condio de velocidade inicial ([P] 0)


e hiptese de estado estacionrio (d[ES]/dt=0)

Modelo cintico de Michaelis-Menten

E + S

k1
k-1

Equaes simplificadas:
Equaes diferenciais:

Balano de massas:

ES

kcat

d[P]
= kcat [ES]
dt

E + P

velocidade inicial

d[ES]
= k1 [E] [S] (k-1 [ES] + kcat [ES]) = 0
dt

[S]o = [S]

(porque [S]>>>>ET e [P] 0 )

ET = [E]+[ES]

Deduo da equao de velocidade do modelo de


Michaelis-Menten
E + S

k1
k-1

ES

kcat

E + P

Objectivo:
Expressar vo em funo dos parmetros do modelo (k1,k-1,kcat)
e de quantidades conhecidas ([So] e ET).

Vamos utilizar a expresso da velocidade


inicial, a hiptese do estado estacionrio e
as equaes de balano de massa da
enzima e do substrato.

d [P]
v0 =
= kcat [ES ]
dt

0
d [ ES ]
= k1[ E ][S ] (k1 + kcat )[ES ] = 0
dt

ET = [ E ] + [ ES ]
[S0 ] = [S ]

Deduo da equao de velocidade do modelo de Michaelis-Menten


E +S

d [P]
v0 =
= kcat [ES ]
dt 0
k1 [E ][S ] = (k1 + kcat )[ES ]

[S ] = [S ]0
ET = [E]+ [ES ]
definindo

k1
k-1

kcat

ES E + P

KM

[E ] = [ES ] k1 + kcat
k1

ET = [ES ]

KM
+ [ES ]
[S ]0

k +k
K M = 1 cat
k1

1
[S ]0

[ES ] =

ET
K
1+ M
[S ]0

VM

kcat ET [S ]0
v0 =
K M + [S ]0

VM = kcat ET
Equao de Michaelis-Menten
KM constante de Michaelis-Menten
VM velocidade mxima

VM [S ]0
v0 =
K M + [S ]0

[ES ] =

ET [S ]0
K M + [S ]0

Substituindo na
expresso de vo

Modelo Michaelis Menten:


Estado Estacionrio vs Rpido Equilbrio
k1 [S]
E

k-1

k cat

ES

E +P

[S]
KS
E

V
[S
]
M
o
vo =
KM + [So]

kcat
ES

E +P

Estacionrio

Rpido
Equilbrio

VM = k cat [ET]
k +k
KM = 1 cat
k1

KM =

k1
= KS
k1

19

Estado estacionrio vs. Rpido equilbrio


Estado estacionrio
d[ES]/dt =0

E+S

k1
k-1

ES

kcat

E+P

Se k-1>>>kcat considera-se que a adio de substrato est em rpido equilbrio e


o modelo pode ser simplificado. Nestas condies [ES] est relacionada com as
concentraes de enzima livre e substrato pela constante de dissociao KS.

Rpido equilbrio

KS =

[E ][S ] = k1
[ES ] k1

E+S

KkS1
k-1

kcat

E+P

A hiptese de rpido equilbrio mais restritiva do que a hiptese


de estado estacionrio. Modelo com menos parmetros.
A hiptese de rpido equilbrio no pode ser garantida na prtica.

Estado estacionrio

k 1 + k cat
KM =
k1

ES

Rpido equilbrio
k-1 >>> kcat

KM =

k 1
= KS
k1

Estado estacionrio vs. Rpido equilbrio

A hiptese de rpido equilbrio mais restritiva do que


apenas estado estacionrio, e permite maiores
simplificaes nos modelos cinticos (substituem-se
duas constantes de velocidade (k1, k-1) por uma
constante de equilbrio, KS).
Nos modelos de inibio e pH vamos utilizar sempre a
hiptese restritiva de rpido equilbrio.

TPC
Deduzir a equao de Michaelis-Menten utilizando a hiptese restritiva de rpido
equilbrio. Chegar s expresses de VM e KM para o modelo:

E+S

KkS1
k-1

ES

kcat

E+P

em que KS=[E][S]/[ES] a constante de dissociao do complexo ES


e kcat a constante de velocidade de formao do produto.

Representao grfica da equao de Michaelis-Menten:


hiprbole rectangular

v0

VM [S] o
=
KM + [S]o

KM unidades de concentrao
VM unidades de velocidade

Reaco de 1 ordem
[So]<<KM vo=(VM/KM) [So]
Reaco de ordem zero
[So]>>KM vo=VM

assmptota

Significado fsico dos parmetros VM e KM


k 1 + k cat
KM =
k1

VM = kcat ET
Variao de VM

Variao de KM

VM

VM
vo

vo

0.5VM

0.2 VM
0.1 VM
KM

[So]

VM depende da concentrao
da enzima. Corresponde a vo
quando toda a enzima est
saturada com substrato, i.e.
quando [S]>>>KM.

KM 2KM 5KM

10KM

[So]

KM uma medida da afinidade


entre a enzima e o substrato.
Quanto maior KM menor afinidade.

Determinao experimental de VM e KM

Velocidade (nM min-1)

1. Ajuste directo da hiprbole recorrendo a regresses


no-lineares vamos utilizar o solver do Excel

[S] (M)

Equao de Michaelis Menten - Determinao de VM e KM

v0
Linearizaes

VM [S] o
=
KM + [S]o

1 = KM 1 + 1
v0
VM S o
VM
vo = K M

vo
+ VM
So

So
K
= M + 1 S
vo
VM
VM

Lineweaver Burk

Eadie Hofstee

Hanes Woolf
26

Determinao experimental de VM e KM
Linearizaes da equao de Michaelis-Menten
A - Lineweaver Burk

B - Eadie Hofstee

1
vo

V
M
declive =
slope

VM

declive = -K M
slope

VM

1
[S]

-1

KM

1
v0

KM
VM

1 + 1
S o
VM

VM
KM

vo =

KM

vo
S

+ VM
o

vo

[S]

Mtodo directo

Linearizao de
C - Hanes Woolf

D - Cornish Bowden
V
M

[S]
vo

declive =

VM

vo

V*M

VM

[S]

-K M

[S]3

[S]2

v3
v2
v1

[S]1

KM

K *M

KM
VM

1
+
VM

VM

= vo +

vo
S

KM
o

Equao de Michaelis Menten - Determinao de VM e KM

v0

VM [S] o
=
KM + [S]o

Mtodo Estatstico
Clculo do parmetro VM

Clculo do parmetro KM

v0
v0
2
[S ] 2 v0 [S ]
0
0

VM =
v0 2
v0 2
v0

[S ] 2 0 [S ] [S ]
0
0
0
2

v0
v0 2
2
[S ] v0 [S ] v0
0
0
K M =
2
2
v0
v0
v0
[S ] 2 v0 [S ] [S ]
0
0
0
29

Equao de Michaelis Menten - Determinao de VM e KM

v0
Erro do parmetro VM

VM [S] o
=
KM + [S]o

( )

VM =

2
v
2
VM4 exp
0 2
[ S ]0

v0
v0
2

[S ] 2 0 [S ]
0
0

Erro do parmetro KM
2
2

v
v
2
VM2 exp
v0 2 + 2 K M 0 + K M2 0 2
[ S ]0
[ S ]0

=
2
2
2

v0
v0
2

[S ] 2 0 [S ]
0
0

( )

K M

30

Valores de KM e kcat para vrias enzimas


E+S
enzima

substrato

k1
k-1

ES

kcat

E+P

KM M

kcat
Enzima

KM est relacionado com a formao de ES, KM elevado fraca afinidade entre E e S


kcat est relacionado com a velocidade de catlise, kcat elevado reaco mais rpida

Enzimas cataliticamente perfeitas:


kcat/KM aproxima-se do limite da difuso: 108 109 s-1M-1

kcat
kcat
kcat
=
=
k1 < k1
K M k 1 + kcat k 1 + kcat
k1
<1

O limite de kcat/KM o valor de k1.


Este valor no pode ser superior ao
da constante de velocidade do
encontro da enzima com o substrato
que controlado pela difuso.