UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS MDICAS

CARRERA DE MEDICINA
Asignatura: LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
PRACTICA 2: Tcnica de Tinciones de la pared Bacteriana:
Gram y Ziehl-Neelsen
marzo agosto/2015

RESULTADO DE APRENDIZAJE: interpretar los resultados de las coloraciones de la

pared bacteriana
OBJETIVO:
Comprender los pasos necesarios para realizar la tincin de Gram y Bacilos
Alcohol-Acido Resistentes
Reconocer los microorganismos Bacilo alcohol-acido resistentes y Gram positivos
y negativos, al igual de la aplicabilidad clnica de la tincin.

1.-Introduccin
Taxonoma

Todos los organismos tienen un nombre que consta de dos partes: el gnero seguido
por la especie (es decir, el Homo sapiens). (La forma correcta de escribir es la primera
letra del gnero va en maysculas, la especie va en minsculas y en cursiva). Las
bacterias se han agrupado y denominado principalmente en su morfolgicas y
bioqumicas / metablicas diferencias. Sin embargo, las bacterias son ahora tambin
clasificadas de acuerdo a su inmunologa y las caractersticas genticas. Las tinciones
las cuales permiten al mdico - clnico determinar rpidamente el organismo que est
causando la infeccin de un paciente.
PREPARACIN DEL EXTENDIDO PARA LA MICROSCOPIA OPTICA
En la preparacin de los extendidos se utilizan en forma directa las muestras del
paciente o se aplican los microorganismos provenientes de cultivos.
Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un hisopo que contiene
el material del paciente o con una pipeta dentro de la cual se encuentra la muestra de
lquido aspirado (Fig. 1). El material que se va a teir se coloca en forma de una gota (si
la muestra es lquida), o se rota de adentro a fuera (si est en un hisopo) sobre la

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superficie de un portaobjeto limpio y seco, en la parte media con un largo aproximado

de 2 cm por 1 cm de ancho.
B

Fig 1.- frotis obtenidos por rotacin de un hisopo (A) y deposito

con pipeta (B) de la muestra del paciente sobre un portaobjetos
de vidrio.

Se deja secar y se fija al portaobjeto mediante:

1).- una platina caliente (a 60C) durante por lo menos 10 minutos
2).- cubrindolo con metanol al 95% durante 1 minuto o
3).- flameando la placa portaobjetos por el mechero en tres ocasiones
Para examinar los microorganismos que crecen en lquidos corporales se aplica una
gota de la muestra aspirada sobre el portaobjetos, se seca y se fija. Por ltimo, el
mtodo de tincin que se debe utilizar est determinado por el tipo de microorganismo
buscado.

COLORACION GRAM

Dado que las bacterias no tienen color y por lo general invisible para la microscopa de
luz, diferentes tcnicas de tincin se han desarrollado para visualizarlas. La ms til es
la tincin de Gram, que separa los organismos en 2 grandes grupos: gram-positivos y
gram-negativas.
Esta tincin tambin permite que el clnico pueda determinar si el organismo tiene las
caractersticas:
Forma: redondo o en forma de varilla, etc.
Agrupacin: racimos, cadenas, etc.
Reaccin de gram: positiva o negativa,
Cantidad: 1, 2, 3, etc. x campo o +, ++, +++, ++++
Elementos acompaantes: PMN, eritrocitos, detritus, clulas, etc.

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La tincin de gram es la tcnica principal utilizada para el examen microscpico de las

bacterias. Casi todas las bacterias de importancia clnica pueden detectarse con este
mtodo. Las nicas excepciones son:
Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro de las clulas
husped (p. ej., chlamydias).
Los que carecen de pared celular (p. eje., mycoplasmas y ureoplasmas).
Los que tienen un tamao insuficiente para ser observados por el microscopio
ptico (p. ej., espiroquetas).
Los que tienen una diferente composicin en su pared y no captan los colorantes
(p. ej., mycobacterias).

Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo
microorganismo, si sufre dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gram
negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del
colorante. Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente:
El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca
insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las
paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y forma una
barrera que la laca no puede atravesar. En las clulas gram negativas, los lpidos de la
pared (ms abundantes que en las clulas gram positivas) se disuelven por este
tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos
autores objetan esta teora, pero es indudable la importancia general de la pared
celular.

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Fig. 2.- Estructura de paredes bacterianas GRAM(+) y

Si bien la evaluacin de la tincin de Gram del frotis directo se utiliza de rutina como
una ayuda en el diagnstico de las infecciones bacterianas, es posible que se detecten
y no deben ignorarse hallazgos inesperados pero importantes de otras etiologas
infecciosas. Por ejemplo, las clulas y los elementos micticos por lo general se tien
como gram positivos pero pueden captar el cristal violeta de manera deficiente y
aparecer como gram variables (p. ej., rosa y violeta) o gram negativos. Dado que con la
tincin de Gram pueden detectarse otros agentes adems de los hongos:
Como clulas inflamatorias (PMN o mononucleares)
Elementos sanguneos (eritrocitos)
Restos celulares o mucosos (detritus celulares)
Clulas epiteliales
CAUSAS QUE ALTEREN LA COLORACIN DE GRAM

I: Edad de la bacteria.

II: Errores del operador.

III: Uso de antibiticos

A pesar de la gran utilidad de la tincin de Gram, este mtodo debe ser valorado con
precaucin, ya que la reaccin puede variar segn la edad de las clulas (cultivos viejos
de bacterias gram positivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teirse como
gram negativos) y la tcnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se
puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tian como gram negativas), es
por esta situacin que junto a la muestra deben teirse controles con bacterias gram
positivas (ej. S. aureus) y gram negativas (ej. E. Coli).

COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN
La tincin de Ziehl-Neelsen es una tcnica de tincin diferencial que se basa en que las
paredes celulares de ciertas bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de
cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloracin con alcohol-acido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Las
mycobacterias absorben los colorantes solo muy lentamente debido a la elevada
proporcin de ceras y lpidos en la pared celular. Para acelerar la absorcin del
colorante fuscina y as la formacin del complejo micolatofusina en la pared celular, se
calienta la solucin de fuscina fenicada aplicada sobre el preparado normalmente hasta
la formacin de vapores. Una vez que las mycobacterias han absorbido el colorante,
difcilmente lo ceden a pesar del tratamiento con solucin decolorante alcohol-cido
clorhdrico. Por esto se denominan bacilos alcohol cido resistente o BAAR y aparecen
en el preparado microscpico teidas de rojo, mientras que todos los microorganismos
no resistentes a los cidos se tien de acuerdo con la contratincin. 1
Las mycobacterias no constituyen el nico grupo que tienen propiedades alcohol-cido
resistentes. Las especies de Nocardia y Rhodococcus poseen una alcohol-acido
resistencia parcial as como Legionella micdadei causante de neumona. Los quistes de

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los gneros Cryptosporidium e Isospora tienen resistencia definida a las tinciones con
cido alcohol

LA MUESTRA.
La muestra ms examinada es el esputo. Sin embargo, dado que el mycobacterium
puede afectar a cualquier rgano, con menor frecuencia puede requerirse la
investigacin de muestras muy variadas como: orina, lquido cefalorraqudeo, lquido
pleural, lquido asctico, sangre, pus de cavidades abiertas, biopsias de piel, hueso,
aspirado gstrico, lavado bronquial.
2. MATERIALES REQUERIDOS
Portaobjetos
Cubreobjetos
Asas de inoculacin
Mechero Bunsen
Pipetas
Hisopos
Colorantes para gram y ZIEHL-NEELSEN
Solucin salina
aplicadores
soporte para los extendidos
lpiz para marcar lminas portaobjetos
3. DESARROLLO DE LA PRCTICA
PROCEDIMIENTO:
El procedimiento clsico de la tincin de Gram consiste en fijar el material orgnico a la
superficie del portaobjetos del microscopio ya descrito.
REACTIVOS:
cristal violeta o violeta de genciana
lugol o disolucin de Lugol
Alcohol cetona
Safranina
Primer paso en la tincin de Gram es la aplicacin del colorante principal cristal violeta
(metil rosanilina o violeta de genciana) por un minuto. Luego se lava con agua corriente
abundante, aplica un mordiente, el yodo de Gram (lugol), para que el colorante alcalino
se una a la pared celular a travs de enlaces qumicos por un minuto y se lava. El tercer
paso la decoloracin distingue las bacterias gram positivas de las gram negativas y se
realiza con alcohol acetona por 30 segundos y se lava. Despus de la decoloracin los
microorganismos aparecen como gram positivos retienen el cristal violeta y los
gramnegativos lo pierden. El ltimo paso agregar colorante de contraste safranina
(Contra tincin) teir de color rosa o rojo las bacterias gramnegativas claras por un
minuto y se lava. Despus de todo esto se deja secar.

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OBSERVACION DE LA TINCION DE GRAM.

Una vez teido el frotis se observa con el objetivo de inmersin (1.000x). Cuando el
material orgnico se tie con Gram (p. ej., frotis directo) el portaobjetos se evala en
busca de la presencia de clulas bacterianas as como de las reacciones Gram, (Fig. 3)
En el anlisis de muestras clnicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias
funciones:
Identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin.

TCNICA COLORACIN ZIEHL-NEELSEN

Ubicar al lado de la mesa el recipiente para descartar el material con tapa
Para cada muestra, numerar una lmina portaobjetos,
Tomar la muestra y la lmina correspondiente y colocarlas detrs del mechero de
manera que la llama quede entre el operador y el frasco. Esta posicin proteger al
laboratorista de posibles formaciones de aerosoles al abrir el frasco.
Destapar con cuidado el envase.
Partir un aplicador en dos, tratando de que las puntas queden speras.
Tomar una parte del aplicador seleccionar la partcula ms densa o purulenta de la
muestra de esputo. Colocar la(s) partcula(s) seleccionada(s) sobre el portaobjetos y
extenderla(s) de acuerdo a procedimiento de extensin del frotis descrito
anteriormente.
REACTIVOS:
Fucsina fenicada bsica
Alcohol acido 3,0 %
Azul de metileno
COLORACIN EN CALIENTE
PROCEDIMIENTO:
1.- Se fija la muestra al portaobjetos con calor o alcohol.
2.- Se cubre el frotis con papel filtro
3.- Colocamos el reactivo de colorante de carbolfuscina cubriendo todo la placa
4.- Se calienta con suavidad hasta la aparicin de vapores mediante flameo por debajo
de la rejilla de sostn con un mechero de gas, si el colorante se evapora demasiado se
coloca ms, se deja actuar el colorante sobre el portaobjetos durante 5 minutos.
5.- Se retira el papel filtro, inclina el frotis para eliminar el exceso de colorante y se lava
con agua destilada con un chorro constante y no fuerte.
6.- Se decoloran con cido alcohol al 3,0 % durante 3 minutos. Se lavan los frotis con
agua destilada y se los inclina para escurrir el resto de agua.
7.- Se cubren los frotis con reactivo de azul de metileno durante 1 minuto.
8.- Se lavan con agua destilada y se dejan secar al aire.
9.- Se examinan con aceite de inmersin en bsqueda de BAAR 5.
CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DE LAS MYCOBACTERIAS

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Los bacilos acidorresistentes tienen entre 1 y l0 m de largo. Con la coloracin de Ziehl

Neelsen se observan como bastoncitos delgados, ligeramente curvos, rojo fucsia,
destacndose claramente contra el fondo azul. A veces se observan con grnulos o
cuentas intensamente coloreados en el interior, pueden aparecer como bastones muy
largos o como bacilococos.
Otros microorganismos pueden presentar distintos grados de cido resistencia, como
Rhodococous spp., Nocarda spp., Legionella spp. y los quistes de Crptosporidio e
Isospora spp. Se observan como cocos, bacterias con formas variadas (pleomrficas),
filamentos que a veces estn cortados, o como esferas de gran tamao si se las
compara con las bacterias.
RESULTADOS:
Positiva
Negativo
no BAAR

bacilos rojos delgados en rosario

BAAR
ausencia de bacilos rojos delgados en rosario en 100 campos

Un hallazgo positivo significa presencia de bacilos alcohol acido resistentes y un

hallazgo negativo significa ausencia de bacilos alcohol acido resistentes.

AUTOEVALUACION E INVESTIGACION
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Cite 2 ejemplos de microorganismos gram positivos y gram negativos.

Enumere 3 diferencias entre gram positivos y gram negativos
Investigar que debe constar en un reporte (resultado) de coloracin de Gram?
Indicaciones para solicitar una coloracin de gram y ZIEHL-NEELSEN
Cuando se define que una muestra de esputo es adecuada?.
En una coloracin de gram se reporta detritus celulares cual es la importancia?
En el reporte de gram se indica la presencia de bacterias por cruces (+) o
nmero por campo (1-2xc) que es lo correcto?

BIBLIOGRAFA
1. Koneman, E. Diagnostico microbiolgico, Editorial mdico panamericana,
2. Jawetz Ernest, Microbiologa mdica, 17 edicin en espaol, Manual moderno,
Mxico, Mxico 2002.
3. Bailey & Scott, Diagnstico microbiolgico, 11 edicin, Editorial Panamericana,
Buenos Aires Argentina, 2 004.

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PRE-REQUISITOS DE MICROBIOLOGIA
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PREGUNTA 1.

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PREGUNTA 2

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