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TINCION GRAM EXPLICACION EL PORQUE

Explicacin
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto gram positivas
como gram negativas) a travs de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2
(yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para
solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble
en solucin acuosa con el cristal violeta..
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma
es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos gram positivos no se decoloran, mientras
que los gram negativos s lo hacen.
Para poner de manifiesto las clulas gram negativas se utiliza una coloracin de contraste.
Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Despus de la
coloracin de contraste las clulas gram negativas son rojas, mientras que las gram positivas
permanecen violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de
contraste que pone de manifiesto las bacterias gram negativas. Al trmino del protocolo, las gram
positivas se vern azul-violceas y las gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de
contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina).
La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante utilizado en la Tincin de Gram
(1884). La propiedad de teirse o no de violeta oscuro (Gram positivas o Gram negativas) por esta
coloracin es un criterio de clasificacin importante correlacionable con otras propiedades
bacterianas. Unos pocos organismos son Gram-variables.
Tanto las Gram-positivas como las Gram-negativas captan la misma cantidad de cristal violeta (CV)
e iodo (I). El complejo CV-I sin embargo es atrapado dentro de la clula Gram positiva por la
deshidratacin y la reduccin del tamao de los poros de la pared resultante del proceso de lavado
con solvente. En contraste en las Gram negativas la fina (y probablemente discontinua) capa de
peptidoglicano no impide la extraccin por el solvente del complejo.
Avala lo antedicho el hecho que, si despus de su tincin se tratan con lisozima bacterias Gram
positivas, se ve que los protoplastos siguen teidos, pero pierden el colorante si se los trata con
alcohol. Esto indica que el colorante es fijado a nivel del protoplasto, y que la pared celular de las
bacterias Gram positivas es la que impide la extraccin del colorante. Corroborando esta
suposicin se observa que cuando Bacillus subtilis emerge de su espora su pared celular esta
"inmadura" y se comporta como Gram negativa. Cuando la pared celular adquiere su estructura
final pasa a ser Gram positiva.

El mtodo comprende el tratamiento de una muestra de un cultivo bacteriano cultivado en medios


slidos o lquidos con un colorante primario, cristal violeta, seguido de tratamiento con un fijador,
el lugol. Tanto Gram-positivas y Gram-negativas absorber idnticamente colorante y el elemento de
sujecin primario, adquiriendo un color violeta debido a la formacin de cristal violeta-yodo
complejo insoluble en su citoplasma. De ello se sigue un tratamiento con un disolvente orgnico,
etanol-acetona. El disolvente disuelve la porcin lipdica de las membranas externas de las bacterias
Gram-negativas y complejo cristal violeta-yodo es eliminado, las clulas de blanqueo. Por otra
parte, el disolvente se deshidrata las paredes celulares gruesas de bacterias Gram-positivas y causa
la contraccin de los poros de peptidoglicano, hacindolos impermeable al complejo; el colorante
primario se conserva y las clulas teidas restantes. La etapa de blanqueo es crtica, ya que la
exposicin prolongada a la eliminacin del disolvente hace que el cristal violeta de los dos tipos de
bacterias pueden producir resultados falsos. La retencin o no el colorante primario depende tanto
de las propiedades fsicas y qumicas de las paredes celulares bacterianas tales como el grosor, la
densidad, la porosidad y la integridad.
Luego, la muestra se trata con un colorante secundario, fucsina bsica. Bajo el microscopio, las
clulas Gram-positivas aparecen teidas de color violeta oscuro y Gram-negativas de color rosa o
rojo oscuro. Clulas de las bacterias Gram-positivas, las clulas viejas, sobres muertas o daadas
por agentes fsicos o qumicos tienden a perder cristal violeta y las mismas cepas bacterianas
pueden mostrar algunas o todas de las clulas teidas como bacterias Gram-negativas. Por lo tanto,
el uso de material fresco es importante. Por otra parte, como slo se puede obtener "Gram-positiva
falsa" si se omite el tratamiento con resultados de etanol-acetona.

Fundamentos de diferenciacin de gram positivo y gram


negativo
Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias
gram positivas y gram negativas
La pared celular de las bacterias gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, adems
de dos clases de cidos teicoicos: anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la
membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico
que est anclado solamente en el peptidoglicano (tambin conocido como murena).
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las gram negativas es delgada, y se encuentra unida a
una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de
lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por
lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas direrencias

constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez


a la pared celular bacteriana, y las gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las
gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa
de las gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de
alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder
retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo
se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las gram positivas, al
poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son
susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros,
cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la
coloracin azul-violeta.