Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Isolamento e Caracterizao de
Bactrias Endofticas de Cana-deacar Raras e Comuns Com nfase na
Fixao Biolgica do Nitrognio
Mayana Mirelly Horta Santos1, Marcelo Ferreira Fernandes2, rika Cristina
Teixeira dos Anjos Brando3
Resumo
O nitrognio (N) um componente elementar para a nutrio de toda espcie
vegetal. Entretanto, este macronutriente no encontrado na forma assimilvel
na atmosfera terrestre. Um grupo de bactrias assimbiticas, denominadas
diazotrficas, converte o N2 atmosfrico em amnia atravs do processo de
fixao biolgica do N (FBN) em plantas no leguminosas. A cana-de-acar
uma planta em crescente expanso produtiva em solos brasileiros devido
sua importncia para a gerao de lcool biocombustvel. Para o isolamento
de bactrias ainda no cultivadas de cana-de-acar com maior potencial para
a FBN props-se neste trabalho utilizar meios de cultura no convencionais. O
objetivo do trabalho foi obter uma coleo de isolados de bactrias endofticas
raras e comuns de variedades de cana-de-acar e posterior caracterizao
por meio da atividade de reduo do acetileno in vitro. O isolamento seguiu o
mtodo proposto por Dobereiner et al. (1995). Os meios de cultura utilizados
foram: NFb, JNFb, LGI, LGIP, JMV e WG, alm das suas diluies 1:5 (v/v)
e meios NFb e LGI acrescidos de xilana ou celulose como fonte de carbono
ou soluo especial de vitaminas. O nmero de clulas/mL foi determinado
nos dois isolamentos atravs da visualizao de pelcula caracterstica de
diazotrficos e resultados conferidos na tabela de McCrady (DOBEREINER
et al., 1995). Para o teste de reduo de acetileno in vitro, os isolados
bacterianos foram crescidos nos meios especficos sem azul de bromotimol.
O etileno produzido foi quantificado em um cromatgrafo a gs equipado com
um detector de ionizao e coluna GS-Carbon PLOT. O resultado do nmero
mais provvel demonstrou que houve diferena na deteco de pelcula
Graduanda em Qumica Licenciatura, bolsista PIBIC/FAPITEC, Universidade Federal de Sergipe
(UFS), So Cristovo, SE, may_mirelly@hotmail.com.
2
Engenheiro-agrnomo, doutor em Cincia do Solo, pesquisador da Embrapa Tabuleiros
Costeiros, Aracaju, SE, marcelo.fernandes@embrapa.br.
3
Doutora em Cincias Biolgicas, bolsista DCR/CNPq, bolsista Ps-Doutorado/CAPES/Fapitec/
Embrapa Tabuleiros Costeiros, Aracaju, SE, erika.anjos@colaborador.embrapa.br.
234
Introduo
A cana-de-acar (Saccharum sp) tem uma grande importncia social para a
economia mundial, por ser responsvel pela produo de lcool e acar. Foi
introduzida no Brasil no inicio do sculo XVI e prosperou principalmente na
regio Nordeste (Santana, 2014). Para uma boa produo agrcola a planta
necessita de fonte adequada de nutriente para o seu desenvolvimento. Um dos
elementos essenciais para a nutrio o nitrognio (N), um macronutriente,
que colabora para a formao de substncias essenciais para as plantas
(CLARKSON e HANSON, 1980). A ausncia da adubao com este nutriente
um dos fatores mais limitantes para produo vegetal nos trpicos (Greenwood
et al., 1991). Embora 80% da atmosfera sejam constitudos de N2, esta fonte
no diretamente disponvel s plantas. No entanto, um grupo especfico
de bactria assimbitico, denominado diazotrficas, capaz de disponibilizar
este N atmosfrico para culturas associadas atravs do processo de fixao
biolgica do N (FBN) (BALDANI et al., 1997).
H quase 100 anos reconhece-se que menos de 10% das clulas presentes
em amostras de solo se multiplicam e formam colnias em meios de cultura
em laboratrio. O cultivo e a caracterizao de bactrias diazotrficas ainda
no cultivadas podem levar a um melhor entendimento do seu papel no
ciclo do N e na sucesso primria (HUANG et al., 2011). Esforos de cultivo
necessitam ser direcionados para cultivar novos representantes destes e de
outros grupos diversos, de modo a permitir a caracterizao adequada dos
235
Material e Mtodos
Coletas de amostras biolgicas de quatro variedades de cana-de-acar
foram realizadas durante o perodo de novembro de 2013 e janeiro de 2014.
As amostras de razes foram levadas para o Laboratrio de Microbiologia do
Solo da Embrapa Tabuleiros Costeiros (Aracaju SE) e ficaram armazenadas
sob refrigerao at o processamento. Para a obteno de isolados raros e
comuns utilizou-se razes de quatro gentipos de cana-de-acar (RB867515,
RB92579, RB931530, SP791011) obtidos de plantios comerciais das Usinas
Coruripe (Coruripe - AL) e da Usina So Jos de Pinheiro (Laranjeiras - SE).
Neste trabalho propusemos utilizar meios semisslidos convencionais e no
convencionais para o isolamento de bactrias diazotrficas assimbiticas ainda
no cultivadas em condies de laboratrio. Os meios convencionais so
aqueles tpicos para o crescimento de diazotrficas: NFb, JNFb, LGI, LGI-P,
JMV, conforme descrio de Dobereiner et al.(1995). Alm destes, utilizou-se o
meio oligotrfico de Winogradski, tambm para o crescimento de diazotrficas,
conforme composio descrita por Hara et al. (2009). Foram propostos
tambm meios no convencionais como: os meios NFB e LGI acrescidos de
xilana (obtido de madeira de faia, Sigma) e celulose (carboximetil-celulose,
Acros Organics) na concentrao de 0,05%. Os demais meios de cultura foram
diluies 1:5 (v/v) dos meios citados anteriormente (NFb, JNFb, LGI, LGIP
e JMV). Todos os meios de cultura foram solidificados com gelana 0,06%
(Phytagel, Sigma). Para o isolamento, dez gramas de razes foram lavadas e
trituradas em liquidificador com soluo salina a 0,85%. Em seguida, foram
feitas diluies seriadas do inoculo original (10-2 a 10-7). Para determinar a
contagem de diazotrficos em cada tratamento (variedade/meio de cultura),
fez-se a inoculao de 0,1 mL das trs ltimas diluies (10-5, 10-6 e 10-7) em
trs frascos/diluio. Este mtodo permitiu a contagem de frascos com pelcula
caracterstica de diazotrficos formada nos meios semisslidos. Os resultados
236
237
Resultados e Discusso
No 1 isolamento foram obtidos 123 isolados e no 2 isolamento 95 isolados
bacterianos. Destes, 69 (56,1%) apresentaram crescimento negativo em meio
EMB a 37C no 1 isolamento e 40 (42%) no 2 isolamento. Os isolados que
apresentaram crescimento negativo em EMB a 37C so aqueles que sero
caracterizados quanto atividade de reduo de acetileno e molecular. Os
resultados referentes a estes isolamentos podem ser observados, na Tabela 1.
O nmero de clulas/mL, que reflete a presena de pelcula caracterstica de
diazotrficos nos meios semisslidos, antes do isolamento das bactrias em
cultura pura, referentes ao 1 isolamento das variedades de cana-de-acar,
foi superior para a variedade RB867515 em relao a variedade RB92579. No
entanto, este resultado no se refletiu no nmero de isolados obtidos aps
repicagem para o meio slido; verificou-se que 54 isolados foram obtidos para
a RB867515, enquanto 68 foram obtidos da variedade RB92579. Hara et al.
(2009) verificaram que algumas espcies de Pseudomonas spp. Fixadoras de
N so incapazes de crescer em meio slido. Eles afirmaram que nos meios
semisslidos no h apenas um isolado bacteriano, mas sim um consrcio de
espcies e por isso nem todas as espcies so capazes de crescer isoladamente
em cultura pura.
238
239
140
57
125
140
56
17
1,7
2,8
55
12
NFb (1:5)
JNFb
JNFb (1:5)
LGI
LGI(1:5)
LGIP
LGIP (1:5)
JMV
JMV (1:5)
WINOGRADSKI
1 isolamento
N de isolados bacterianos
obtidos
RB867515
NMP (n clulas x 10 /
mL)
NFb
Tratamento
2,5
80
2,5
0,4
0,4
2,5
62
35
13
57
RB92579
Continua...
N de isolados
bacterianos
obtidos
Tabela 1. Nmero mais provvel (NMP) (nmero de clulas/mL) e nmero de isolados obtidos por tratamento
(variedade e meio de cultura) utilizado nos dois isolamentos de cana-de-acar.
IV Seminrio de Iniciao Cientfica e Ps-Graduao da Embrapa Tabuleiros Costeiros
240
25
9,5
15
9,5
15
7,5
25
9,5
3,5
9,5
110
NFb
NFb (1:5)
LGI
LGI(1:5)
LGIP
LGIP (1:5)
NFb + xilana
LGI + xilana
NFb + celulose
LGI + celulose
NFb + soluo de
vitaminas
LGI + soluo de
vitaminas
N de isolados
bacterianos obtidos
RB931530
NMP (n clulas
x 106/mL)
Tabela 1. Continuao.
0,9
1,1
7,5
1,5
1,1
3,5
1,5
0,7
1,5
4,5
45
9,5
NMP (n
clulas x 106/
mL)
N de isolados
bacterianos
obtidos
SP791011
2 isolamento
1,5
25
0,9
0,4
9,5
0,6
0,7
0,4
1,4
1,5
7,5
NMP (n
clulas x
106/mL)
N de isolados
bacterianos
obtidos
RB92579
IV Seminrio de Iniciao Cientfica e Ps-Graduao da Embrapa Tabuleiros Costeiros
241
Variedade
Meio de cultura
ARA relativo
(nmol C2H4/g BSA/dia)
RB172
RB867515
LGIP
18*
RB261
RB92579
LGI (1:5)
29*
RB282
RB92579
LGIP (1:5)
42*
RB373
RB92579
NFb + xilana
1.287*
SP293
SP791011
NFb + celulose
12*
LGIP
358
Gd
PAL-5
a
A estirpe PAL-5 de Gluconacetobacter diazotrophicus foi utilizada como referncia para ARA relativo.
* Valores mdios de ARA relativo (nmol C2H4/g BSA/dia) significativamente diferentes ao da referncia
padro Gd PAL-5, pelo teste de Dunnet (p 0,05).
Concluses
Bactrias endofticas com pelcula caracterstica para organismos diazotrficos
so capazes de crescer em meios convencionais e no convencionais
(modificados). Um isolado endoftico obtido da variedade RB92579 e do meio
de cultura NFb + xilana positivo para fixao biolgica do nitrognio.
Agradecimentos
Fapitec pela concesso de Bolsa de Iniciao Cientfica PIBIC aluna de
graduao. E Fapitec/CAPES pela concesso de Bolsa de Ps-doutorado a
segunda autora.
242
Referncias
CLARKSON, D.T.; HANSON, J.B.The mineral nutrition of higher plants. Annual
Review of Plant Physiology, v. 31, p. 239-298, 1980.
DBEREINER, J.; BALDANI, V.L.D.; BALDANI, J.I. Como isolar e identificar bactrias
diazotrficas de plantas no leguminosas. Braslia, DF: Embrapa-SPI, 1995. 60 p.
243
244