Control microbiológico alimentos agentes físicos químicos

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS
Prctica N 1
PRCTICA No. 1
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:

AGENTES FSICOS Y QUMICOS
ES OBLIGATORIO EL USO DE MANDIL, COFIA Y MASCARILLA DE TELA
REVISAR LAS INDICACIONES DEL LABORATORIO

ESTUDIAR EL CONTENIDO TEORICO, SE REALIZAR UNA EVALUACIN AL INICIAR
LA PRCTICA, TRAER TODO EL MATERIAL SOLICITADO
Prctica N 1
CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:

AGENTES FSICOS Y QUMICOS
1. OBJETIVOS:
Simular en el laboratorio los mtodos de control del crecimiento microbiano utilizados

en la industria.
Determinar la sensibilidad bacteriana a dosis diferentes de Gentamicina y compuestos
qumicos mediante un antibiograma
2. BASES CONCEPTUALES
El crecimiento de los microorganismos est influido fuertemente por la naturaleza fsica y
qumica de su ambiente. El conocimiento de estas influencias ambientales permite el control
del crecimiento microbiano y el estudio de la distribucin ecolgica de los microorganismos
Los principales factores que influyen en la eficacia de los agentes fsicos y qumicos son los
siguientes:
- Nmero de microorganismos
- Clase de microorganismos (no todos los microorganismos son igual de sensibles a los
agentes fsico-qumicos).
- Concentracin y clase del agente qumico.
- Intensidad y naturaleza del agente fsico.
- Tiempo (necesitan un tiempo mnimo para producir el efecto que es distinto para cada
agente).
- Temperatura y pH.
- Naturaleza del material soporte de los microorganismos.
El control de microorganismos comprende todos los mtodos fsicos, mecnicos y

preferentemente qumicos, que se emplean para destruir grmenes (Tabla 1)
Los agentes fsicos y qumicos tienen una accin inespecfica y una actuacin mltiple sobre
componentes y estructuras
Agentes qumicos: Sustancias qumicas que influyen negativamente sobre las
bacterias. Sus efectos ms importantes son el impedir el crecimiento microbiano
(statico) o la destruccin de microorganismos (cida)
Agentes fsicos: condicin o propiedad fsica que causa un cambio
Prctica N 1
Tabla 1. Principales agentes fsicos y qumicos usados para el control microbiano
Temperatura
Altas
(Calor)
AGENTES
FSICOS
Bajas
Radiaciones
Agentes mecnicos
AGENTES
QUMICOS
Llama directa:
flameado,
incineracin
Seco
aire caliente:
estufas
Autoclave
Tindalizacin
Hmedo
Ebullicin
Pasteurizacin
Congelacin
Refrigeracin
Ultravioleta
Rayos X
Ondas snicas y ultrasnicas
Filtracin
Soluciones qumicas
Gases
Antibiticos y quimioteraputicos
Constituyentes antimicrobianos y estructuras biolgicas en alimentos

Ciertos alimentos son muy estables frente al ataque microbiano, esto se debe a la presencia
de determinadas sustancias que han demostrado poseer actividades antimicrobianas. La
cubierta de algunos alimentos (membrana testcea de las semillas, la cubierta externa de los
frutos, la cscara de las nueces, entre otras) proporciona una excelente proteccin contra la
entrada y subsiguiente ataque de los microorganismos productores de alteraciones.
Actualmente se estn realizando ensayos para determinar la capacidad antimicrobiana de
ciertos compuestos que forman parte de los alimentos para usarlos con fin industrial.
CONCEPTOS GENERALES
-
Esterilizacin: destruccin de todo tipo de vida microbiana presente en elementos

inanimados.
Desinfeccin: eliminacin de la infeccin potencial de un material, no implicando
necesariamente en la destruccin de todos los organismos viables. Es un proceso
relativo del control del microbiano. Es un trmino aplicado en relacin con las
superficies inanimadas (instrumentos, muebles, utensilios, aparatos y lugares) y a las
sustancias inanimadas.
Desinfectante: agente qumico capaz de matar formas vegetativas potencialmente
patgenas. Se utiliza sobre objetos inanimados.
Antisptico: sustancia que impide el desarrollo de los microorganismos y que se
utiliza sobre piel o mucosas.
Antibitico: cualquier compuesto qumico utilizado para eliminar o inhibir el
crecimiento de organismos infecciosos. Una propiedad comn a todos los antibiticos
es la toxicidad selectiva.
Asepsia: tcnicas orientadas a impedir la presencia de microorganismos patgenos en
objetos (ej. instrumental mdico) o reas determinadas.
Agentes antimicrobianos: interfieren en el crecimiento de la actividad microbiana:
3
o
o
Prctica N 1
BACTERICIDA, agente que mata bacterias.

BACTERIOSTATICO, agente que inhibe la multiplicacin de las bacterias por
detener algunos procesos fisiolgicos.
ANTIBIOGRAMA
En la actualidad estn disponibles una cantidad de agentes antibacterianos con el objeto de
controlar las enfermedades que las bacterias producen
Los antibiticos son sustancias qumicas producidas por microorganismos o derivados
semisintticos de stas, mientras que los quimioterpicos son productos de sntesis qumica,
pero ambos tienen la propiedad de estar dotados de actividad antibacteriana.
Todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos compuestos
antibacterianos. La evaluacin de esta sensibilidad ayuda a la seleccin del compuesto ms
adecuado para el tratamiento de una infeccin bacteriana. Las pruebas ms utilizadas para
evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente antibacteriano estn basadas en el
enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas concentraciones del agente.
Concentracin mnima inhibitoria (CMI) se define como la menor
concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepa
bacteriana dada.
Concentracin mnima bactericida (CMB) se define como la menor
concentracin de antimicrobiano capaz de destruir una cepa bacteriana dada.
El antibiograma por el mtodo de difusin en agar es una prueba en la que se enfrenta la
bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar con una solucin antibitica
absorbida en discos de papel de filtro. Este mtodo est estandarizado y los halos de
inhibicin han sido obtenidos correlacionndolos con las CMI y aparecen en unas tablas.
Hay varios factores que afectan al halo de inhibicin: la carga del antibitico en los discos, la
difusin del antibitico en el medio de cultivo, el tamao del inculo bacteriano, la composicin
y grosor del medio de cultivo, la velocidad del crecimiento bacteriano y el tiempo de
incubacin.
El inculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0,5 de la escala de McFarland,
8
aproximadamente 10 UFC/ml y ser preparado en solucin salina estril o caldo de cultivo.

Se puede trabajar en dos tipos de ensayos:
Ensayo cualitativo: un mismo cultivo se enfrenta a distintas soluciones antibiticas.
Ensayo cuantitativo: un mismo cultivo se enfrenta a un slo antibitico, preparado a distintas
concentraciones.
4
Prctica N 1
3. MATERIALES
Material
- Cultivo bacteriano de 24 horas
Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae
- 9 tubos de ensayo con caldo nutritivo (estriles)
- 4 placas petri con Agar Mueller Hinton (estriles)
- Hisopos estriles
- Asa de inoculacin
- Pinzas
Reactivos
Agentes qumicos:
-
Cloro
Amonio cuaternario
Alcohol 70
Antibitico
-
Gentamicina
Equipos
-
micropipetas
Bao mara
Autoclave
Congelador
4. MTODO
I) AGENTES FSICOS
Inocular 100 uL de suspensin bacteriana en los tubos de ensayo que contienen 2.9 mL de
caldo nutritivo.
TUBO
No.
AGENTE FSICO
PROCESO
EBULLICION
Someter a ebullicin por 1 minuto
2
3
Someter a ebullicin por 10 minutos

PASTEURIZACIN
4
5
Mantener en un bao a 65C por 30 minutos,

introducir el tubo de ensayo en un bao de hielo
Mantener en un bao a 90C por 15 segundos,
introducir el tubo de ensayo en un bao de hielo
CONGELACION
Congelar el tubo de ensayo por 24H
Prctica N 1
REFRIGERACION
Refrigerar el tubo de ensayo por 24H
CALOR
(ESTUFA)
CALOR HUMEDO Someter al tubo al proceso de esterilizacin por

(AUTOCLAVE)
autoclave (121C, 15 minutos)
CONTROL
SECO Mantener en la estufa un tubo de ensayo por 1

hora a 160C
SIN TRATAMIENTO
Una vez aplicado el tratamiento, INCUBAR LOS TUBOS y realizar las lecturas a las 24-48
horas. Reportar los resultados como crecimiento bacteriano +; -; +-
II) ANTIBIOGRAMA
1. Preparar el inculo._ Partiendo de un cultivo puro tomar con el asa de siembra X

colonias de la bacteria e introducirlas en el caldo de cultivo. La turbidez del inculo
debe equivaler al estndar 0.5 de McFarland.
Los patrones de Mc Farland se utilizan como patrones de turbidez en la preparacin de suspensiones
de microorganismos. El patrn 0.5 tiene una aplicacin especial en la preparacin de inculos
bacterianos para la realizacin de pruebas de sensibilidad. La frmula aproximada de preparacin
aproximada para este patrn por cada 10ml de agua purificada es (9.95 ml de Acido sulfrico 1% +
8
0.05ml de cloruro de bario 1%) y es equivalente a una concentracin bacteriana de 1.5 x 10 UFC /ml
2. Inocular la superficie de una placa de agar con el hisopo pasndolo uniformemente por
toda la superficie en tres direcciones. Por ltimo, pasar el hisopo por el reborde de la
placa de agar. Dejar secar 5 minutos.
3. Colocar los discos impregnados del agente qumico o la concentracin de antibitico
(5l) correspondiente sobre la superficie del agar utilizando unas pinzas estriles y
apretndolos suavemente sobre la superficie del agar. Los discos no deben estar a
menos de 15 mm de los bordes de la placa y lo bastante separados entre ellos para
que no se superpongan sus zonas de inhibicin. Dejar las placas 15 minutos a
temperatura ambiente para que comiencen a difundir los antibiticos.
4. Incubar la placa en posicin invertida a 37C durante 18-24 horas.
5. Medir los dimetros de los halos de inhibicin con una regla.
DESINFECTANTES:
Agujero No.
SUSTANCIA
Cloro
Amonio cuaternario
Alcohol 70
Agua
(control)
destilada
Prctica N 1
ANTIBITICO: Gentamicina a diferentes concentraciones

Agujero No.
SUSTANCIA
Gentamicina 40 ppm
Gentamicina 80 ppm
Gentamicina 160ppm
Agua destilada estril

(control)
5. CUESTIONARIO DE INVESTIGACIN
1.
Escribir el concepto y un ejemplo de desinfectantes de actividad alta, media y baja.
2.
Cul es la diferencia entre: bacteriosttico, bacterioltica, bactericida.
3.
Describir el mecanismo de accin de la gentamicina sobre el crecimiento bacteriano.
4.
qu es la validacin de un desinfectante? cmo se realiza?
6.BIBLIOGRAFA
-
Maturin, L. y Peeler, J.T. (1998) Bacteriological Analytical Manual, Edition 8, Revision

A. Chapter 3
Solano C. (2006) Microbiologa de alimentos (Guin de prcticas). Universidad

autnoma de Navarra. Disponible en
http://www.unavarra.es/genmic/micalm/manual%20practicas%20micalimentos.pdf
7. REGISTRO DE DATOS
7
Prctica N 1
AGENTES FSICOS
TUBO
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
AGENTE FISICO
PROCESO
RESULTADO
EBULLICION
ebullicin por 1 minuto

Someter a ebullicin por 10
minutos
PASTEURIZACIN 65C 30 minutos + bao de
hielo
90C 15 segundos, bao de
hielo
CONGELACION
Congelacin 24H
REFRIGERACION Refrigeracin 24H
CALOR
SECO 1 hora a 160C
(ESTUFA)
CALOR HUMEDO 12C, 15 minutos
(AUTOCLAVE)
AGENTES QUMICOS
DESINFECTANTES:
Agujero
No.
1
2
3
4
SUSTANCIA
Halo de
(mm)
inhibicin
Halo de
(mm)
inhibicin
ANTISEPTICOS Y ANTIBITICOS:
Agujero No.
SUSTANCIA
1
2
3
4
Gentamicina 20ppm
Gentamicina 40ppm
Gentamicina 80ppm
Control
MATERIA: MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS
Prctica N 2
MICROORGANISMOS QUE PRODUCEN ALTERACIN

DE ALIMENTOS
CADA GRUPO DEBE TRAER LAS MUESTRAS DESIGNADAS y debern ser
tradas en un recipiente con control de temperatura - coolers a temperatura de
refrigeracin en frascos estriles (frascos de vidrio -gatorade- limpios y
sometidos a un proceso de desinfeccin por ebullicin que se puede hacer en
casa).
TRAER ADEMS POR GRUPO UN ENVASE TETRAPACK DE LECHE

DESCREMADA UHT TOTALMENTE SELLADO
- NUEVO (LA
PRESENTACIN MS PEQUEA 100 o 200ml)
LAS MUESTRAS DE ALIMENTO
NO DEBEN SER COMPRADOS EN
SUPERMERCADOS O RESTAURANTES QUE ASEGURAN UNA BUENA CALIDAD

SINO DEBEN CONSEGUIRSE EN MERCADOS O CENTROS DE EXPENDIO DE
ALIMENTOS DE PREFERENCIA EN FORMA ARTESANAL
Prctica N 2
RECUENTO DE MICROORGANISMOS QUE PRODUCEN ALTERACIN DE ALIMENTOS
1. OBJETIVOS:
Determinar el nmero de microorganismos (UFC/ml-g) proteolticos y psicrfilos,

totales en diferentes muestras de alimentos.
Conocer el nmero de microorganismos anaerobios totales de diferentes muestras de
alimentos fermentados.
La presencia de microorganismos en los alimentos no significa necesariamente un peligro
para el consumidor o una calidad inferior de estos productos. A excepcin de un reducido
nmero de productos esterilizados, cada bocado de alimento contiene levaduras inocuas,
mohos, bacterias y otros microorganismos. La mayor parte de los alimentos se convierten en
potencialmente peligrosos para el consumidor slo despus de que han sido violados los
principios de higiene, limpieza y desinfeccin. Si los alimentos han estado sometidos a
condiciones que pudieran haber permitido la llegada a los mismos y/o la multiplicacin de
agentes infecciosos o toxignicos, pueden constituirse en vehculo de transmisin de
enfermedades, tales como la salmonelosis o la intoxicacin estafiloccica. La puesta en
evidencia de estos riesgos se basa en el examen de muestras de alimentos en busca de los
propios agentes causales o de indicadores de una contaminacin no admisible. Se denominan
microorganismos alterantes a aquellos que son responsables del deterioro y cambios en los
caracteres sensoriales de los alimentos.
Para la conservacin de alimentos con calidad ptima hasta su consumo, se debe impedir el
deterioro de su valor biolgico, nutritivo y organolptico. El mantenimiento de la higiene en una
planta elaboradora de alimentos es una condicin esencial para asegurar la inocuidad de sus
productos. En cada etapa de la cadena alimentaria, desde la produccin primaria hasta el
consumo, es necesario aplicar prcticas higinicas eficaces.
En alimentos como carnes, leche, frutas y verduras, pueden desarrollarse microorganismos
patgenos, (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa). Las medidas de prevencin deben
evitar que los alimentos frescos (leche, carnes) sean vehculo de los microorganismos
mediante un adecuado control (pasteurizacin de la leche, higiene en la obtencin de las
carnes, estricto control en la elaboracin de jugos). Debe vigilarse la contaminacin exgena
de los alimentos frescos y la recontaminacin de los ya procesados. La presencia de
microorganismos alterantes y patgenos puede explicarse por la aplicacin incorrecta en las
industrias de programas de limpieza-desinfeccin de las superficies y materiales en contacto
con la materia prima y el producto elaborado.
Los alimentos perecederos, como las carnes, huevo, pescado, leche, frutas y vegetales, son
deteriorados ms rpidamente por los microorganismos y requieren ms cuidado en su
manejo y almacenaje. Los alimentos semiperecederos, como las papas, manzanas, se
mantienen por ms tiempo sin mostrar deterioro, a menos que los manejen inadecuadamente.
Los alimentos estables o no perecederos, como la harina, azcar, alimentos secos,
generalmente no son deteriorados por microorganismos bajo condiciones apropiadas de
almacenaje.
10
Prctica N 2
MICROORGANISMOS MESFILOS:
La temperatura ptima de crecimiento de los organismos mesfilos oscila entre los 40 y 50 C

(generalmente es de 37 C). Segn su capacidad para atacar a los hidratos de carbono
pueden ser de dos tipos: proteolticos o putrefactivos y sacarolticos. Los primeros son
causantes de alteraciones gaseosas con degradacin del alimento y produccin de
compuestos de olor desagradable. stos son ms importantes en los alimentos de acidez baja
y media, excepto en el jamn york enlatado, en el cual se producen alteraciones de tipo
sacaroltico causadas por C. perfringens. Destacan C. hystolyticum, C. sporogenes y C.
bifermentans. Entre los de tipo sacaroltico los ms frecuentes son C. butyricum, C.
pasteurianum, C. perfringens y otros.
MICROORGANISMOS PSICRFILOS
En alimentos refrigerados y congelados se encuentran en nmero predominante los

microorganismos psicrfilos y psicrotrficos, tanto bacterias como mohos y levaduras. Se ha
encontrado que bacterias psicrotrficas causan alteracin de pescado congelado, productos
marinos frescos empacados al vaco, frutas frescas cortadas, leche refrigerada. Este tipo de
microorganismos producen reacciones proteolticas y lipolticas provocando la alteracin de
alimentos almacenados a baja temperatura, produciendo prdida de productos.
MICROORGANISMOS PROTEOLTICOS
Las bacterias proteolticas pueden descomponer los alimentos al degradar las protenas y
liberar productor indeseables. El recuento de estos microorganismos se lo realiza sembrando
las muestras por vaciado en placa, en un medio que contiene leche descremada que posee la
protena casena. Los microorganismos capaces de usar la casena son reconocidos como
proteolticos
Las bacterias proteolticas producen hidrlisis de las protenas, transformando la casena en
compuestos solubles de nitrgeno, alterando el sabor y la textura de los productos
Las especies proteolticas presentan la peculiaridad de que pueden desdoblar las molculas
nitrogenadas de mayor tamao en los alimentos. De este modo, estas especies de bacterias
posibilitan la existencia y proliferacin de otras especies no proteolticas o dbilmente
proteolticas que utilizan el nitrgeno de los compuestos de degradacin originados por el
ataque de las protenas.
ANAEROBIOS
Anaerobios son aquellos grmenes que slo pueden desarrollarse en ausencia de cantidades
significativas de oxgeno (O2) y bajo condiciones de potenciales redox (Eh) muy reducidos, por
tanto son estrictos en cuanto a sus exigencias de medio ambiente. Las formas vegetativas
mueren cuando son expuestos al oxgeno molecular libre en la atmsfera, aunque el grado de
resistencia bajo estas condiciones es variable (aerotolerancia). Las esporas bacterianas no
son afectadas por tratarse de formas biolgicas metablicamente inertes y con muy escasa
proporcin de agua en su composicin.
La sensibilidad frente al oxgeno vara ampliamente de una especie a otra. Se distinguen
bacterias microaerfilas, aerotolerantes y anaerobios estrictos u obligados.
Las bacterias microaerfilas resultan daadas por niveles altos de oxgeno como el
atmosfrico (21%) y requieren niveles bajos de O2 para crecer, en el rango de 2 a 10%.
Anaerobios aerotolerantes son aquellos microorganismos que toleran exposiciones breves
al oxgeno atmosfrico, se desarrollan ptimamente en condiciones anaerobias.
Los anaerobios estrictos no toleran el oxgeno y mueren en su presencia, por tanto slo se
11
Prctica N 2
desarrollan en condiciones anaerobias.

Los anaerobios en general poseen un metabolismo de tipo fermentativo, en el cual sustancias
orgnicas son los aceptores finales de electrones, aunque tambin pueden obtener energa a
partir de la respiracin anaerobia. Otras caractersticas comunes a los microorganismos
anaerobios son sus requerimientos nutricionales complejos, su lento crecimiento y su labilidad,
lo cual, sumado a sus requerimientos atmosfricos estrictos (de O2 y CO2) hace que su
aislamiento sea difcil; adems, al ser la mayora de las infecciones mixtas (aerobios y
anaerobios) otros microorganismos menos exigentes y de crecimiento ms rpido pueden
crecer e inhibirlos si no se toman las precauciones necesarias.
Las bacterias anaerobias estn diseminadas en la naturaleza. La mayora de las bacterias
anaerobias que causan infecciones en humanos son parte de la flora normal de piel y
mucosas, superando en cantidad a las bacterias facultativas en el intestino por un factor de
1000:1, mientras que en piel, boca, vas areas superiores y tracto genital inferior femenino la
relacin anaerobios-facultativos es de 5-10:1. Otros patgenos anaerobios como Clostridium
botulinum y Clostridium tetani se encuentran en suelos y no son considerados parte de la flora
humana.
El gnero Clostridium est formado por ms de cien especies con limitada relacin gentica y
propiedades bioqumicas diversas. Comprende a bacilos grampositivos, anaerobios,
esporulados. Son ubicuos pudiendo ser encontrados en el suelo y aguas residuales as como
tambin en la flora intestinal de hombres y animales. En su mayora son saprofitos, pero los
patgenos pueden causar graves enfermedades como gangrena gaseosa, botulismo, ttanos,
infecciones de piel y partes blandas, colitis asociada a antibiticos e intoxicaciones
alimentarias. La capacidad para provocar enfermedad est vinculada a la posibilidad de
sobrevivir en condiciones ambientales adversas mediante la formacin de esporas, crecer
rpidamente y producir toxinas histolticas, enterotoxinas y neurotoxinas.
SULFITORREDUCTORES
Este grupo de microorganismos se caracterizan por ser esporulados, anaerobios. Pueden

proceder del intestino del hombre o de los animales
Se trata de FORMAS ESPORULADAS = forma de resistencia que no es indicativo de
contaminacin reciente. No tiene inters para indicar contaminacin fecal, nos indican
deficiencias higinicas por contaminacin telrica.
Pseudomonas
Las bacterias del grupo al que pertenecen las Pseudomonas estn constituidas por
microorganismos Gram-negativos, mviles con flagelacin polar. Se encuentran normalmente
en el suelo, aunque pueden ser patgenos oportunistas en animales (P. aeruginosa) y
patgenos de plantas (P. syringae). Su metabolismo es siempre respiratorio, o bien aerobio (la
mayora usa como aceptor de electrones O2) o anaerobio (algunos usan NO-).
Algunas bacterias de este grupo producen pigmentos fluorescentes de colores amarilloverdosos fcilmente solubles en agua. Estos pigmentos actan como siderforos: molculas
cuya funcin es capturar el hierro del medio necesario para el metabolismo del
microorganismo
Actividad como patgenos vegetales: La especie P. syringae es un verdadero parsito
vegetal. Las especies del gnero Xanthomonas tambin son en su mayora patgenos
vegetales.
12
Prctica N 2
Actividad como agentes alterantes de alimentos: Las Pseudomonas son el grupo de

bacterias ms frecuente en los alimentos frescos. Debido a su gran potencial metablico, las
bacterias de estos grupos son agentes importantes en la alteracin de alimentos. Sin
considerar los aspectos de deterioro de vegetales producidos por diferentes especies de este
grupo. Las Pseudomonas son uno de los principales gneros responsables de la alteracin de
productos crnicos almacenados incorrectamente en condiciones de aerobiosis. Algunas
bacterias del grupo son psicrfilas por lo que la alteracin de los alimentos que producen
tambin tiene lugar durante la conservacin en refrigeracin. Cuando piezas de alimentos
crnicos son conservadas en refrigeracin en ambientes impermeables al gas o en vaco, las
Pseudomonas pueden producir H2S que reacciona con la hemoglobina dando lugar a la
aparicin de manchas verdes.
Deterioro de vegetales:
Los mayores causantes de deterioro son las bacterias del gnero Erwinia y algunas
Pseudomonas que producen pectinasas capaces de romper la capa exterior de los vegetales
y colonizar as los tejidos internos.
Deterioro productos crnicos:
En las canales se puede producir deterioro superficial debido a hongos y a levaduras; sin
embargo, en carnes procesadas, picadas, el deterioro es debido a bacterias del grupo de
Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella nicamente.
En el caso de filetes o piezas cortadas conservadas a baja temperatura, el deterioro puede
producirse por bacterias u hongos dependiendo de la humedad ambiental (bacterias a alta
humedad).
El crecimiento de bacterias (sobre todo Pseudomonas) puede detectarse primero por la
aparicin de colonias discretas, luego mal olor y luego un capa de limo que cubre la pieza y
que se produce por la coalescencia de las colonias.
Deterioro de carnes envasadas y otros productos:
La formacin de limo tiene lugar en la superficie y se debe predominantemente a las bacterias
lcticas; el agriado ocurre bajo la superficie y es consecuencia de la actividad de las bacterias
lcticas sobre productos que contengan lactosa. La formacin de color verde se debe a la
produccin de perxidos o de H2S por algunas bacterias y tiene lugar en el interior de las
piezas.
El enverdecimiento producido por perxidos es debido a bacterias lcticas, y el producto verde
no es peligroso desde el punto de vista toxicolgico. El enverdecimiento debido a H2S se
produce por una reaccin con la hemoglobina causada por Psedomonas o algunas bacterias
lcticas.
Deterioro de productos lcteos:
El deterioro de leche no pasteurizada se produce rpidamente debido a su alta carga
microbiana. En la pasteurizada el deterioro se debe a estreptococos termorresistentes.
En el caso de mantequilla el deterioro se puede producir como putrefaccin debido a
Pseudomonas putrefaciens o por enranciamiento debido a actividades lipolticas de algunas
bacterias de tipo Pseudomonas o bacterias lcticas; aunque el deterioro ms frecuente de la
mantequilla es el producido por hongos.
Tanto en el caso de bacterias como en el de hongos, el deterioro puede iniciarse incluso antes
de la recoleccin y se ve favorecido por cualquier circunstancia que altere la integridad fsica
del vegetal (porque as se permite la entrada de los microorganismos al interior).
13
Prctica N 2
MOHOS
Los hongos son microorganismos eucariontes heterotrficos que poseen una estructura muy
poco diferenciada llamada talo. La complejidad de esta estructura es muy variable. Los
hongos se reproducen asexualmente mediante formacin de esporas o yemas; algunos
hongos tambin producen esporas sexuales no para reproducirse sino como medida de
proteccin.
En comparacin con las bacterias, los hongos son de mayor tamao, forman estructuras ms
complejas y sus clulas poseen ncleo. Son microorganismos aerbicos y generalmente
crecen ms lentamente que las bacterias. Se desarrollan formando estructuras filamentosas
denominadas micelio que son fciles de ser detectadas visualmente. Tienden a crecer en el
intervalo mesfilo o psicrotrofo. Generalmente toleran condiciones cidas y osmticas.
Los mohos invaden con rapidez cualquier sustrato, gracias a su eficacia en la diseminacin,
un crecimiento rpido y a que poseen una rica carga enzimtica.
Mohos como alterantes de los alimentos
La alteracin de los alimentos por mohos se debe a las modificaciones que estos producen
durante su desarrollo. Toman del sustrato todos los elementos que les son necesarios para
sus procesos vitales, transformndolos gracias a sus mltiples sistemas enzimticos.
Las reacciones producidas en los alimentos como consecuencia del metabolismo de los
hongos se pueden concretar en:
o Hidrlisis
de
polisacridos
estructurales
(sustancias
pcticas,
hemicelulosas, celulosas) o reserva (almidn), por medio de enzimas
hidrolticas (celulosas, amilasas, etc.)
o Hidrlisis de protenas, por proteinasas
o Hidrlisis de las grasas, por lipasas
o Reacciones de oxido-reduccin, realizadas por medio de oxidasas,
peroxidasas, deshidrogenasas, etc.
Las modificaciones qumicas producidas en los alimentos por los mohos se traducen en
alteraciones del valor nutritivo o de sus caractersticas sensoriales, en dificultades de
conservacin y a veces en enfermedades (micosis, alergias) e intoxicaciones (micotoxinas)
LEVADURAS
Los cambios indeseables producidos por las levaduras que contaminan los alimentos se
manifiestan de dos formas:
Una puramente esttica, debido a la presencia fsica de levaduras (turbidez o formacin de
pelculas en la superficie de los lquidos).
Otra, ms profunda, resultado del metabolismo de las levaduras que puede provocar
manifestaciones tales como: aumento de pH, aromas particulares, etc.
Las levaduras para su crecimiento necesitan oxgeno, fuentes orgnicas de carbono y
nitrgeno mineral u orgnico, diversos minerales, adems de varias vitaminas y otros factores
del crecimiento.
Utilizan numerosos sustratos carbonatados, bien por va oxidativa nicamente o, como pasa
en la mayora de los casos, por va fermentativa, despus de una fase inicial del crecimiento
aerbico.
14
Prctica N 2
La presencia de una cantidad de levaduras y mohos no es deseable en los alimentos, excepto

en los quesos madurados por mohos.
Pese a lo expuesto anteriormente, es importante recalcar que algunos hongos son
beneficiosos ya que se utilizan en fermentaciones de alimentos. La levadura Saccharomyces
cerevisiae se usa en panadera y en fermentaciones alcohlicas; los mohos: Penicillium spp.
participa en la maduracin de los quesos Camembert y azules y Mucor spp. es la fuente del
cuajo microbiano
3. MATERIALES
balanza
incubadora
botella y tubos con agua peptonada
pipetas
placas petri
contador de colonias
Agua peptonada
Agar PCA
Agar MRS
Agar Pseudomonas F
Agar Saboraud
Cristal Violeta
Azul de Lactofenol
4. MTODO
I.
PROTEOLITICOS VIABLES
Pesar aspticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente
Prepare las diluciones hasta 10-4
Aspticamente deposite alcuotas de 1ml cada dilucin en su placa correspondiente
(10-2, 10-3, 10-4 )
Aada 2ml de leche descremada estril a cada placa.
Aada a cada placa medio fundido PCA (50C)
Homogenice las placas en el agitador, dejar solidificar
Prepare una placa testigo del medio sin muestra (medio + leche), divida en dos
sectores y en uno de ellos siembre E. coli esta placa servir como testigo
Incube las placas a 37C entre 24 48 horas
Revelar la presencia de microorganismos proteolticos, adicionando a las placas una
solucin de HCl al 1% o cido actico al 1%, dejar por 1 minuto, vaciar el exceso de
cido, lavar con agua corriente.
Una vez transcurrido el tiempo de incubacin realice el conteo solo de las colonias
proteolticas (las que muestren un rea clara alrededor, por degradacin de la
casena), compare con la placa testigo
Determine el nmero de bacterias proteolticas / g de muestra
15
Prctica N 2
II.
PSICROTROFICOS VIABLES
Prepare las diluciones, 10-1 ,10 -2 y 10-3
Inocular por la tcnica de vertido
Aadir el agar PCA temperado y homogenizar.
Incubar 5 das / 5C
Reportar los resultados.
III.
ANAEROBIOS
Prepare las diluciones, 10-2 ,10 -3 y 10-4
Inocular por la tcnica vertido.
Aadir el agar PCA temperado y homogenizar
Incubar en la jarra de anaerobiosis durante 48 horas a 37C o en su defecto aplicar la
tcnica de sandwich que consiste en aadir una capa de agar virgen a la placa en la
que se ha sembrado por vertido una vez que el agar ha solidificado.
IV.
RECUENTO DE Pseudomonas
Preparar diluciones, 10-1 , 10 -2 y
10-3
Inocular por la tcnica de EXTENSIN o superficie, 0.1 ml de cada dilucin en las
placas Petri con Agar Pseudomonas F
Incubar 24H 30C
Contar las colonias tpicas de Pseudomonas.
Si no hay crecimiento a las 24H dejar 24H ms de inoculacin.

Identificacin:
Observar la produccin de fluorescencia en las colonias de las placas en las que se reporte
crecimiento
V.
MOHOS Y LEVADURAS
Recuento:

Preparar las diluciones, 10-1 ,10 -2 y10-3
Inocular por la tcnica de vertido en placas Petri
Aadir el agar Saboraud + 40ppm gentamicina y homogenizar.
Incube las placas boca arriba a 25C durante 3 5 das
Reportar los resultados.
Identificacin:
Levaduras
1. Recoja a partir de cualquier placa tres colonias de levaduras, representantes de
diferentes morfologas. Transfiera una porcin de colonia a una gota de agua sobre un
portaobjeto
2. Realice un frotis con la muestra (extensin, secado, fijacin)
16
Prctica N 2
3. Haga una tincin simple (cristal violeta por 60 segundos)

4. Examine las clulas utilizando en lento con aceite de inmersin (100x). Dibuje la
morfologa celular de las levaduras
Mohos
1. Coloque una gota del colorante azul de lactofenol en un portaobjetos
2. Toque suavemente la superficie de una colonia de moho con la parte adhesiva de un
pedazo de cinta. Coloque la cinta en la gota de colorante.
3. Examine el portaobjeto al microscopio. Dibuje la morfologa del moho. Si la tincin ha
sido correcta se puede observar el micelio y las estructuras reproductoras.
4. Compare sus observaciones con cada una de las especies indicadas en el manual de
hongos
5. Repita estos pasos en tres colonias de mohos de distinta morfologa
1. Qu composicin tiene el agar tributirina que permite el crecimiento de
microorganismos lipolticos?
2. Escribir dos ejemplos de microorganismos del grupo de sulfito reductores, indicar el
medio de cultivo que se utiliza para su recuento.
3. Las bacterias alterantes de alimentos pueden comportarse como patgenos
oportunistas?
4. Cul es el procedimiento para la identificacin de hongos por la clave de Barnet?
5. Por qu se aade gentamicina al agar Saboroud para el aislamiento y recuento de
mohos y levaduras?
6. Sealar tres medios de cultivo para el recuento y aislamiento de hongos y comparar su
composicin qumica.
6.BIBLIOGRAFA
-
Gonzlez-Velsquez, G.H. y Holgun.-artnez, G. (1990) Manual sobre tcnicas

microbiolgicas. Universidad de Antioquia. Colombia
Aquiahuatl-Ramos, M.A. Y Prez Chabela, M.L. (2008) Manual de Prcticas.
Laboratorio Microbiologa General. Departamento de Biotecnologa. Universidad
Autnoma Metropolitana.
Olives E., Alarcn L. (2004) Manual de prcticas de microbiologa bsica y
Microbiologa de Alimentos. Universidad de Juarez
DESCRIPCIONDE LA MUESTRA
17
Prctica N 2
DATOS GENERALES
Muestra
Condiciones de conservacin
Nombre y lugar del expendedor
Fecha y hora de toma de la
muestra.
Responsable de muestreo
CARACTERSTICAS ORGANOLPTICAS
Consistencia
Olor
Color
TRANSPORTE DE LA MUESTRA
Congelada _______
Refrigerada ________
T ambiente ______
Tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta

el anlisis:
CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA
Proceso tecnolgico al que fue
sometido
ANALISIS REALIZADO
DATOS GENERALES
Muestra
muestra.
Consistencia
Olor
Color
Congelada _______
T ambiente ______

el anlisis:
sometido
18
Prctica N 2
ANALISIS REALIZADO
1.1.
RECUENTO DE MICROORGANISMOS PROTEOLITICOS VIABLES
DILUCION
No. colonias
PROMEDIO
RESULTADO
No. UFC / g de muestra
1.2.
RECUENTO DE MICROORGANISMOS PSICROTROFICOS VIABLES
DILUCION
No. colonias
PROMEDIO
RESULTADO
1.3.
Resultado
RECUENTO DE MICROORGANISMOS MOHOS Y LEVADURAS
DILUCION
No. colonias
PROMEDIO
RESULTADO
1.4.
Resultado
Resultado
RECUENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS
DILUCION
No. colonias
PROMEDIO
RESULTADO
UFC / g de muestra
Resultado
REPORTE DE RESULTADOS
ANALISIS
SOLICITADO
METODO
ANALISIS
DE RESULTADO
VALORES
NORMA
REFERENCIALES
19
Prctica N 2
*Anlisis solicitado: colocar los ensayos realizados en el laboratorio

*Metodo de anlisis: el nombre del mtodo aplicado
*Resultado: los valores obtenidos SIN UNIDADES
*Valores referenciales: los valores que da la norma INCLUYEN UNIDADES
*Norma: nombre o nmero de la norma. Si se consulta en normas que no constan en el
laboratorio, debe adjuntarse el documento en el informe.
20
Prctica N 3
MICROORGANISMOS INVOLUCRADOS EN TOXICOINFECCIONES ASOCIADAS A

ALIMENTOS (E. coli y B. cereus)

casa).

- NUEVO (LA

21
Prctica N 3

ALIMENTOS (E. coli y B. cereus)
1. OBJETIVOS:
Realizar el recuento aislamiento e identificacin de E. coli y B. cereus en diferentes

muestras de alimentos
Comparar los resultados obtenidos con las normas de requisitos microbiolgicos
respectivos.
Las Enfermedades transmitidas por Alimentos (ETAS) se definen como cualquier
enfermedad causada por la ingestin de un alimento contaminado que produce efectos
nocivos en la salud del consumidor. Estos trastornos fsicos son provocados por el consumo
de alimentos y de agua contaminados con clulas de bacterias patgenas viables (o esporas)
o de alimentos que contienen toxinas producidas por bacterias y mohos toxignicos
El control de alimentos y bebidas se basa en dos pilares: la inspeccin y el anlisis de
laboratorio. El anlisis microbiolgico, se utiliza para establecer si el agua o alimento es
inocuo y tomar decisiones acertadas para proteger la salud pblica; hacindose necesaria una
adecuada interpretacin y anlisis de resultados, para poder brindar soluciones frente a
determinados problemas de la industria y ofrecer seguridad al productor y consumidor final.
Indicadores microbiolgicos: Coliformes
Las bacterias coliformes son aerobias o facultativas anaerobias, gram negativas, no

formadoras de esporas, tienen forma bacilar y fermentan la lactosa con la produccin de cido
y gas en 48 horas a 35 grados centgrados.
Las reacciones bioqumicas y la morfologa de las clulas es similar a la de Escherichia coli
para todos los miembros de este grupo.
Se diferencian de otros grupos de microorganismos por su capacidad de crecer en medios
que contienen sales biliares (o agentes selectivos equivalentes) y por la utilizacin de la
lactosa como fuente de carbono con la produccin de cido y gas en 48 horas a 35 grados
centgrados. La fermentacin de la lactosa se da independientemente de la presencia o
ausencia de sales biliares que son usadas para inhibir el crecimiento de microorganismos no
entricos.
Coliformes fecales: coliformes de origen fecal que pertenecen al grupo anterior y que, adems
son capaces de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas a 44C en un tiempo
mximo de veinticuatro horas.
Escherichia coli: bacterias coliformes generalmente indol positivas, citrato negativas, rojo de
metilo positivas, no producen acetilmetilcarbinol y son capaces de fermentar la lactosa con
produccin de cido y gas entre 37C y 44C en un tiempo mximo de veinticuatro horas.
El hallazgo de gran nmero de organismos en los alimentos y en el agua indica la polucin o
contaminacin fecal. Ya que las enfermedades transmitidas por el agua generalmente son de
carcter intestinal, la presencia de polucin indica la posibilidad de que existan agentes
22
Prctica N 3
etiolgicos productores de estas enfermedades.

Los coliformes comprenden tres gneros: Escherichia, Klebsiella y Enterobacter. Son
habitantes comunes del tracto intestinal por lo que su presencia en los alimentos puede indicar
una contaminacin fecal, suelen ser considerados microorganismos indicadores. Sin embargo
los coliformes que se encuentran en los alimentos pueden tener un origen fecal o no por lo
que el recuento de coliformes debe interpretarse con mucha cautela. La presencia de
coliformes no tiene necesariamente relacin con una contaminacin de origen fecal y
consiguientemente, con la posible presencia en los alimentos de microorganismos patgenos
de procedencia entrica, sino que es slo una indicacin de deficiencias o fallos en el
tratamiento industrial de los alimentos.
Se utiliza a veces tambin la denominacin "coliformes fecales" refirindose a los
microorganismos que crecen y producen gas a partir de la lactosa en un medio que contiene
sales biliares u otros agentes selectivos, equivalentes y que se incuba a 44-45.5 C.
Hay tres fases para el anlisis de coliformes en agua y alimentos:
a) Prueba presuntiva: Estima el recuento presuntivo de coliformes ya que pueden
enumerarse tambin las colonias que son similares a las de coliformes. Si un recuento
presuntivo de coliformes es bajo, el analista puede considerar que el producto es
aceptable en relacin con esta prueba y puede decidir no realizar ms anlisis. En
caso de recuentos elevados debe pasar al segundo nivel analtico
b) Prueba confirmativa: Se realiza para confirmar el recuento obtenido en el test
presuntivo. Si la prueba presuntiva se bas en la deteccin del gas producido por las
bacterias fermentadoras de lactosa, la prueba confirmatoria puede implicar la
deteccin de la formacin de cido en condiciones ms selectivas
c) Prueba concluyente complementaria: puede estar destinada a comprobar si los
coliformes encontrados son o no de origen fecal o para comprobar que E. coli est
representado entre los microorganismos del recuento confirmado de coliformes
Contaminacin del agua
La contaminacin es un proceso de alteracin o de modificacin ms o menos importante de
los equilibrios fsicos, qumicos o biolgicos del agua que son responsables de su calidad y la
hacen inadecuada para sus numerosos usos y aplicaciones. Dicha contaminacin puede tener
dos orgenes: qumico o microbiolgico. El agua natural constituye un reservorio de
microorganismos autctonos (Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus) o exgenos (Escherichia
coli, Enterococcus). El agua recibe y arrastra partculas cargadas de bacterias, por lo que en
cercanas de las grandes poblaciones incluso el agua de lluvia es portadora de un elevado
nmero de microorganismos.
El anlisis microbiolgico por recuento de bacterias indicadoras de contaminacin fecal en
aguas es de suma importancia al evaluar el estado sanitario del sistema en estudio. Debido a
que la concentracin de microorganismos en el agua habitualmente es baja, su deteccin
directa es complicada, por la cual se utiliza, entre otras, a las bacterias coliformes, que son de
fcil deteccin y cultivo en laboratorio y presentan un tiempo de supervivencia que excede al
de los patgenos en ese ambiente.
Dentro de los mtodos de recuento de bacterias se encuentran dos que son los ms
ampliamente utilizados: la tcnica de Nmero Ms Probable (NMP) y la tcnica de recuento en
placa. Con la primera slo se obtiene una estimacin de la poblacin de microorganismos
contenidos en una muestra, no proporcionando una enumeracin precisa. Cuando la
poblacin es muy elevada, el recuento en placa supera en precisin a este mtodo. Por el
23
Prctica N 3
contrario en poblaciones bajas (menos de 10 clulas por mL) es ms eficaz la tcnica de NMP
porque permite la utilizacin de muestras de mayor tamao.
Procedimiento de muestreo para anlisis microbiolgico de agua:
Para tomar muestras para un anlisis microbiolgico de agua se debe contar con los
siguientes materiales:
1.
Alcohol 70
2.
Guantes
3.
Botella estril (*)
4.
Gel-pack o hielo (cooler, hielera)
(*) Si no se cuenta con botella estril, se pueden esterilizar las botellas con tapas en un
recipiente con agua hirviendo durante 20 minutos a bao trmico.
Procedimiento de toma de muestra:
1. Se procede a rociar con abundante cantidad de alcohol la llave de la cual se va a tomar la
muestra. Si es una manguera, el alcohol se roca desde la punta hacia dentro de la
manguera. Si la muestra es de un estanque, laguna, ro o mar, se omite este procedimiento.
2. Se rocan las manos con guantes con gran cantidad de alcohol.
3. Se abre la llave y se deja correr gran cantidad de agua por lo menos por 30 segundos.
4. Se abre la tapa de la botella estril y se llena la botella con la muestra de agua a analizar.
No se debe rebalsar de agua la botella de muestreo.
5. Se tapa rpidamente la botella.
6. Se refrigera la muestra entre 2 a 6 C o se almacena en cooler con gel-pack o hielo, por no
ms de 24 horas antes del anlisis.
Rotulado de la muestra:
Cada frasco llevar un rtulo donde se har constar el Nombre del establecimiento, No. de
grifo dentro del plano presentado; lugar de toma de muestra, fecha, hora, responsable de la
extraccin y todo otro dato importante para su identificacin.
Acondicionado y Transporte de la Muestra:
La muestra debe estar debidamente acondicionada con hielo o conservadores de fro y se
realizar lo ms rpido posible su anlisis. Se recuerda que con una adecuada refrigeracin
se evita la reproduccin de bacterias, de all su importancia.
No se debe congelar la muestra.
Chequear la debida identificacin de todos los envases antes de analizarlos.
La muestra debe llegar al Laboratorio lo antes posible (menos de 1 (un) da a partir del
muestreo).
Bacillus cereus
Es un bacilo formador de esporas responsable de intoxicaciones alimentarias, siendo su

hbitat natural el suelo, contamina con frecuencia cereales, leche, budines, cremas
pasteurizadas y especias, entre otros alimentos.
La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) estima que las enfermedades causadas por
alimentos contaminados constituyen uno de los problemas sanitarios ms difundidos en la
actualidad. Los casos de intoxicaciones o enfermedades por alimentos mal preparados o
contaminados por este microorganismo suelen ser frecuentes a pesar de que son
perfectamente evitables; la primer descripcin de un brote de gastroenteritis data de principios
de 1900.
Bacillus cereus produce dos enterotoxinas durante su crecimiento exponencial: la toxina
diarreica y la toxina emtica que dan lugar a dos formas clnicas distintas de intoxicacin
24
Prctica N 3
alimentaria. Los sntomas de la toxicoinfeccin tienen dos formas de presentacin con

presencia de diarrea, dolores abdominales y vmitos. Su perodo de incubacin vara de 4 a
16 horas luego de la ingesta del alimento contaminado.
La resistencia trmica de esporas de B. cereus en un medio con elevado contenido de agua
vuelve a este microorganismo un potencial peligro para el desarrollo de una intoxicacin, si las
medidas higinico sanitarias y de elaboracin no son las adecuadas.
La intoxicacin alimentaria puede ocurrir cuando los alimentos son preparados y mantenidos
sin la adecuada refrigeracin durante horas antes de ser servidos. El consumo de alimentos
que contienen 105 B.cereus/g o ms puede provocarla. Los alimentos vinculados a brotes han
sido carne y verduras cocidas, arroz frito o hervido, crema de vainilla, sopas, leche y brotes de
vegetales crudos.
El sndrome emtico est producido por una toxina preformada y termoestable, al igual que la
de S.aureus. Se asocia frecuentemente con arroz frito contaminado, tiene un perodo de
incubacin corto, habitualmente de 1 a 6 horas y predominan los sntomas gastrointestinales
altos manifestados por nuseas y vmitos. Este hecho ha llevado a confundir la intoxicacin
por B.cereu y atribuirla a S.aureus. El sndrome diarreico por el contrario, est producido por la
ingestin de alimentos inadecuadamente refrigerados. Resulta de la esporulacin del
organismo in vivo y de la produccin de una enterotoxina diferente de la anterior, preformada y
termolbil tiene un perodo de incubacin ms largo que promedia entre 10 y 12 horas y las
manifestaciones se relacionan con la afectacin gastrointestinal baja similar a la intoxicacin
por Clostridium perfringens
Los sntomas son dolor abdominal, diarrea acuosa profusa, tenesmo y nauseas que
generalmente duran 12-24 hrs. y en algunos pacientes pueden durar ms tiempo, de 2 a 10
das. La intoxicacin alimentaria por Bacillus cereus es autolimitada y no requiere tratamiento
antimicrobiano, el tratamiento es sintomtico y ocasionalmente es necesario rehidratacin.
3. MATERIALES
tubos para diluciones (con diluyente)

pipetas estriles
tubos con BGBL con campana de Durham
pera
gradilla
BGBL
EMB
Pruebas bioqumicas: RM, VP, Indol y Citrato
Asas y agujas de inoculacin
Caldo lactosado
Frasco y tubos con diluyente
Agar MYP
Equipos:
Vortex
Balanza
incubadora
25
Prctica N 3
4. MTODO
Preparacin de diluciones

Preparar diluciones, 10-1
, 10 -2
y
10-3 utilizando los tubos con 9 ml de
diluyente
Recuento de bacterias del grupo coliforme segn la tcnica de NMP
I) COLIMETRA PRESUNTIVA
1- Disponer de 1 serie de tres tubos con 9 mL cada uno de Caldo BGBL (Bilis Lactosa
Verde Brillante). Todos deben poseer en su interior una campana de Durham.
2- Realizar tres diluciones sucesivas de la muestra.
3- Sembrar 1 mL de la muestra en cada uno de los tubos.
4- Incubar los tubos durante 24 horas a 37C.
5- Contar los tubos que posean gas en el interior de la campana de Durham. Dichos
tubos sern considerados positivos.
6- Buscar en la tabla el NMP de bacterias coliformes totales/100 mL de muestra.
En caso de NO encontrar tubos positivos dejar las muestras 24 horas ms de
incubacin.
II) COLIMETRA CONFIRMATIVA
1. De los tubos positivos de la colimetra presuntiva sembrar por estriado en Agar EMB.
2. Incubar 24 horas a 37C.
3. Ver colonias aisladas y sospechosas de E. coli.
4. Realizar una tincin Gram de estas colonias.
III) COLIMETRA COMPLEMETARIA
1. A las colonias aisladas y sospechosas de E. coli resembrar en agar Mac Conkey e
incubar a 37C durante 24 horas.
2. De estas ltimas realizar las pruebas de IMViC: Indol, Rojo Metilo, Voges-Proskauer,
Simmons citrato. Para ello preparar tubo de Caldo nutritivo, RM-VP y Simmons citrato.
3. Incubar 24 horas a 37C.
4. Leer resultados.
Bacillus cereus
RECUENTO
1. Pesar aspticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente
2. Hacer diluciones, 10-1 , 10 -2 y
10-3
3. Inocular por la tcnica de EXTENSION 0,1 ml de cada dilucin en las placas Petri con
agar MYP.
4. Incubar 24h 37C
5. Contar las colonias tpicas de B. cereus
IDENTIFICACIN
1. Realizar tincin coloracin Gram
2. Realizar tincin de esporas
3. Resistencia al NaCl y consumo de manitol: resembrar en Agar Sal y Manitol, incubar
24H/37C. Leer los resultados.
26
Prctica N 3
4. Licuefaccin de la gelatina: sembrar por picadura en agar gelatina, incubar 24H/37C,

retirar de la incubadora y colocar 30 minutos en la heladera. Si el medio se mantiene
lquido el resultado es positivo, caso contrario es negativa la licuefaccin de la gelatina.
5. Hidrlisis del almidn: hacer una estra en una placa con agar almidn, incubar
24H/37C. aadir unas gotas de lugol para revelar la presencia de almidn alrededor
de la estra, si se tie de color morado alrededor de la estra es un resultado negativo
debido a que la bacteria no consumi el almidn.
1. Cul es la diferencia entre colonias manitol + y manitol - en agar MYP?
2. Cul es la diferencia entre indicador e ndice microbiolgico?
3. Cmo se identifica la E. coli H7 O157?
4. Qu significado tiene la H y la O de la clasificacin bacteriana?
6.BIBLIOGRAFA
-
Apella y Araujo (sin fecha). Solar safe water. Microbiologa del agua. Conceptos
bsicos. En lnea: www.ine.es/normativa/leyes/incinor.htm
Aquiahuatl-Ramos, M.A. Y Prez Chabela, M.L. (2008) Manual de Prcticas.
Annimo. (sin fecha). Manual de Microbiologa. Departamento de Microbiologa y
Gentica. Universidad de Salamanca.
E. coli
Descripcin de la muestra
DATOS GENERALES
Muestra
muestra.
Consistencia
Olor
Color
Congelada _______
T ambiente ______
27
Prctica N 3
el anlisis:
sometido
ANALISIS REALIZADO
COLIMETRA PRESUNTIVA (NMP):
Combinacin de tubos positivos
NMP =
COLIMETRA CONFIRMATIVA:
Caractersticas de las colonias (Agar Mac Conkey):
COLIMETRA COMPLEMENTARIA:
PRUEBA
Produccin de Indol
Uso del citrato
Rojo metilo
Voges Proskauer
RESULTADO
Bacillus cereus
DATOS GENERALES
Muestra
muestra.
Consistencia
Olor
Color
Congelada _______
T ambiente ______
el anlisis:
sometido
ANALISIS REALIZADO
Recuento
28
DILUCION
No. colonias
PROMEDIO
RESULTADO
Prctica N 3
Resultado
REPORTE GENERAL DE RESULTADOS

ANLISIS
MUESTRA MTODO
SOLICITADO
DE
ANLISIS
Coliformes
totales
Coliformes
fecales
E. coli
RESULTADO
VALORES
REFERENCIALES
NORMA
B. cereus
*Metodo de anlisis: el nombre del mtodo aplicado
*Norma: nombre o nmero de la norma.
29
Prctica N 4

ALIMENTOS

casa).

- NUEVO (LA

TRAER DOS BISTURIES (NUEVOS ESTRILES)
30
Prctica N 4
MICROORGANISMOS INVOLUCRADOS EN TOXICOINFECCIONES ASOCIADAS A ALIMENTOS

Salmonella y S. aureus
1. OBJETIVOS:
Realizar el recuento aislamiento e identificacin de Salmonella y S. aureus en diferentes

muestras de alimentos
Comparar los resultados obtenidos con las normas de requisitos microbiolgicos respectivos.
Salmonella
Salmonella pertenece a la Familia Enterobactereaceae, al Gnero Salmonella.

Es un bacilo Gram (-) aerobio y anaerobio facultativo, producen cido a partir de la glucosa y son
generalmente aerognicos.
Clasificacin
Salmonella entrica
I-S.entrica Subsp entrica
II-S.entrica Subsp salamae
III a-S.entrica Subsp arizonae
III b S.entrica Subsp diarizonae
IV.-S.enterica Subsp houtenae
VI.-S.entrica Subsp indica
Los miembros del grupo Salmonella son grmenes patgenos causantes de sntomas clnicos en
humanos y en animales. No todos los serotipos son igualmente patgenos para humanos y animales
por lo que desde el punto de vista de salud pblica es importante su identificacin final.
La naturaleza de la enfermedad vara de acuerdo al serotipo y es as que S.typhi y S. parathyphi
producen cuadros septicmicos y fiebres entricas y otros serotipos producen sntomas como nauseas
vmitos, dolor abdominal, fiebre y diarrea.
El perodo de incubacin de la enfermedad es desde las 6 hasta 48 horas dependiendo de la dosis
infectiva, la que puede ser desde 15 a 20 UFC para algunos serotipos. No todos los serotipos son
patgenos para el hombre y animales.
La incidencia de salmonelosis se ha visto incrementada en los ltimos 20 aos estimndose que los
casos anuales van desde 740.000 a 5.000.000 de los cuales no ms del 1% es detectado.
Los factores ms importantes para su control se basan en una adecuada educacin al consumidor y por
la implementacin y mantenimiento de adecuados controles de calidad por parte del laboratorio de la
industria de alimentos, la que preferentemente utiliza mtodos rpidos para realizar screening en sus
productos mediante kits rpidos los que son eficientes en detectar partidas negativas pero en el caso de
reacciones presumiblemente positivas se debe confirmar con los mtodos convencionales.
Una de las fuentes principales son los alimentos contaminados con ste microorganismo,
especialmente los alimentos de origen animal y los vegetales regados con aguas contaminadas.
Los alimentos se analizan para detectar la presencia/ausencia de Salmonella por las siguientes
razones:
- Confirmar que este microorganismo fue el agente causal de la ETA.
- Determinar qu alimentos o ingredientes de alimentos son fuente de contaminacin de Salmonella.
31
Prctica N 4
La fuente de contaminacin pueden ser: huevos crudos y mal cocidos, pollos y carnes mal cocidas,
productos lcteos, mariscos, frutas y vegetales.
Los alimentos comnmente asociados a infecciones son:
- carne (vacuno, cerdo, pollo),
- productos crnicos (jamn, salame, vienesas),
- ensaladas (papas, porotos verdes, jamn, pollo),
- productos de pastelera (cremas) y
- productos lcteos (queso, queso de cabra, etc.).
Fundamento de la Metodologa
Los mtodos para su deteccin en alimentos estn basados fundamentalmente en que generalmente
su presencia est en un menor nmero que el de la flora acompaante que es muy diversa.
En el laboratorio, los mtodos convencionales para su recuperacin consideran todos estos factores
permitiendo recuperar Salmonella mediante procesos de:
- preenriquecimiento
- enriquecimiento
- siembra en agar selectivo (aislamiento)
- pruebas bioqumicas y
- serotipificacin
Existen Mtodos Rpidos que han sido aprobados por AOAC y algunos han sido reconocidos por el
FDA como buenas alternativas a los mtodos convencionales. Sin embargo los resultados positivos de
estos mtodos deben confirmarse con el mtodo convencional.
Preenriquecimiento
Depender del grado de injuria de las clulas, lo cual est relacionado con los procesos tecnolgicos
aplicados. (deshidratacin, congelacin, calor etc.) y en aquellos alimentos en que se espera un bajo
nmero.
El preenriquecimiento es realizado en medios lquidos (agua peptonada, caldo nutritivo, caldo
lactosado, etc.) que son medios no inhibidores del resto de la flora acompaante. Sin embargo es
importante que en la eleccin del medio a utilizar se considere el grado de injurias subletales derivadas
del proceso tecnolgico.
En el caso del agua peptonada tamponada (pH 7.2) sta asegura la mantencin del pH durante
24horas, lo que sumado al perodo de incubacin permite el incremento de clulas que son sensibles a
la disminucin del pH. A stos medios se les puede adicionar sustancias que contrarresten las
sustancias inhibidoras que estn presentes en algunos alimentos; as mismo se debe asegurar el pH
que es un factor muy importante para el crecimiento de Salmonella.
Enriquecimiento Selectivo
El enriquecimiento selectivo est destinado a inhibir la flora acompaante. Al estar adicionados de
substancias qumicas inhibidoras y sumado a los tiempos y temperatura de incubacin ptimas permite
su desarrollo por sobre otros microorganismos, lo que se confirma en los medios selectivos elegidos o
por otras pruebas de identificacin. Normalmente el rango de T de incubacin va de 35C a 43C por
perodos de 16 a 24 h. Comnmente los caldos selectivos usados son selenito con cistina (SC), verde
brillante, tetrationato (TT), y el caldo cloruro de magnesio-verde malaquita de Rappaport-Vassiliadis
(RV).
Aislamiento o Deteccin en Agares Selectivos
La deteccin en agares selectivos cuyos agentes principales de inhibicin son sales biliares,
desoxicolato, verde brillante, bismuto de sulfito y antibiticos, la diferenciacin de Salmonella de otros
microorganismos es usualmente determinado por los cambios de color del indicador que se detecta por
cambio de pH y que corresponde a la fermentacin de lactosa o sacarosa; asimismo la produccin de
H2S o la descarboxilacin de lisina y de la ornitina.
En microbiologa alimentaria comnmente se utiliza agares como xilosa-lisina desoxicolato (XLD),
bismuto sulfito, verde brillante con o sin sulfadiazina, Hecktoen, Mac-Conkey, desoxicolato citrato y
Salmonella-Shigella (SS).
32
Prctica N 4
Identificacin
En los procedimientos de identificacin final es recomendable que, los cultivos con colonias poco
aisladas o con variedad de flora, realizar un reaislamiento en un agar nutritivo y posteriormente sembrar
en TSI y LIA adems de MIO (movilidad, indol, ornitina).
En general Salmonella es negativa a las pruebas de ureasa, indol, lactosa y sacarosa y positiva a las
pruebas de descarboxilacin de lisina y ornitina, as como generalmente producen H 2S, pero existen
variantes atpicas con reacciones positivas a lactosa o no descarboxilacin de lisina.
La serotipificacin es importante sobre todo desde el punto de vista epidemiolgico en que adems el
estudio se completa con determinacin de biovariedades y fagotipificacin.
Staphylococcus aureus
Las bacterias del gnero Staphylococcus son microorganismos ubicuos difciles de eliminar que
colonizan ambientes muy dispares formando parte de la microbiota habitual de la piel, la garganta y las
fosas nasales de sus hospedadores vertebrados. Staphylococcus aureus es un coco Gram positivo
aerobio o anaerobio facultativo que produce fermentacin lctica y es catalasa y coagulasa positivo.
Posee numerosos factores de virulencia, en su mayora componentes de la pared celular, y una
variedad de exoprotenas que facilitan la colonizacin de nuevos hbitats. Estas propiedades, hacen
que los estafilococos sean la causa de numerosas infecciones en mamferos, que van desde afecciones
superficiales de la piel a patologas severas como neumonas, meningitis, intoxicaciones alimentarias,
shock sptico y desrdenes autoinmunes.
Al cabo de 1-6 horas de la ingestin de toxina preformada de Staphylococcus, aparecen nuseas
intensas, vmitos, calambres abdominales y diarrea acuosa. La toxina se forma en alimentos
preparados y conservados en forma indebida.
Los alimentos ms frecuentemente implicados en la intoxicacin estafiloccica son principalmente los
proteicos (carne, pollo, pescado, lcteos, cremas y natas de pastelera) y en particular: alimentos
cocinados que se recontaminan posteriormente (se ha eliminado la flora competitiva y se produce
contaminacin post-cocinado), alimentos de Aw reducida por adicin de azcar o sal (cremas y natas),
productos crnicos curados tratados trmicamente (jamn cocido) y embutidos crudos fermentados.
No todas las cepas de S. aureus son capaces de producir la intoxicacin estafiloccica. Solo las cepas
que producen una enterotoxina y que se conocen como S. aureus enterotoxignico. La intoxicacin se
produce por el consumo de alimentos en los que se ha multiplicado S. aureus enterotoxignico y ha
producido toxinas en el propio alimento. Es necesario que S. aureus enterotoxignico se encuentre en
6
niveles de al menos 10 /g para que se produzca suficiente cantidad de toxina para provocar sntomas
6
en el consumidor. Estas cifras de 10 /g se alcanzan con facilidad si los alimentos una vez elaborados
no se mantienen a temperaturas adecuadas (o refrigeracin o por encima de 60C) o bien si se
almacenan durante demasiado tiempo.
3. MATERIALES
tubos para diluciones (con diluyente)

pipetas estriles
incubadora
pera
gradilla
Asas y agujas de inoculacin
Caldo lactosado
Caldo selenito cistina
Caldo tetrationato
Kit determinacin rpida de Salmonella
Frasco y tubos con diluyente
Agar Baird Parker
33
Prctica N 4
4. MTODO
Salmonella sp.
ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO
1- Pesar 25 gramos de muestra en un frasco que contiene 225 mL de caldo lactosado.
2- Incubar a 35C durante 24 horas.
ENRIQUECIMIENTO SELECTIVO
1. Pipetear 1 ml del cultivo de enriquecimiento no selectivo en un tubo que contiene 10 ml de
caldo tetrationato y 1 mL en un tubo con 10 mL de caldo selenito cistina, incubar a 43C,
durante 24 horas.
IDENTIFICACIN
1ra opcin KIT Salmonella
1. Adquirir el kit de determinacin rpida de Salmonella
2. (Inocular e incubar segn las indicaciones del fabricante
3. Interpretar los resultados
2da opcin
1. Divida cada placa con agar Bismuto Sulfito en dos mitades
2. Siembre por agotamiento en estras en la primera mitad la muestra enriquecida en caldo
Selenito Cistina y en la otra mitad la muestra enriquecida en Caldo Tetrationato
3. Incube las placas a 35C durante 24 horas
RECUENTO DE S. aureus
1. Pesar aspticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente

-1
-2
-3
2. Hacer diluciones, 10
, 10
y
10
3. Inocular por la tcnica de EXTENSION 0,1 ml de cada dilucin en las placas petri con agar
Baird Parker.
4. Deje reposar las placas durante minutos y asegrese de que el inculo se ha absorbido en el
agar.
5. Incubar 24h a 48h 37C
6. Contar las colonias tpicas de S. aureus
IDENTIFICACION DE S. aureus
1. Coloracin Gram
2. Prueba de catalasa
3. Resistencia al NaCl y consumo de manitol: resembrar en Agar Sal y Manitol
5. Cul es la composicin del agar Baird Parker?
6. Por qu se realiza recuento S. aureus e identificacin de la presencia/ausencia de
Salmonella en alimentos?
7. Qu importancia tienen el anlisis de Listeria en ambientes y en alimentos?
8. Cmo se realiza la identificacin serolgica de Salmonella
34
Prctica N 4
6.BIBLIOGRAFA
-
Apella y Araujo (sin fecha). Solar safe water. Microbiologa del agua. Conceptos bsicos. En
lnea: www.ine.es/normativa/leyes/incinor.htm
Aquiahuatl-Ramos, M.A. Y Prez Chabela, M.L. (2008) Manual de Prcticas. Laboratorio
Microbiologa General. Departamento de Biotecnologa. Universidad Autnoma Metropolitana.
Annimo. (sin fecha). Manual de Microbiologa. Departamento de Microbiologa y Gentica.
Universidad de Salamanca.
Salmonella
DATOS GENERALES
Muestra
Fecha y hora de toma de la muestra.
Consistencia
Olor
Color
Congelada _______
Tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta el
anlisis:
sometido
ANALISIS REALIZADO
T ambiente ______
Reporte de resultados
BANDA CARACTERSTICA DE Salmonella
(resultado positivo)
Resultado encontrado
Describa las caractersticas de las colonias en el medio Bismuto Sulfito Agar

35
Prctica N 4
S. aureus
DATOS GENERALES
Muestra
Consistencia
Olor
Color
Congelada _______
Tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta el
anlisis:
sometido
ANALISIS REALIZADO
T ambiente ______
Recuento
DILUCION
No. colonias
Resultado
PROMEDIO
RESULTADO
REPORTE GENERAL DE RESULTADOS

ANLISIS
SOLICITADO
MUESTRA
MTODO
DE
ANLISIS
RESULTADO
VALORES
REFERENCIALES
NORMA
Salmonella
S.aureus
*Mtodo de anlisis: el nombre del mtodo aplicado
*Norma: nombre o nmero de la norma.
36
Prctica N 4
37
Prctica N 5
LABORATORIO DE
PRACTICA No. 5
ANLISIS MICROBIOLGICO DE MANIPULADORES, UTENSILIOS,
AMBIENTES, EQUIPOS Y SUPERFICIES (MTODOS RPIDOS DE ANLISIS
MICROBIOLGICO)
Cada grupo debe seleccionar un lugar para la toma de muestras (restaurantes,

puestos de comida rpida, o de comida elaborada, donde se tenga la apertura para
que se les permita realizar el anlisis)
Antes de irse a muestrear deben ir al laboratorio con el cooler para que recojan el
material (quick swab y petrifilms) y recibir la clase
Para el da de la prctica deben traer un marco de madera o cartn que tenga 50cm
cuadrados internos (10cm * 5 cm)
SINO TRAEN LAS MUESTRAS BAJO ESTAS INSTRUCCIONES NO PODRN HACER EL

PROYECTO el cooler es individual, uno por grupo
AL FINAL DEL TRABAJO SE EVALUAR:

-
TRABAJO DE LABORATORIO
PRESENTACIN DE LA HOJA DE ACTIVIDADES CON SELLOS DIARIOS
ENTREGA DEL ARTCULO FINAL
El trabajo final escrito no va como informe sino como artculo cientfico
Prctica N 5
ANLISIS MICROBIOLGICO DE MANIPULADORES, UTENSILIOS, AMBIENTES,

EQUIPOS Y SUPERFICIES
2. OBJETIVOS
-
Realizar el anlisis microbiolgico de manipuladores, aplicar tcnicas para la

determinacin de S. aureus en la cavidad naso-farngea y manos.
Realizar el anlisis microbiolgico de los utensilios que estn en contacto con los
alimentos procesados.
Realizar el anlisis microbiolgico de ambientes, equipos y superficies que entran en
contacto con los alimentos procesados.
Comparar y analizar los resultados obtenidos entre todos los grupos de trabajo.
3. CONCEPTOS
Los consultores y responsables de calidad en las industrias alimentarias precisan cada

vez ms los anlisis microbiolgicos de sus productos como una herramienta de trabajo
insustituible en el control de los puntos crticos ya que es la nica va para detectar
contaminaciones fecales, ambientales o por otros patgenos y tomar las medidas
correctoras adecuadas en cada caso. La lectura detallada de los informes emitidos por el
laboratorio ofrece una gua de las desviaciones que se van produciendo en el sistema.
El muestreo se debe realizar con las manos limpias y secas. Si el manipulador est
resfriado es recomendable esperar una semana despus de la desaparicin de los
sntomas. Abrir los hisopos slo en el momento de su uso y cerrarlos lo antes posible,
evitando el contacto de la torunda de algodn con el suelo, superficies, etc.
La toma de muestra de las manos de los manipuladores se realiza para detectar
portadores de Staphylococcus aureus tanto en manos como en cavidad naso-farngea.
Esta tcnica de toma de muestra puede utilizarse para detectar otros microorganismos en
manipuladores, como E. coli o coliformes fecales en manos.
El anlisis microbiolgico de utensilios se puede realizar por hisopado o lavado.
Depender de las caractersticas de los instrumentos a ser controlados.
Actualmente se considera que la mayora de los alimentos son peligros potenciales para el
consumidor, cuando no se siguen las buenas prcticas de fabricacin y por lo tanto no hay
una manipulacin adecuada de los alimentos en las diversas operaciones que se realizan,
previas al servido de los mismos. Los factores que han contribuido a los brotes de ETA
pueden ser: la refrigeracin inadecuada, combinada frecuentemente con la preparacin de
alimentos mucho antes de ser servidos, el mantenimiento de los alimentos en
calentadores con temperaturas que permiten el crecimiento de los microorganismos, mala
higiene de las personas que manipulan los alimentos cocinados y el recalentamiento
incorrecto de los alimentos previamente cocidos.
Las prcticas generales de higiene se desarrollan en la manipulacin de alimentos para el
Prctica N 5
consumo humano con el objetivo de garantizar un producto inocuo, saludable y sano.

Estas actividades se cumplen desde el cultivo y recoleccin, preparacin, elaboracin, el
vaciado, almacenamiento, soporte, distribucin y venta.
Limpieza: La eliminacin de residuos de alimentos, polvo, grasa u otra materia objetable
Contaminacin: Presencia de cualquier material objetable en el producto.
Desinfeccin: Accin por la cual se busca disminuir el nmero de microorganismos
mediante procesos fsicos y qumicos satisfactorios aplicados en superficies limpias de
forma que se reduzca a un nivel tal que no d lugar a la contaminacin peligrosa de los
alimentos que contactan con la superficie desinfectada (Codex Alimentarius).
Para la desinfeccin debemos tomar en cuenta factores como:
Tipo de microorganismos y alimentos en cuestin.
Tipo de superficies
Tipo de suciedad
Dureza del agua
Rotacin de los productos utilizados
El control microbiolgico del ambiente de instalaciones permite gestionar de una manera
ms eficaz el control de los puntos crticos de un proceso de produccin. Para esto se
realizan los siguientes ensayos:
Control microbiolgico de superficies (microorganismos totales, indicadores,
patgenos)
Control microbiolgico de aire (equipo de filtracin)
Control microbiolgico de manipuladores de alimentos (Staphylococcus,
enterobacterias, Salmonella)
Por estas razones es importante conocer las condiciones microbiolgicas en las que se
encuentran las zonas en las que se procesan alimentos. El anlisis microbiolgico de
ambientes incluye el control con filtros de aire y/o el recuento de bacterias mesfilas
aerobias, coliformes, mohos y levaduras que pueden afectar al producto contaminndolo o
produciendo defectos en el mismo. Mientras que las superficies y equipos que estn en
contacto con el alimento no deben representar una fuente de contaminacin para el
alimento procesado o terminado.
MUESTREO
Se puede utilizar un sistema de hisopado de superficies para verificar la eficacia del
proceso de sanitizacin previo a la liberacin de lneas de producto, monitorear los niveles
de bacterias durante la produccin o medir los niveles bacterianos post-operacionales.
Los hisopos pueden utilizarse secos o hmedos para muestrear superficies e inocular
rpida y directamente la muestra sobre una placa.
En vista de lo antes sealado, es importante analizar la calidad microbiolgica de los
alimentos, determinar las causas de la contaminacin, y adicionalmente analizar la calidad
microbiolgica del agua, de los equipos, utensilios, superficies, ambientes y del personal
que estn en contacto con el procesado de alimentos.
Prctica N 5
MTODOS RPIDOS DE ANLISIS MICROBIOLGICO

El desarrollo de mtodos rpidos y automatizados para la deteccin, aislamiento,
identificacin y enumeracin de microorganismos (y/o sus metabolitos) relacionados con
la alteracin y seguridad de los alimentos es una subdivisin del rea de la microbiologa
aplicada con una importancia cada vez mayor.
Los mtodos microbiolgicos convencionales, empleados actualmente en numerosos
laboratorios de todo el mundo y establecidos en muchos casos como mtodos estndares
de anlisis microbiolgico de los alimentos, se caracterizan por ser laboriosos, emplear
grandes volmenes de medios de cultivo y requerir un tiempo considerable para la
obtencin y el anlisis de los resultados. Por el contrario, los mtodos rpidos requieren
un tiempo reducido para la obtencin de los resultados y/o permiten procesar un nmero
elevado de muestras por unidad de tiempo, y son en general fciles de usar, precisos
(sensibilidad y especificidad adecuadas y lmites de deteccin bajos) y econmicamente
rentables (aunque, en algunos casos, pueden requerir una inversin econmica inicial
considerable). Conviene destacar que, en la mayora de los casos, el empleo de mtodos
rpidos no excluye la etapa de enriquecimiento del microorganismo diana (buscado) ni la
necesidad de obtener cultivos puros, as como que los resultados positivos obtenidos con
mtodos alternativos (distintos del mtodo de referencia) no validados deben ser
confirmados. Asimismo, es de suma importancia, al igual que en el caso de los mtodos
tradicionales, una adecuada toma y preparacin de las muestras a analizar.
Los mtodos rpidos utilizados en microbiologa de alimentos pueden dividirse en cinco
grandes grupos, incluyendo los empleados para el recuento de clulas viables, para la
medicin de la biomasa, los sistemas miniaturizados y kits de diagnstico, los
inmunolgicos y los genticos.
Medida de la biomasa microbiana
Puesto que el mtodo convencional de recuento de microorganismos en placa es muy
laborioso, se han desarrollado mtodos para estimar de manera indirecta el nmero de
microorganismos presentes en los alimentos. El desarrollo de dichos mtodos est
ntimamente ligado al de la instrumentacin necesaria para detectar las seales
relacionadas con el crecimiento microbiano. El principio en el que se basan estos sistemas
es que dichas seales (niveles de ATP, enzimas especficas, pH, impedancia,
conductancia y capacitancia elctrica, etc.) se modifican paralelamente con el crecimiento
microbiano.
Todas las clulas vivas contienen ATP, que se degrada muy rpidamente mediante
autolisis al morir las clulas. En presencia de la enzima luciferasa y el sustrato luciferina
(procedentes de la lucirnaga), oxgeno y magnesio, el ATP facilita el paso de la luciferina
a oxiluciferina, generndose luz (bioluminiscencia) que puede ser detectada mediante un
luminmetro. La cantidad de luz emitida en esta reaccin es directamente proporcional a
la cantidad de ATP presente en la muestra, es decir, al nmero de clulas vivas, y est
correlacionada con la biomasa celular (la cantidad de ATP de 1 unidad formadora de
colonia (UFC) oscila entre 0,22 y 1,03 fg. Este mtodo puede emplearse para la deteccin
especfica de ATP microbiano en productos lquidos tales como leche UHT, zumos,
Prctica N 5
postres, lcteos, etc., en los que es necesario determinar la presencia/ausencia de

microorganismos. No obstante, la principal aplicacin de este principio en la industria
alimentaria se encuentra en la monitorizacin de la higiene de superficies. En este caso, la
presencia de altos niveles de ATP de cualquier origen (microbiano o no) es indicativa de
una limpieza deficiente.
Recuento de clulas viables
El recuento de clulas viables, tanto de los alimentos como de las superficies en contacto
con los mismos y del aire de las industrias alimentarias, es uno de los parmetros ms
importantes a la hora de determinar la calidad y seguridad de los alimentos.
Tradicionalmente, el recuento de clulas viables se ha realizado mediante el mtodo
estndar de recuento en placa, que, aunque sencillo, es laborioso, requiere un volumen
considerable de tubos de ensayo y medio de dilucin, y espacio para el almacenamiento y
la incubacin de las placas de cultivo. En lo que se refiere a la preparacin de placas de
cultivo, destacan las siguientes mejoras: autmatas para la preparacin y distribucin de
medios de cultivo (Masterclave, AES Chemunex); sistemas que incluyen pectina como
agente gelificante en lugar de agar, evitando as la necesidad de calentar el medio para
fundirlo (Redigel, 3M); y medios liofilizados que utilizan como soporte una pelcula plstica
de tamao y grosor similar al de una tarjeta de crdito que contiene geles solubles en
agua fra que se rehidratan al depositar la muestra en su superficie y que requieren un
espacio mnimo para su almacenamiento e incubacin (Petrifilm, 3M), existiendo asimismo
instrumentos para la lectura rpida y automtica de los resultados (Lector de placas 3M
Petrifilm, 3M).
TCNICAS DE MUESTREO RPIDO DE SUPERFICIES:
a) Mtodo de la placa en contacto (Placa Rodac):
El mtodo de contacto directo del agar con los microorganismos que se multiplican
(RODAC= Replicate Organisms Direct Agar Contact) utiliza placas Petri especiales,
ideales para la investigacin de grmenes en superficies. Se aade a una placa de Rodac,
un medio de cultivo slido (seleccionado en funcin de los microorganismos buscados), en
ligero exceso, para que la superficie quede convexa. Es el mtodo ideal para examinar
superficies lisas, duras y no porosas, pero no es muy recomendable en casos de
superficies muy contaminadas, donde es ms prctico el uso de medios selectivos. Si se
desea controlar un grupo de microorganismos en concreto, tambin recurriremos a medios
selectivos.
Modo de empleo: La placa se coloca sobre la superficie a muestrear de una forma
directa, mantenindola inmvil y presionando. Cerrar e invertir la placa para su incubacin,
a temperatura y tiempo adecuados segn el medio y determinacin realizada.
Prctica N 5
b) Laminocultivos:
Los laminocultivos son sistemas prcticos, estudiados y diseados especialmente para la
determinacin cuantitativa y cualitativa de los microorganismos en todos aquellos sectores
productivos en los cuales es necesario el control de la microbiota contaminante.
Este sistema analtico ofrece las siguientes ventajas:
Permiten la determinacin cualitativa y cuantitativa de los microorganismos.
La presencia de dos medios de cultivo en un solo soporte permite efectuar muestreos
separados con un solo laminocultivo.
El cierre hermtico con tapn roscado disminuye la posibilidad de contaminacin
accidental y mejora la estabilidad del producto.
Su reducido volumen facilita el transporte, almacenamiento y permite una mejor gestin
del espacio siempre escaso de la estufa de incubacin.
Los laminocultivos se presentan en dos versiones:
Una estudiada para el muestreo y control de lquidos: laminocultivos con dos o tres
medios de cultivo,
Y otra pensada para el control de superficies: laminocultivos con dos superficies. En este
caso poseen un soporte flexible que con la simple presin de la mano puede doblarse en
ngulo de 90 respecto al tapn, permitiendo as una posicin perfectamente paralela con
la superficie a muestrear.
Laminocultivos
4. MATERIALES Y METODOS
3.1 MATERIALES
Mini incubadora
Prctica N 5
Hisopos estriles (Quick swab)

Tubos para diluciones
Pipetas estriles
Agua peptonada
Placas petrifilm
Plantilla metlica
2 Placas de Agar Saboraud
2 Placas de Agar Nutritivo
3.2 MTODOS
ANLISIS MICROBIOLGICOS DE MANIPULADORES
Toma de muestras de manos y uas

- Utilizar el hisopo para lavar la superficie de la palma de la mano haciendo rotar el
hisopo
- Lavar la zona entre los dedos, repetir la limpieza del hisopo y pasar el hisopo entre
las uas.
- Repetir la misma operacin para la otra mano.
Recuento de S. aureus
- Trasvasar el caldo Letheen del hisopo a 9 ml de diluyente, esta es la dilucin 10-1
- Realizar la dilucin 10 -2 .Si es necesario.
- Sembrar en las placas petrifilm de S. aureus
- Incubar las placas a 35C durante 24 horas.
- Leer los resultados.
Toma directa de muestras de manos
- En una placa petrifilm para S. aureus, pedir a la persona de la que se tomar la
muestra que presione ligeramente sus dedos sobre el agar (con cuidado de no
romper)
- Incubar (35C/24H)
- Contar la bacterias existentes (Staphylococcus)
ANLISIS MICROBIOLGICOS DE UTENSILIOS
Toma de muestra por hisopado

- Sostener el hisopo en un ngulo de 30 con respecto al utensilio a muestrear.
Frotar lenta y completamente con el hisopo por toda la superficie deseada. Frotar
bien en las superficies rugosas del utensilio (Ej: colador, tabla de picar, cuchillo,
abrelatas, entre otros).
- Realizar diluciones 10 -1 , 10 -2 y 10-3.
- Sembrar en las placas petrifilm de enterobacterias
- Incubar las placas a 35C durante 24 horas
- Leer los resultados
ANLISIS MICROBIOLGICOS DE AMBIENTES POR EXPOSICIN
Prctica N 5
Exponer en el ambiente designado a cada grupo

Mantener las placas destapadas durante 30 minutos
Tapar e incubar:
o Mohos y levaduras agar saboraud: 3 5 das/25C.
o Bacterias agar nutritivo: 24-48 horas/ 35C (segn el crecimiento
obtenido)
Recuento
ANALISIS MICROBIOLGICO DE EQUIPOS
Tomar las muestras por hisopado.

Sostener el hisopo en un ngulo de 30 con respecto a la superficie a muestrear.
Hisopar en el equipo seleccionado. Frotar lenta y completamente con el hisopo por
toda la superficie deseada. Para las superficies, hisopar un rea de 50 cm2.
Realizarlo en 3 direcciones distintas.
Regresar el hisopo al tubo.
Realizar diluciones 10 -1 , 10 -2 y 10-3.
Sembrar en las placas petrifilm de coliformes
Incubar las placas a 35C durante 24 horas.
Leer los resultados
Hisopado de equipos y superficies
ANLISIS MICROBIOLGICO DE SUPERFICIES
Humedecer el hisopo en el diluyente y sostenindolo en un ngulo de 30, lavar la

superficie determinada por la plantilla, pasando por toda el rea en diferentes
direcciones (50 cm2).
Enjuagar el hisopo en el diluyente. Drenar el exceso de lquido en la pared del tubo
y repetir la operacin de muestreo para otra superficie. Repetir el proceso 5 veces.
Realizar diluciones 10 -1, 10 -2 y 10-3.Si es necesario.
Sembrar en las placas petrifilm de aerobios mesfilos y mohos y levaduras
Incubar 3-5 das/ 25C para mohos y levaduras; 48 h/ 35C las de aerobios
mesfilos
Leer los resultados
Prctica N 5
Toma de muestra de superficies. Uso de plantilla metlica.

Superficie de muestreo: 50 cm2
7. Qu es un stomacher? qu ventajas y desventajas tiene su uso en laboratorio de
microbiologa?
8. Qu es un hisopo Quick Swab y como se usa?
9. Qu diferencias hay entre un mtodo rpido y un mtodo muy rpido para el
anlisis microbiolgico?
10. Cmo se realiza la identificacin rpida automatizada de microorganismos?
6. BIBLIOGRAFA
- Aquiahuatl-Ramos, M.A. Y Prez Chabela, M.L. (2008) Manual de Prcticas.
- Annimo. (s/f). Manual de Microbiologa. Departamento de Microbiologa y
Gentica. Universidad de Salamanca.
- Scharlab, (s/f). Control microbiolgico ambiental y de superficies. Recuperado el 03
de
Marzo
del
2015
de:
http://www.cienytech.com/catalogos/Microbiologia/Controlsup.pdf
7. REGISTRO DE RESULTADOS
7.1.
MANIPULADORES
7.1.1. DATOS DEL MANIPULADOR
DATOS GENERALES
Nombre del manipulador
Actividad que realiza
Observaciones y datos adicionales
Condiciones de incubacin
7.1.2. RECUENTO DE S. aureus:

REPORTE DE RESULTADOS: MUESTREO HISOPADO
DILUCIN
No. colonias
PROMEDIO
RESULTADO
No. UFC
Resultado
REPORTE DE RESULTADOS: MUESTREO DIRECTO

DILUCIN
No. colonias
PROMEDIO
RESULTADO
No. UFC
7.2.
Resultado
UTENSILIOS
7.2.1. DESCRIPCIN DE LA MUESTRA:

DATOS GENERALES
Lugar de muestreo
Caractersticas de los utensilios
7.2.2. RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS :

DILUCIN
No. colonias
PROMEDIO
RESULTADO
No. UFC
7.3.
AMBIENTES
Resultado
Prctica N 5
7.3.1. DESCRIPCIN DE LA MUESTRA

DATOS GENERALES
Lugar de muestreo
Caractersticas del lugar de muestreo
Fecha y hora de anlisis
7.3.2. RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS (Saboraud):

PLACA
No. colonias
PROMEDIO
RESULTADO
No. UFC / 3 m2
Resultado
7.3.3. RECUENTO DE BACTERIAS (Nutritivo):

PLACA
No. colonias
PROMEDIO
RESULTADO
No. UFC / 3 m2
7.4.
Resultado
EQUIPOS

DATOS GENERALES
Lugar de muestreo
Caractersticas los equipos
CARACTERSTICAS DE LA MUESTRA
7.4.2. RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES:

DILUCIN
No. colonias
Resultado
Prctica N 5
PROMEDIO
RESULTADO
Prctica N 5
7.4.3. RECUENTO DE E. coli:

DILUCIN
No. colonias
PROMEDIO
RESULTADO
7.5.
Resultado
SUPERFICIES

DATOS GENERALES
Lugar de muestreo
Caractersticas del lugar de muestreo
CARACTERSTICAS DE LA MUESTRA
Aerobios totales:
Mohos y Levaduras:
7.5.2. RECUENTO DE AEROBIOS MESFILOS TOTALES:

DILUCIN
No. colonias
PROMEDIO
RESULTADO
No. UFC / 50 cm2
Resultado
7.5.3. RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS:

DILUCIN
No. colonias
PROMEDIO
RESULTADO
No. UFC / 50 cm2
Resultado
7.6.
Prctica N 5
REPORTE DE RESULTADOS
ANLISIS
SOLICITADO
MTODO
DE
ANLISIS
MUESTRA
RESULTADO
VALORES
REFERENCIALES
NORMA
Manipuladores
Utensilios
Ambientes
Equipos
Superficies
*Anlisis solicitado: colocar los ensayos realizados en el laboratorio

*Mtodo de anlisis: el nombre del mtodo aplicado
*Norma: nombre o nmero de la norma. Si se consulta en normas que no constan en el
laboratorio, debe adjuntarse el documento en el informe.

Control microbiológico alimentos agentes físicos químicos

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LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:

ES OBLIGATORIO EL USO DE MANDIL, COFIA Y MASCARILLA DE TELA

REVISAR LAS INDICACIONES DEL LABORATORIO

CONTROL DEL CRECIMIENTO MICROBIANO:

Simular en el laboratorio los mtodos de control del crecimiento microbiano utilizados

El control de microorganismos comprende todos los mtodos fsicos, mecnicos y

Tabla 1. Principales agentes fsicos y qumicos usados para el control microbiano

Constituyentes antimicrobianos y estructuras biolgicas en alimentos

Esterilizacin: destruccin de todo tipo de vida microbiana presente en elementos

BACTERICIDA, agente que mata bacterias.

aproximadamente 10 UFC/ml y ser preparado en solucin salina estril o caldo de cultivo.

Someter a ebullicin por 1 minuto

Someter a ebullicin por 10 minutos

Mantener en un bao a 65C por 30 minutos,

Congelar el tubo de ensayo por 24H

Refrigerar el tubo de ensayo por 24H

CALOR HUMEDO Someter al tubo al proceso de esterilizacin por

SECO Mantener en la estufa un tubo de ensayo por 1

1. Preparar el inculo._ Partiendo de un cultivo puro tomar con el asa de siembra X

ANTIBITICO: Gentamicina a diferentes concentraciones

Agua destilada estril

Escribir el concepto y un ejemplo de desinfectantes de actividad alta, media y baja.

Cul es la diferencia entre: bacteriosttico, bacterioltica, bactericida.

Describir el mecanismo de accin de la gentamicina sobre el crecimiento bacteriano.

qu es la validacin de un desinfectante? cmo se realiza?

Maturin, L. y Peeler, J.T. (1998) Bacteriological Analytical Manual, Edition 8, Revision

Solano C. (2006) Microbiologa de alimentos (Guin de prcticas). Universidad

ebullicin por 1 minuto

MICROORGANISMOS QUE PRODUCEN ALTERACIN

TRAER ADEMS POR GRUPO UN ENVASE TETRAPACK DE LECHE

LAS MUESTRAS DE ALIMENTO

NO DEBEN SER COMPRADOS EN

SUPERMERCADOS O RESTAURANTES QUE ASEGURAN UNA BUENA CALIDAD

RECUENTO DE MICROORGANISMOS QUE PRODUCEN ALTERACIN DE ALIMENTOS

Determinar el nmero de microorganismos (UFC/ml-g) proteolticos y psicrfilos,

La temperatura ptima de crecimiento de los organismos mesfilos oscila entre los 40 y 50 C

En alimentos refrigerados y congelados se encuentran en nmero predominante los

desarrollan en condiciones anaerobias.

Este grupo de microorganismos se caracterizan por ser esporulados, anaerobios. Pueden

Actividad como agentes alterantes de alimentos: Las Pseudomonas son el grupo de

La presencia de una cantidad de levaduras y mohos no es deseable en los alimentos, excepto

Si no hay crecimiento a las 24H dejar 24H ms de inoculacin.

Pesar aspticamente 10 gramos de alimento a ensayar en 90 ml de diluyente

3. Haga una tincin simple (cristal violeta por 60 segundos)

Gonzlez-Velsquez, G.H. y Holgun.-artnez, G. (1990) Manual sobre tcnicas

Tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta

Tiempo transcurrido desde la toma de muestra hasta

RECUENTO DE MICROORGANISMOS PROTEOLITICOS VIABLES

No. UFC / g de muestra

RECUENTO DE MICROORGANISMOS PSICROTROFICOS VIABLES

No. UFC / g de muestra

RECUENTO DE MICROORGANISMOS MOHOS Y LEVADURAS

No. UFC / g de muestra

RECUENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS

*Anlisis solicitado: colocar los ensayos realizados en el laboratorio

MICROORGANISMOS INVOLUCRADOS EN TOXICOINFECCIONES ASOCIADAS A

CADA GRUPO DEBE TRAER LAS MUESTRAS DESIGNADAS y debern ser

TRAER ADEMS POR GRUPO UN ENVASE TETRAPACK DE LECHE

LAS MUESTRAS DE ALIMENTO

NO DEBEN SER COMPRADOS EN

SUPERMERCADOS O RESTAURANTES QUE ASEGURAN UNA BUENA CALIDAD

MICROORGANISMOS INVOLUCRADOS EN TOXICOINFECCIONES ASOCIADAS A