Introduccion

La Secuenciacin Sanger es un mtodo de secuenciacin de ADN en el que el ADN diana se

desnaturaliza y se hibrida con un cebador de oligonucletidos, que se extiende entonces gracias a la
ADN polimerasa usando una mezcla de desoxinucletidos trifosfato (dNTPs normales) y de
terminacines de cadena-trifosfatos de didesoxinucletidos (ddNTPs).Los ddNTPs carecen del grupo
3 'OH al cual se aade el dNTP siguiente de la cadena de ADN en crecimiento. Sin el 3 'Oh, no se
pueden aadir ms nucletidos, y la ADN polimerasa se cae. Los cadenas de ADN resultantes recin
sintetizadas sern de diferentes longitudes, dependiendo de que tamao tenia la cadena cuando se
incorpor al azar un ddNTP.
La mayora de la secuenciacin del ADN se ha automatizado. Las reacciones mtodo de Sanger de
terminacin de cadena se utilizan todava, pero el vertido, el proceso, y la lectura de los geles de
poliacrilamida se han sustituido por mtodos automatizados. En lugar de etiquetar los productos de
las 4 reacciones de secuenciacin (con un desoxinucletido radiactivo), cada uno de los
didesoxinucletidos est marcado con un marcador fluorescente diferente. Cuando se excita con un
lser, los 4 tipos diferentes de productos se detectan y la intensidad de la fluorescencia de los datos se
traduce en un "pico". As, todas las reacciones de las cuatro cadenas de terminacin se pueden
realizar en el mismo tubo, y ejecutarse en un solo carril en un gel. Una mquina escanea el carril con
un lser. La longitud de onda de fluorescencia de la etiqueta de conjugado ddNTPs puede ser
interpretado por la mquina como una indicacin de el lugar en el cual tubo lugar la reaccin (ddG,
ddA, ddT, o ddC) en una banda de ADN particular.

Materiales para la secuenciacin de ADN

Patrn de ADN
Mix dNTP
Agua destilada
Buffer de amplificacin
Primers Delantero, trasero
Mix para PCR
Taq ADN polimerasa
Enzima EXO-SAP
Columna de purificacin
Mezcla tinte
Sephadex
Buffer de corrido
Secuencia de polmero
Placa de secuencia
Septa de placa

Mtodo para la secuenciacin de ADN

A. Preparar plantilla de ADN genmico
a. El ADN genmico se prepar de acuerdo con los protocolos estndar para el aislamiento de ADN de
alto peso molecular

b.La concentracin de ADN genmico se determin por la incorporacin de tinte A260,o un anlisis
espectrofotomtrico equivalente.
c. De acuerdo a la concentracin determinada, el ADN genmico se diluye con agua estril, agua
desionizada o Tris 10 mM, pH 8,0 con el fin de obtener una concentracin de ADN de entre 30-60 ng /
mL.
d. A continuacin, el ADN diluido se dividi en alcuotas y se almacen a -15 C a -25 C.
e. La calidad del ADN se determin mediante el clculo de la relacin A260/A280.
Nota: Para obtener ADN de alta calidad, la proporcin A260/A280 est obligado a estar en entre 1,7 a
1,9

B. Amplificacin por PCR

Preparacin de reaccin de PCR:
i. Se prepara la mezcla de reaccin.
ii. Si el nmero de muestras a analizar es ms que 5, se recomienda preparar una
mezcla maestra. Dependiendo del volumen calculado, combinar los componentes y
aplicar el vortex suavemente.

Reactivos a utilizar:
PCR Master Mix ............................... 12,5 l
El PCR Master Mix incluye los productos qumicos necesarios para la reaccin en cadena de
la polimerasa como el MgCl2, dNTPs, la Taq polimerasa y la solucin tampn.
Cebador ..................... 2,5 l
Cebador para ser usado en la reaccin que tiene que ser diseado apropiadamente para la
regin de ADN genmico de inters.
Cebador inverso ...................... 2,5 l
El cebador inverso se utiliz en la reaccin y tiene que ser diseado apropiadamente para la
regin de ADN genmico de inters.
G / C Enhancer ................................... 5 l
Cataliza la unin de los cebadores para la regin de ADN de inters.
El ADN genmico (30-60 l) ................ 2,5 l
Despus de que todas las reacciones se aadan, se procede a agitar en el vrtex suavemente
el tubo para PCR con el fin de mezclar adecuadamente los productos qumicos.El volumen total es de
25 l.
Coloque los tubos de PCR en ciclo trmico.
Coloque el ciclo trmico en las condiciones de temperatura y tiempo de activacin,para la
activacin, amplificacin y extensin de acuerdo a los tipos de productos qumicos utilizados y el
ADN genmico de la regin de inters.

Un protocolo de PCR ilustrativo es el siguiente:

Activacin: No se repite
95 C ..................... 10 '
Amplificacin: 40 repeticiones
95 C ..................... 40''
62 C ..................... 1 '
72 C ..................... 50''
Elongacin: No repetir
72 C ..................... 7 '
Mantenimiento:
4C
.
4

C. Determine la cantidad de ADN

a.

Con el fin de determinar la cantidad de producto de PCR mezclar 5 l de producto de PCR

con carga de tincin.

b.

Preparar gel de agarosa al 2% y realizar la electroforesis.

c. . Cargar el marcador de ADN de bajo peso en un pocillo de gel de agarosa.

d. Visualizar el gel bajo iluminador UV y analizar la imagen adquirida.
e. Limpie protocolo de producto PCR
f.

Centrifugue brevemente los tubos de PCR antes de su uso.

g.

Etiquete nuevamente los tubos PCR de acuerdo a los nombres de muestra.

h. Aada 5 l de producto de PCR.

i.

Aada 2 l de enzima especfica para limpiar los componentes no utilizados de la PCR en el

tubo.

j.

El volumen total debe ser de 7 l.

k. Coloque los tubos en el termociclador.

l.

Establezca las condiciones en funcin de la enzima que se utiliza para limpiar los excesos
de reactivos.

un protocolo ilustrativo es el siguiente:

Incubacin enzimtica: 37 C ..................... 30 '

Inactivacin de enzimas: 80 C ..................... 15 '
Mantenimiento: 4 C

D. Preparacin de la reaccion de secuenciacin

Los componentes de la reaccin y la cantidad de productos qumicos son:

Mezcla de tincin ......................... 2 l
Buffer de Secuenciacin ......................... 2 l
Primers ......................... 2 l
Producto de PCR ......................... 2 l
ddH2O ......................... 2 l
6

El Volumen total es de 10 l. Agite en el Vortex los tubos para mezclar los componentes correctamente
y centrifugar brevemente.

Colocar los tubos en el ciclo trmico y establecer las condiciones.

Un ejemplo ilustrativo de las condicines para la PCR es el siguiente:
Activacin: No se repiten
96 C ..................... 1 '
Extensin: 25 ciclos
96 C ..................... 10''
50 C ..................... 5''
60 C ..................... 4 '
Mantenimiento:
4 C ......................

E. Purificacin del producto de extensin

Los productos amplificados se purifican mediante el uso de dos puntos de Sephadex.

Preparacin de las columnas de purificacin:
7

a. Aadir 750 l de ddH2O a las columnas incluyendo Sephadex

b. Realice Vortex hasta que el polvo de Sephadex se disuelva correctamente y mantener a temperatura
ambiente durante 30 min.
c. Centrifugar las columnas durante 2 minutos a 4600 rpm
d. Desechar el agua en el tubo de recogida y asegurar que no queda agua.
e. Aadir todo producto de la PCR en el centro de la columna.

f. Centrifugar durante 2 minutos a 4600 rpm.

F. Realizar electroforesis capilar

a. Aadir todo el producto purificado en una placa de 96 pocillos.

b. Cubrir la placa con Septa.
c. Colocar la placa en un soporte de placa.
8

d. Coloque la placa en el instrumento de secuenciacin del ADN.

e. Espere a que el instrumento realice la electroforesis y recoga los datos.
f. Analice los datos.