Relações Genes e Ambiente

Prof. MAURO F. REBELO

Laboratório Intermediário de Biologia Molecular Ambiental
IBCCF/UFRJ – Bloco G, G0-060
mrebelo@biof.ufrj.br
2010
 Aula #8 – Adaptações ao
ambiente
Objetivos:
•
Identificar os mecanismos de toxicidade e adaptação aos metais pesados
•
Mecanismos de toxicidade do O2 e mecanismos antioxidantes;
•
Identificar os mecanismos de adaptação aos xenobióticos no ambiente.
 Por que não podemos viver sem eles?

•
Nenhum elemento se tornou “essencial” sem abundância maior que

2 nM no oceano,  20
moles/kg na crosta da terra, ou  200

moles/100 moles Si no cosmos.

•
Mais de 40 elementos estão acima destes limites, mas somente 18

deles são “essenciais” (sendo 6 destes desnecessários por algum
organismo).
 Então porque alguns elementos se tornaram
essenciais se apenas abundancia não justifica as
necessidades minerais modernas?
•
Hipótese I: um requerimento único, imprescindível, que data da origem da vida; H,
K (vs. Na), Mg (vs. Ca), C, N, O, P, S e Fe
•
Hipótese II: um requerimento único, adquirido posteriormente; exigências
especiais como B, Se e I
•
Hipótese III: um requerimento importante, que pudesse ser satisfeito por
diferentes elementos, sendo que a adaptação evolutiva foi feita pelo mais
abundante; K vs. Rb, Mg vs. Be(?), S vs. Se, Cl vs. Br, H vs F(?), e Zn e Mn vs.
varios metais
•
Hipótese IV: mesmos que III, mas um requerimento posterior. Ca vs. Sr, Na vs. Li
(?), Mo vs. V, e Si vs. Ge
 Quais seriam esse requerimentos?
•
Energia para o início da vida: Catalises minerais que formam mecanismos
de retroalimentação espontaneamente envolvendo tanto compostos
orgânicos como inorgânicos.
•
O Fe faria parte da reação que forneceria poder redutor para essas
sínteses minerais: FeS + H2S
FeS2 + 2H+ +2e-
•
E o ciclo do ácido cítrico como a fonte inicial de compostos orgânicos.
•
Metais pesados essenciais
•
Têm a utilidade especial como excepcionais transportadores de elétrons
•
O Zn tem utilidade por ser o metal pesado mais abundante no oceano
•
Elevata afinidade por S > N > O
•
Possibilidade de formar ligações coordenadas colocando a disposição
orbitais de tipo d (e, f)


 


 

 Metais de transição externa
•
elementos que tem camadas eletrônicas d e f parcialmente
preenchidas em algum de seus estados de oxidação

•
os metais de transição do grupo d; nesse grupo, as camadas

semi-preenchidas são a 3d, a 4d e a 5d.

•
Esses orbitais se projetam para fora da periferia do átomo

ou do íon, de formas a que elétrons ocupando tais orbitais
são grandemente afetados pela vizinhança do átomo ou do
íon,

•
e, ao mesmo tempo, tendem a afetar essa vizinhança.

Hemocianína
Heme
Hemoglobina
 Anidrase
Carbonica (Zn)

Converte dióxido de carbono

e água em ácido carbónico,
protons e íons bicarbonato.
Então porque os metais pesados
são um problema?
Baia de Sepetiba, RJ. Brasil

INPE, 1999
 Dragaem em sepetiba
•
Estimou-se em •
Estima-se que, numa
20.866.000 m3 o volume camada de 50 cm do
total de sedimento de sedimento dragado, a
fundo a ser dragado, tendo quantidade de metais é de 7
este, como destino final toneladas de cádmio, 4
uma área denominada toneladas de cobre, 0,6
“bota-fora” situada no toneladas de chumbo e
próprio interior da baía 360 toneladas de zinco
 Toxicidade dos metais pesados

•
Substituição especifica em sitios ativos de enzimas por uma maior afinidade

química (levando a inativação)

•
Interações inespecificas com grupos nucleofilicos (S, N, O) em AAs

•
Reação com grupos–SH de fosfatases, ATPase, Canais Ionicos (levando ao seu

bloqueio)

•
Desregulação da liberação do citosolico, ativação ou disativação da sinalização

celular dependente de Ca2+ e cinase dependente.
Hg2+ 50
M INDUZ AUMENTO DA [Ca2+]i

Ondas de Ca2+ dose dependentes. Efeito é reversível

•
Não detectável com quelante de Ca2+i

(T –PEN)
200
175 •
Não detectável com bloqueador dos
150
canais de membrana (Verapamil)
125
100
•
Não detectável com inibidor da PKC
75
50 (U73122)

•
O Hg2+ age do externo e altera a via da PKC (G; IP3)

•
Fluxo de Ca2+ do meio externo e compartimentos intracelulares

•
Mesmo efeito em mexilhões

 Toxicidade dos metais pesados

•
Reação com grupos N das bases nitrogenadas do DNA levando a mutações,

quebras (hélice – simples e dupla – e cromossomos) e efeitos sobre a expressão
gênica.
 



 

 

  

•
Fe3+ transforma H2O2 e O2- em OH

•
O cobre possui valência variável (Cu2+
Cu+) e pode
substituir o Fe3+ na reação de Fenton;
•
também o Cd2+;
•
e outros.
 Me+2
Permeação Entrada de metais na
MeCl2
célula

Carreador Me+2

Canal
Iônico Me+2

Bomba
Iônica Me+2

Me+2
Endocitose
 Homeostase de metais na célula
Me2+ hemolinfático
Parede
Celular
Me Ca
S Mg
Pi Me
Pi PPi
Vesículas com
metal
[Me2+] Grânulos
insolúveis
Núcleo
Me2+
Mitocôndrias
Citosol
Reticulo Me2+
Polimeros [Metalotioneínas]
metálicos
Exocitosis
Meio
Metalo externo
lipofuscinas Lisossoma

•
Metalotioneínas
•
Acumulo no sistema vacuolar-lisossomal
•
Formação de precipitados insolúveis (glutationa, compostos heterociclicos
de nitrogênio, grânulos inorgânicos)
LIPOFUSCINAS
Grânulos formados por restos de digestão de lisossomos e lipídeos degradados
 Depósitos de Zn em grânulos
amorfos na parede celular de Padina
gymnospora

G.M. Amado Filho, L.R. Andrade b, C.S. Karez, M. Farina, W.C. Pfeiffer. 1999.
Brown algae species as biomonitors of Zn and Cd at Sepetiba Bay, Rio de Janeiro,
Brazil. Marine Environmental Research 48 213-224
Grânulos eletron-densos na parede celular de Padina gymnospora são ricos em Cd e
uma estratégia de acumulo e imobilização do elemento tóxico

Andrade AR, Farina M, Amado Filho GM. Role of Padina gymnospora (Dictyotales,
Phaeophyceae) cell walls in cadmium accumulation. Phycologia 41:39-48
Microanálise de raio X dos grânulos eletron-densos na parede celular de Padina
gymnospora demonstrando a presença de Cd e Cu

Andrade AR, Farina M, Amado Filho GM. Role of Padina gymnospora (Dictyotales,
Phaeophyceae) cell walls in cadmium accumulation. Phycologia 41:39-48
 METALOTIONEÍNAS
•
Ubiquota

•
Baixo PM (6-8 KDa)

•
30% Cisteína (-SH)

•
Alta afinidade por metais

pesados

Hg2+> Cu+> Cd2+> Cu2+> Zn2+

•
Homeostase de metais de transição

•
Proteção contra estresse oxidativo

•
Detoxificação de metais não essenciais

Estrutura da MT
Domínios
(4 Me2+) e 
(3 Me2+)
 Arranjo Metal-proteína

Formação de ligações Tetratioladas entre os metais bivalentes e os

grupos –SH da metalotioneína

10 20 30 40 50 60
Ac-MDPNCSCATDGSCSCAGSCKCKQCKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCSKGCICKEASDKCSCCA

Me2+ Me2+ Me2+ Me2+ Me2+ Me2+ Me2+

Efeito da exposição a metais (no lab) no acúmulo de MT (ptn) em
mexilhões (Mytilus galloprovincialis)

6 dias

Hg Cu Cd Ctr
 REGULAÇÃO GÊNICA DA METALOTIONEÍNA (MT)
•
Controlada principalmente a nível de transcrição

•
Induzida por agentes fisiológicos e estressores ambientais

•
Elementos regulatórios no promotor: Glucocorticóides-RE; cAMP-RE;

Antioxidante-RE; AP1

•
Indução por metais mediáda pelo MTF-1 e MRE.

AP-1 S8
CEBPE GATA-1 MRE
E2F
HSE

-1448 -1087 -725 -362 +1

PROMOTOR MT MEXILHÃO Mytilus galloprovincialis

REGULAÇÃO DE TRANSCRIÇÃO GÊNICA DE MT POR
MTF1/MRE
Receptor
Tirosina/Quinase
Ativado

MTF1

Citoplasma

MTF1
Núcleo

MTF1
Núcleo
MTF1 ATP
ADP

MRE
Promotor
Gene MT transcrito
 Crassostrea rhizophorae

•
Ampla distribuição em toda a costa brasileira

•
Sedentarismo
•
Hábito alimentar filtrador
Rebelo MF, Amaral MCR & Pfeiffer WC. 2003. High Zn and Cd contamination in oyster from a contaminated coastal lagoon and its
role in contamination assessment. Marine pollution bulletin. 46: 1354-1358.
Rebelo MF, Pfeiffer WC, Silva Jr H & Moraes MO. 2003. Cloning and detection of metallothionein mRNA by RT-
PCR in mangrove oysters (Crassostrea rhizophorae). Aquatic Toxicology. 64: 359-362.
 Quantitative Real time PCR
Basal expression of the MT10 & MT20 gene families

Amplification
MT10plot

actina

MT20

Target gene MT10 MT20 Actin

Control tissue (digestive gland) Ct 17.25 29.65 17.15
CV 1.5% 5% 1.5%
Dondero et al. 2005. Quantitative PCR analysis of two
E 91% 92% 92%
molluscan metallothionein genes unveils differential cDNA/ng RNA 1.05 10-5 12.3 N.D.
expression and regulation. Gene. 345(2):259-70.
 EXPRESSÃO DE ISOFORMAS MT10 E MT20 EM
MEXILHÕES Mytilus galloprovincialis

MT20-ATGCCTGGACCTTGTAACTGCATTGAAACAAACGTGTGTATTTGTGGTACCGGATGCAGCGGGAAATGTTGTCAATGTGGAGACGCCTGT
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MT20-CCGATAAACTGCAAATGTGAATCTGGATGCTCCTGCAAG 210
MT10-CCTTCAACGTGTAGATGTGCACCTGGTTGCTCCTGCAAA 210
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EXPRESSÃO DE MT10 E MT20 POR METAIS PESADOS

Cd MT10

Indução (vezes)
Cd MT20
Bulk rRNA 18s
Ctrl MT10 MT10 MT20
Ctrl MT20
Cd 24 2000
Cu 8 2,4
Zn 13 12
Hg 2 175

No de Ciclos

Dondero et al. 2005. Quantitative PCR analysis of two

molluscan metallothionein genes unveils differential
expression and regulation. Gene. 345(2):259-70.
 2D Mytilus galloprovincialis

Control Cadmium Treatment

Análise de perfis de expressão – Especificidade ao contaminante
Identificação de Proteínas – Biomarcadores

Pampanin et al., 2004. In press

Biomarcadores genéticos:
Indicação de efeito a nível de população

Inserções, deleções, substituições e ampliações levam a

alterações na estrutura e função das MTs

Alterações nas UTRs 5’ e 3’ influenciam na regulação da

expressão gênica

Alguns tipos de polimorfismos são favorecidos (fixados) em

ambientes contaminados

Alguns tipos polimórficos podem funcionar como

Biomarcadores genéticos e de efeito de contaminantes em nível
de população
POLIMORFISMO EM METALOTIONEÍNAS DE MOLUSCOS
BIVALVES
POLIMORFISMOS

Biomarcadores genéticos: Indicação de efeito a nível de

população

Alteração na estrutura e função de proteínas

Regulação da expressão gênica

Fixação em ambientes favoráveis (contaminados)

Tipos polimórficos de MT1 em Crassostrea gigas
Tanguy A, Mura C, Moraga D. 2001. Cloning of a metallothionein gene and characterization of two other cDNA sequences in
the Pacific oyster Crassostrea gigas (CgMT1). Aquatic Toxicology 55:35–47

Outras diferenças foram encontradas nas UTRs 5’ e 3’ que variaram entre

37-75pb e 118-139 pb, respectivamente.
Exon 2 – Tipos
Tipos A, B e C com
polimórficos 83% de
no exon freqüência
2 de cgMT1 na população.

Tipo C:
Aspargina (46)  Lisina
Cisteína (47)  Valina

Exon 3 –polimórficos
Tipos tipos A e B com
nofreqüência
exon 3 dedecgMT1
65 a 80%.
IDENTIFICAÇÃO DE MT2 EM Crassostrea gigas
Tanguy A, Moraga D. 2001. Cloning and characterization of a gene coding for a novel metallothionein in the Pacific oyster
Crassostrea gigas (CgMT2): a case of adaptive response to metal-induced stress? Gene 273:123-130

•
mesmas características estruturais de cgMT1

•
seqüência ~40% maior

Fixação de polimorfismos levando a uma maior adaptação ao ambiente contaminado.

Amplificação gênica relacionado ao estresse ambiental já descrita por outros autores

POLIMORFISMOS INTRÔNICOS EM cgMT2
Não se conhecem as implicações desse tipo de alteração na regulação das
MTs
•
Ampliação do gene cgMT2 sugere formação de um domínio

adicional

•
Capaciadade de acumulo de metal 50% maior que cgMT1 e

maior sobrevivência em exposição ao Cd

•
Indução apenas em altas concentrações de metais

POLIMORFISMOS EXÔNICOS COMO BIOMARCADORES
Tanguy A, Boutet I, Bonhomme F, Boudry P, Moraga D. 2002 Polymorphism of metallothionein genes in the Pacific oyster
Crassostrea gigas as a biomarker of response to metal exposure. Biomarkers 7: 439-450

Padrão de SSCP no exon 2 de cgMT1

Padrão de SSCP no exon 3 de cgMT1

Polimorfismo tipo C no exon 2 = resistência ao Cd!
Exon 2 – freqüência do tipo C
aumenta com a contaminação
da região

Exon 3 – freqüência do tipo A

diminui com a contaminação da
região.

Frequencia do tipo B diminui.

Maior frequencia do tipo C em

ostras resistentes a exposição
ao Cd em laboratório
CONCLUSÕES

Inserções, deleções, substituições e ampliações levam a

alterações na estrutura e função das MTs

Alterações nas UTRs 5’ e 3’ influenciam na regulação da

expressão gênica

Alguns tipos de polimorfismos são favorecidos fixados)

em ambientes contaminados

Alguns tipos polimórficos podem funcionar como

Biomarcadores genéticos e de efeito de contaminantes em
nível de população
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O2 no estado O2 no (singlet) O2- superóxido H2O2 peróxido
fundamental (tripleto) de hidrogênio
 


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 Inborn Errors of Metabolism, 1923
1902: Sir Archibald Garrod
suposição
-
The Incidence of Alkaptonuria: a Study in Chemical
Individuality.
Porque uma pessoa é suscetível e
outra não?
•
Polimorfismos
–
Alelos de um mesmo
gene (com freqüência >
1% na população) e
diferentes capacidades
metabólicas
 Metabolismo de compostos exógenos:
oxidação do álcool
•
Álcool desidrogenase
–
Constitutiva
•
Aldeido desidrogenase
–
Indutível
Table 2. Kinetic Properties of Alcohol Dehydrogenase (ADH) Proteins

Amino Acid
Official Gene Km(ethan Turnover
Differences Protein Name -1
Name* ol) mM (min )
Between Alleles
ADH1A
4.0 30
ADH1B*1 Arg48, Arg370 1 0.05 4
ADH1B*2 His48, Arg370 2 0.9 350
ADH1B*3 Arg48, Cys370 3 40 300
ADH1C*1 Arg272, Ile350 1 1.0 90
ADH1C*2 Gln272, Val350 2 0.6 40
†
ADH1C*352Thr Thr 352 — — —
ADH4
30 20
ADH5  >1,000 100
ADH6 ADH6 ? ?
ADH7  30 1800
 Citocromos P450
•
1963 – Stabrook, Cooper & Rosenthal
–
Primeira função
–
Hidroxilação do C-21 da 17hidroxiprogesterona
(CYP21)
–
Tb mostraram o envolvimento na oxidação de diversas drogas
–
A descoberta de sua função como oxigenase levou a um rápido
progresso nas pesquisas
Características estruturais
Reações catalisadas
Reações catalisadas
Muito além de oxidações
 Citocromos P450
•
Origens
–
Procariotos
–
Antes do desenvolvimento dos eucariotos
–
Antes do acúmulo de O2 atmosférico
–
O ancestral....CYP51
 Citocromos P450
•
781 Famílias •
8128 enzimas
–
110 animals –
2872 named animal P450s
–
95 plants –
2867 named plant P450s
–
205 bacteria (includes –
912 named bacterial P450s
10 Archaeal) –
239 named protist P450s
–
61 protist –
1238 named fungal P450s
–
310 fungi

http://drnelson.utmem.edu/CytochromeP450.html
Diversidade de Citocromos P450

CYP 1 A 1

Gene family Gene

Subfamily
Seleção dos novos CYPs
Adaptação a novos nichos
Corrida armamentista
Diversificação CYP2D6 em humanos
Ajuste de dose de
substratos do
CYP2D6 em
função do
fenótipo de
biotransformação
CYP2A6 1B associada a dependência ao fumo em brancos
e mulatos, mas não em negros
Porfiria induzida por dioxina
 PORFIRIA
•
Fotosensibilidade, porfirinas acumuladas na pele absorvem luz do sol tanto
no espectro ultravioleta, como visível e logo transfere sua energia ao
oxigênio da respiração que se libera sob a forma de EROs
•
Hirsutismo, o pelo cresce exageradamente e em lugares não habituais,
como no vão dos dedos e dorso das mãos, nas bochechas, no nariz para
proteger os lugares mais expostos à luz. Esses doentes saiam quase
exclusivamente à noite.
•
Pigmentação. A pele pode apresentar também zonas de despigmentação e
os dentes podem ser vermelhos.
Anais Brasileiros de Dermatologia. An. Bras. Dermatol.
vol.81
no.6
Rio de Janeiro
Nov./Dec.
2006. doi: 10.1590/S0365-05962006000600010