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Inmunoglobulina ADN clase recombinacin de cambio: la induccin, la orientacin y ms all

Resumen | ADN recombinacin de cambio de clase (CSR) de la cadena pesada de inmunoglobulina (IGH)
locus es fundamental para la maduracin de la respuesta de anticuerpos y de manera crucial requiere la AID
citidina deaminasa. RSE implica cambios en el estado de la cromatina y la activacin transcripcional del locus
de IGH en el interruptor de aguas arriba y aguas abajo (S) regiones que se van a someterse a S S-ADN de
recombinacin. Adems, la RSE implica la induccin de la expresin de AID y la focalizacin de los factores
de RSE a las regiones S por 14-3-3 adaptadores, y se ve facilitada por la maquinaria de transcripcin y por
modificaciones de las histonas.
En esta revisin, nos centramos en los ltimos avances en cuanto a la induccin y orientacin de RSE y
delinear un modelo integrado del conjunto de complejos macromoleculares que transduce informacin
epigentica crucial para efectores enzimticos de la maquinaria de la RSE.

Los anticuerpos (inmunoglobulinas) son mediadores centrales de la inmunidad. Neutralizan directamente


patgenos y productos derivados de patgenos, as como reclutan molecular y efectores inmunes celulares
para erradicar las infecciones y las clulas tumorales. Las clases de anticuerpos IgM, IgD, IgG, IgA e IgE se
identifican por las diferentes regiones constantes en sus cadenas pesadas y tienen distinta distribucin tisular
y la eficacia contra diferentes tipos de agentes patgenos. Molculas de IgM son secretadas como
pentmeros o hexmeros, tiene una alta avidez para los antgenos con motivos repetitivos (tales como los que
se producen en la mayora de los patgenos microbianos) y mediar la activacin del complemento. Sin
embargo, no pueden pasar al espacio extravascular, debido a su gran tamao. Por el contrario, la IgG
monomrica, IgE monomrica y dimrica IgA monomrica o pueden distribuirse sistmicamente a los tejidos,
en los que median una variedad de funciones efectoras biolgicas. Aunque las clulas B vrgenes expresan
solamente IgM e IgD, seleccionado clases de inmunoglobulinas y / o subclases (isotipos) son provocados
durante el curso de una respuesta inmune, dependiendo de la naturaleza del antgeno provocar y su modo de
ingreso. En los seres humanos, IgG1 e IgG3 son eficaces contra los virus, IgG2 contra bacterias
encapsuladas, IgG4 e IgE contra parsitos extracelulares grandes, y IgA1 y IgA2 contra bacterias patgenas
en las mucosas
Las regiones constantes de diferentes isotipos de inmunoglobulinas son codificadas por distintos grupos CH
exn, que se organizan en el orden C, C, C, C y C de la cadena pesada de inmunoglobulina (CIB) locus
(Fig. 1). Clase-switch recombinacin de ADN (RSE) da como resultado la sustitucin de la agrupacin CH
exn expresado - por ejemplo, C para IgM - con C, C o C, dando lugar, respectivamente, a IgG, IgA o IgE
en la que el antgeno regin de unin variable es inalterada. De la nota, IgD se genera no a travs de la RSE,
sino a travs de splicing alternativo de las (la lnea germinal) transcritos primarios que codifican IgM. CSR da
lugar a clulas B de clase conmutados, tales como clulas de IgG + B, que pueden responder a los antgenos
ms rpido que las clulas ingenuas Ig + o Ig + B, probablemente porque la cola ms larga citoplsmico del
receptor de clulas IgG B (BCR) induce BCR fuerte de sealizacin.
Junto con la hipermutacin somtica (SHM), que inserta principalmente mutaciones puntuales en el
anticuerpo regin variable de loci a una alta tasa para proporcionar un sustrato estructural para la seleccin
positiva de los mayores mutantes de afinidad por el antgeno, la RSE es fundamental para la maduracin de

la respuesta de anticuerpos provocada por infecciones naturales y vacunas. Resultados de RSE defectuosos
o aberrantes en una serie de enfermedades, incluyendo el sndrome de hiper-IgM (sndrome HIGM),
autoinmunidad sistmica o de rganos especficos, alergia y asma asociado con atpicas respuestas de IgE y
la transformacin neoplsica.

En esta revisin, nos centramos en los mecanismos moleculares que subyacen a la induccin de la RSE y
considerar las formas en que el interruptor aguas arriba y aguas abajo (S) regiones que han de someterse a
S-S ADN recombinacin estn dirigidos por la maquinaria de la RSE a travs de la ARN polimerasa II
maquinaria transcripcional y por medio de adaptador de protenas que se unen especficamente a
repeticiones en tndem que son caractersticos de ADN de la regin S. Tambin se discuten las funciones de
andamios emergentes tanto enzimtica y los elementos no enzimticos en la estabilizacin de los factores de
la RSE en las regiones S y consideran datos recientes sobre el papel de la induccin y regulacin epigentica
en especificando las regiones S que son el objetivo de la RSE. S generacin y resolucin regin OSD RSE
requiere la transcripcin que inicia en una IGH intervenir regin (IH) promotor y contina a travs del exn IH,
la regin S y luego el grupo CH exn; esto se conoce como la lnea germinal IH-S-CH transcripcin. RSE
tambin requiere deaminasa inducida por activacin citidina (AID), que desamina deoxycytosines en regin de
ADN S, produciendo deoxyuracils (Recuadro 1; Fig. 2). Los tratamiento de dichos deoxyuracils resultados en
la insercin de roturas en el ADN de doble cadena (DSBs) en el sentido ascendente (donante) y aguas abajo
(aceptor) S regiones. RSE luego procede a travs de la resolucin del OSD; esto conduce a la supresin de la
ADN intermedio (que da lugar a un ADN extracromosmico interruptor de crculo) y a la formacin de una
unin S-S que trae el CH regin de ADN aguas abajo ms cerca de la regin de ADN VHDJH.
Para iniciar la RSE, la expresin de la AID y otros factores se deben en gran medida upregulated, y estos
factores deben entonces ser dirigidos a las regiones S que sern sometidos a la recombinacin, donde
generan DSB y, finalmente, promover S S-ADN recombinacin.
La generacin de DSBs (que son compuestos intermedios de RSE obligatoria) implica processive
desaminacin AID-mediada de deoxycytosines, particularmente aquellos dentro de 5'-AGCT-3 'y 3'-TCGA-5'
repeticiones en tndem en el "ncleo 'de la regin S, produciendo altas densidades de deoxyuracils en ambas
hebras de ADN (Fig. 2). Deoxyuracils se eliminan por DNA glycosylase uracilo (UNG) - un elemento crucial de
la reparacin por escisin de base (BER) va - para producir sitios absicos. Escisin de estos sitios absicos
por endonucleasas apurnicos / apyrimidinic (APE) conduce a un solo captulo rompe ADN (SSB). SSBs
proximales en cadenas opuestas fcilmente pueden formar escalonados DSBs6.
Adems, escalonados DSB pueden surgir de AID y procesamiento UNG dependiente de DSBs regin S
contundentes generados por endonucleasa G, que escinde de uno y ADN doble varados principalmente a
desoxiguanina y desoxicitosina. Por ltimo, la topoisomerasa 1 puede introducir mellas en S ncleos regin,
probablemente mediante la escisin no B-forma de ADN. AID tambin puede ADN deaminate flanquean la
regin central S, pero menos eficiente debido a la escasez de repeticiones 5'-3'-AGCT. La desaminacin en
estas regiones conduce a la generacin de SSBs principalmente. Tales SSBs pueden ser convertidos a DSB
en una forma dependiente de protenas clave desajuste de reparacin (MMR), como MSH2 y MSH6. Estas
protenas pueden ser dirigidos a desoxiuracilo: desoxiguanina desajustes adyacentes a la SSB, donde
reclutan a los 5' 3'EXO1 exonucleasa para producir DSBs19 (Fig. 2). Por lo tanto, MSH2 complementa la

principal va BER (que depende de la regin S de ncleo y UNG) en la generacin de DSBs, como se destaca
por la ablacin de la RSE en las clulas B que carecen tanto de UNG y MSH2 (Ref. 20) y en clulas B que
carece tanto el ncleo S y MSH2 (REF. 21).

DSB en las regiones S se generan en condiciones fisiolgicas, pero son propensos a desencadenar el mismo
conjunto de respuesta al dao del ADN (DDR) factores que reparan DSB generados por agentes que daan el
ADN extrnsecos, como la radiacin ionizante. Los DSBs son finalmente resueltos por el extremo no
homloga clsica de unin (C-NHEJ) va o el final alternativo de unin (A-EJ) va (recuadro 2). Un papel para
C-NHEJ (que se produce en la fase G1 del ciclo celular) en la RSE es apoyada por la presencia predominante
de DSB regin S dependientes de la ayuda y IGH focos que contienen el factor de la reparacin de DSB
NBS1 (REFS 6,22). De la nota, la recombinacin homloga se produce en la G2 y M fases, pero no est claro
cuando se produce A-EJ. A-EJ - que est mediada por CTIP (tambin conocido como rbbp8) 23 y poli (ADPribosa) polimerasa 1 (PARP1) (Tabla 1) - funciona como una va de copia de seguridad cuando un factor
bsico de C-NHEJ est ausente y tambin se produce cuando DSBs se generan a travs de la MSH2- y la va
EXO1-dependiente. En general, la resolucin de S regin DSBs en la RSE es un proceso altamente
coordinado que utiliza la maquinaria de reparacin del ADN y mantiene la integridad genmica.

La induccin y regulacin de la RSE

La induccin de la RSE requiere que ambos estmulos primarios y secundarios. RSE estmulos inductores
primarios, ya sea de clulas T dependiente o independiente de clulas T, inducen la expresin de AID y otras
protenas que son importantes en la RSE a travs de factores de transcripcin como el factor nuclear-kB (NFkB) (Fig. 3). Secundaria estmulos inductores de RSE no puede inducir la expresin de AID, pero son
necesarios para dirigir el cambio de clase a IgG, IgA o IgE mediante la seleccin de la regin S aceptor travs
de la induccin de la lnea germinal IH-S-CH transcripcin. Estos estmulos secundarias incluyen la
interleucina-4 (IL-4), factor de crecimiento transformante- (TGF) y el interfern- (IFN; en ratones, pero no los
seres humanos). Durante T respuestas de anticuerpos dependientes de clulas, la RSE se presenta
principalmente en los centros germinales y se induce a raz de la participacin de CD40 en las clulas B por
trimrica CD154 expresado por helper folicular clulas T CD4 + (TFH). CD40 induce altos niveles de cambio
de clase a IgG1 e IgE en presencia de IL-4 y niveles moderados de cambio de clase a IgG2a e IgA en
presencia de IFN y TGF, respectivamente.
Deficiencia en CD40 o sus resultados CD154 ligando en el sndrome de HIGM en los seres humanos y muy
reducidos IgG, IgA e IgE niveles en mice6, lo que indica que CD40 tiene una papel crucial en T respuestas de
anticuerpos de clase con conmutacin dependientes de clulas. Sin embargo, los anticuerpos especficos IgG
e IgA pueden surgir en las primeras etapas de una infeccin antes clulas T auxiliares especficas son
activadas, lo que sugiere que la RSC de clulas T-independiente y-CD40 independiente tiene un papel en la
generacin de estos anticuerpos. En adicin, CSR de clulas T-independiente media la generacin de
anticuerpos IgG especficos para muchos antgenos microbianos, tales como polisacridos bacterianos. De
hecho, T clula o CD40 ratones deficientes tienen niveles normales de IgG3 de suero y pueden generar
anticuerpos IgG que son protectores contra una variedad de agentes infecciosos, aunque no tan

eficientemente como de tipo salvaje ratones mutaciones deletreas en los genes que codifican los receptores
Tolllike (TLRs), TACI (tambin conocido como TNFRSF13B) o las molculas de sealizacin corriente abajo
de estas receptores resultan en niveles reducidos de anticuerpos IgG polysaccharidespecific y respuestas
inmunes defectuosas a bacterias encapsuladas. Estos datos sugieren que CSR de clulas T-independiente es
inducida por TLRs y / o TACI. A pesar de ello, la participacin de los TLR o TACI - con o sin co-estimulacin
por IL-4, TGF o IFN - conduce a slo niveles marginales de la RSE. Sin embargo, la seal de BCR, que por
s solo no induce la RSE, sinergia con seales de TLR1-TLR2, TLR4, TLR7 y TLR9 para inducir de manera
eficiente el cambio de clase de IgG3 o, en presencia de IL-4, TGF o IFN, a otros isotipos de
inmunoglobulina; sino que tambin mejora el cambio de clase TACI-dependiente IgA33. El componente
microbiana slo se conoce que pueden inducir directamente eficiente RSE es lipopolisacrido bacteriano
(LPS). LPS no slo pueden participar TLR4 en las clulas B de ratn a travs de su fraccin de lpido A, pero
tambin pueden reticular las BCRs de una gran proporcin de clulas B a travs de su resto polisacrido
repetitivo (antgeno O). La necesidad de doble compromiso TLR y BCR para la RSE induccin destaca el
papel de forma natural vinculados patrones moleculares microorganismassociated y microbiana repetitivo
antgenos en la conformacin del response34 clulas B adaptativa. Al igual que la seal de BCR, la seal de
TACI sinergia con la seal del TLR7 y TLR9 para inducir la RSE.
En general, la participacin de CD40 inicia clulas T dependiente de la RSE, mientras que la doble TLR-BCR,
TACI-BCR o compromiso TLR-TACI induce RSE clulas T-independiente, que tiene un papel importante en T
respuestas de anticuerpos de clulas independiente y tambin en las primeras etapas de T respuestas de
anticuerpos dependientes de clulas.

La induccin de la AID.
Ya sea inducida en una celda de manera independiente de las clulas T dependiente o T, la RSE requiere
AID, que se expresa de una manera clulas B linaje especfico y la diferenciacin etapa especfica. AID es
virtualmente indetectable en clulas B en reposo maduro, pero se expresa en altos niveles en las clulas B se
someten a la RSC. Sin embargo, la AID puede mediar el cambio de clase a la IgE en las clulas B inmaduras,
a pesar de que se expresa en un nivel bajo en estas cells. Tambin podra mediar en la programacin
epigentica en clulas germinales primordiales y reprogramacin de clulas somticas. Esta idea es apoyada
por la evidencia reciente de que la AID (y miembros de la familia APOBEC) pueden promover la desmetilacin
de 5-hydroxymethylcytosines (que se producen a partir de 5-metilcitosinas por la familia TET hidroxilasas)
cuando se combina con la va BER, que elimina 5-hydroxymethyluracils (que probablemente se generan por
desaminacin AID mediada de 5-hydroxymethylcytosines) 38. Sin embargo, la regulacin estricta de la
expresin de AID es necesario evitar translocaciones cromosmicas y para mantener la integridad genmica
tanto en las clulas B y las clulas no-B. Esto se logra a travs de un control fino del gen AID (AICDA en seres
humanos y en ratones AICDA) y la protena, en el nivel de la transcripcin, la regulacin post-transcripcional,
la regulacin despus de la traduccin (incluyendo la distribucin nuclear y citoplasmtica y estabilidad) y la
funcin enzimtica.
La transcripcin del gen AID depende de NF-kB, que se activa en las clulas B principalmente por stimuli
CSRinducing primario (Fig. 3). De la nota, CD40, TLR y TACI, pero no la BCR, solo pueden inducir la
expresin de AID.

CD40 o compromiso dual TLR-BCR pueden activar las vas de NF-kB tanto cannicos y no cannicos. Debido
a su capacidad de participar TLR4 y para reticular BCR, LPS tambin activa las dos vas para inducir la AID;
induce el reclutamiento de la (no cannica) NF-KB p52 subunidad a la promoter28 gen AID y del (cannica)
p65 subunidad a un elemento potenciador de aguas arriba. Adems, la cintica de induccin AID (alcanzando
un mximo de 48-60 horas despus de la estimulacin) reflejan la cintica de activacin de la no cannica
ruta de NF-kB, que media la expresin gnica sostenida para apoyar la proliferacin celular (que se requiere
para RSC) y la diferenciacin.
Por el contrario, la va cannica NF-kB se activa rpidamente para inducir inmediata, pero normalmente
transitoria, la expresin gnica. Por lo tanto, la activacin de la cannica y no cannica NF-kB vas iniciados y
sostiene la transcripcin de genes AID.
Adems de NF-kB, que se expresa de forma ubicua y regula ampliamente muchos genes, factores de
transcripcin que se expresan en un lineage- clulas B y / o la diferenciacin de manera etapa especfica
regula la induccin de la AID. Entre ellos se destaca hoxc4, un factor de transcripcin homeodominio que est
altamente expresado por las clulas B y es inducida por los mismos estmulos que inducen la AID y la RSE.
Hoxc4 se une directamente al promotor del gen de la AID, que se conserva evolutivamente, en un sitio 5
'ATTT-3'incrustado dentro de un sitio de unin para la transcripcin de dominio que contienen POU factores
OCT1 y / o OCT2 (5'-3'-ATTTGAAT). NF-kappa B y SP1 tambin se unen a el mismo promotor (Fig. 3). Hoxc4
est regulada positivamente por estrgenos, potenciando con ello la expresin de AID y RSE, lo que sugiere
que el estrgeno puede ser responsable de la desregulacin de la AID en pacientes con lupus eritematoso
sistmico (LES), as como en ratones propensos al lupus. Estos ratones han aumentado los niveles de
autoanticuerpos translocaciones clase conmutados (y hypermutated) y cromosmicas, que son inducidos de
manera HOXC4- y dependientes de la ayuda.

La induccin de la expresin AID est influenciada por cuatro grandes regiones evolutivamente conservados
en el locus del gen AID travs de elementos cis-reguladores seleccionados, muchos de los cuales son sitios
para factores de transcripcin que se activan por la IL-4 y TGF (Fig. 3) vinculantes. Por ejemplo, transductor
de seal y activador de la transcripcin 6 (STAT6) es activada por IL-4 y probablemente se une a la regin I,
que se encuentra aguas arriba del promotor. Por otra parte, STAT6 IL-4-activa y activa-TGF SMAD3 y SMAD4
se unen a la regin IV, que se encuentra a 9 kb aguas arriba del promoter49. Protena protenas emparejado
cuadro 5 (PAX5) y E2A se unen a la regin II, que es en el primer intrn, y el factor de transcripcin AP1 BATF
familia se une a la regin III, que se encuentra a 17 kb aguas abajo del promotor. Estos factores de
transcripcin probablemente cooperan con NF-kB y hoxc4 sobre los elementos promotores y potenciadores,
probablemente a travs de interacciones de ADN de largo alcance, para mediar la induccin de la
transcripcin del gen AID en respuesta a estmulos y citocinas que inducen RSE primarios.
La transcripcin de genes AID se somete a regulacin negativa a travs de cuatro elementos cis-represivas
en la regin II: dos sitios de unin putativos para MYB, que se conoce para activar o reprimir la transcripcin
en funcin del gen diana; un sitio de unin putativo para la familia factor de transcripcin E2F, el cual contiene
ambos activadores y represores; y una secuencia de CT-rica 350 pares de bases. Tanto MYB y factores
inhibidores de la E2F familia se expresa en las clulas B vrgenes y clulas no-B y, por lo tanto, tiene un papel
importante en el silenciamiento de la expresin de la AID en esas clulas. En las clulas B que estn
experimentando el cambio de clase, este efecto silenciador o bien se elimina o superado por factores de

transcripcin activados por estmulos y citocinas que inducen RSE primarios. Por ltimo, la expresin de AID
es suprimida por la protena E-box inhibitoria ID2, que antagoniza PAX5 y E2A42. Por lo tanto, los factores de
transcripcin positivos y negativos restringir la ayuda de induccin a las clulas B se someten a la RSE y / o
SHM.

Germinal IH-S-CH transcripcin especifica RSE. Estmulos primarios permiten RSE, sino que requieren la
cooperacin de los estmulos secundarios a la conmutacin directa al predeterminado isotipos de
inmunoglobulina. Por lo tanto, los estmulos secundarios (es decir, IL-4, TGF o IFN) adaptar las funciones
efectoras de anticuerpos a diferentes mbitos del medio ambiente; por ejemplo, IgA es inducida en las
mucosas, donde TGF se produce a altos niveles. La especificacin de cambio de clase a un isotipo de
inmunoglobulina dado depende de la induccin de de la lnea germinal IH-S-CH transcripcin que progresa a
travs de la regin aceptor S; la regin donante S se transcribe constitutivamente. Durante elongacin de la
transcripcin, la la accesibilidad de la cromatina de las regiones S intrnicos se increased60
considerablemente, facilitando as su objetivo por la maquinaria de la RSE. Esto refleja el principio general
que se requiere un estado de la cromatina abierta para la recombinacin de ADN, la reparacin y la
replicacin. Germinal IH-S-CH transcripcin generara ADN de cadena sencilla en la cadena no transcrita en
las regiones S para permitir AIDmediated desaminacin de deoxycytosines. Durante la transcripcin, el
exosome ARN ha demostrado recientemente para permitir AID tambin deaminate deoxycytosines en la
cadena de ADN transcrita, posiblemente mediante la degradacin de las molculas de ARN en hbridos ARN:
ADN. De la lnea germinal IH-S-CH transcripcin se inicia por promotores IH especficas de una manera
dependiente en general factores de transcripcin activados por citoquinas. IL-4 activa STAT6, que se une a los
promotores I1 y varepsilon para iniciar la transcripcin de la lnea germinal que procede a travs
S1 y S, permitiendo de este modo el cambio de clase a IgG1 e IgE, respectivamente. TGF activa SMAD3,
SMAD4 y / o protenas RUNX para promover la transcripcin procediendo a travs S2b y S para el cambio
de clase de IgG2b e IgA, respectivamente. Finalmente, IFN activa T-bet, STAT1 y / o STAT2 para la iniciacin
de la transcripcin de la lnea germinal que procede a travs de S2a para el cambio de clase a IgG2a6,62.
La competencia entre los diferentes promotores IH para la maquinaria de transcripcin
mejora la seleccin de isotipo. Por ejemplo, Ikaros media la supresin de la lnea germinal I2a-S2a-C2a y
I2b-S2b-C2b transcripcin, downregulating con ello el cambio de clase de IgG2a e IgG2b, y promueve el
cambio de clase de IgG3 e IgG1 (REF. 64).
Como se mencion anteriormente, los estmulos primarios y secundarios activan distintos conjuntos de
factores de transcripcin. La divisin de las funciones especficas de estos factores, sin embargo, es borrosa
debido a su interaccin combinatoria de promotores y potenciadores en el locus IGH. IL-4, TGF y IFN slo
puede inducir niveles significativos de lnea germinal IH-S-CH transcripcin cuando CD40 o TLRs y BCR,
tambin participan. Suchtranscription se induce a niveles suficientes para la RSE slo en la presencia tanto de
un promotor de intrnica IGH completamente funcional (iE) 65 y la regin de control del locus situada aguas
abajo de C (3'-LCR). El 3'-LCR contiene varios DNasa I-hipersensible elementos potenciadores que pueden
ser activados por NF-kB, hoxc4, OCT1 y / o OCT2 (REF. 67), lo que sugiere que estos factores de
transcripcin probablemente interactan con las activadas por IL-4, TGF o IFN para mediar en la induccin
completa de transcription68. Estas interacciones pueden producirse a travs de largo alcance ADN "sinapsis"

la participacin de la 3'-LCR y promotores IH seleccionados. La interaccin combinatoria de los factores de


transcripcin inducidos por estmulos primarios y secundarios tambin es importante en la induccin de la
expresin AID. IL-4 STAT6 activado y protenas Smad activadas por TGF mejoran notablemente la induccin
AID por NF-kB, hoxc4, OCT1 y / o OCT2, que se activan por estmulos de RSE que inducen primarios. As,
mientras que los estmulos que inducen RSE primarios activan factores de transcripcin que regulan la
transcripcin del gen AID y varios otros genes, los estmulos secundarios activan factores de transcripcin que
se unen a diferentes promotores IH para iniciar la lnea germinal IH-S-CH transcripcin, especificando as las
regiones aceptor S que han de someterse a la RSE. La induccin completa de la lnea germinal IH-S-CH
transcripcin requiere la interaccin de los dos conjuntos de factores de transcripcin.

Focalizacin de la maquinaria de la RSE


La orientacin especfica de la maquinaria de la RSE a las regiones S que sern sometidos a la
recombinacin se basa en varios factores. La primera es la recurrencia en un alto frecuencia de repeticiones
5'-3'-AGCT en las regiones S, que no estn presentes en el genoma en su conjunto, ya que estas repeticiones
estn ligados especficamente por 14-3-3 adaptadores y otros Elementos de RSE. En segundo lugar, se
necesita el estado de la cromatina abierta inducida de las regiones de destino S (segn lo especificado por los
estmulos de RSE que inducen secundarias), y este estado permite para el acceso de la maquinaria de la
RSE. Por ltimo, la orientacin requiere el estancamiento de la ARN polimerasa II durante la lnea germinal
IH-S-CH transcripcin, lo que permite una alta tasa de de depsito sobre los S regiones de las molculas
AUXILIOS que estn enganchados a la polimerasa. Regiones S y repeticiones 5'-3'-AGCT. Regiones S son
los objetivos especficos de la maquinaria de la RSE, y la supresin de S o regiones S aguas abajo
ablaciona CSR69. La maquinaria de la RSE no inserta DSBs en sitios predeterminados dentro de las regiones
S. Ms bien, se puede introducir DSBs en prcticamente cualquier parte de una regin S (que va desde 3 kb a
10 kb de longitud), pero con una fuerte preferencia por su ncleo. El ncleo de todas las regiones S es
altamente enriquecidas en repeticiones 5'-3'-AGCT. Estos representan ms del 45% de ADN S ncleo pero
menos de 1,4% del ADN en el genoma, incluyendo CH regions70. La frecuencia de las repeticiones de 5'-3'AGCT en regiones S se conserva a travs especies que utilizan la RSE para diversificar sus anticuerpos,
desde ranas para humans70 (ver informacin complementaria S1 (figura)). Los altos niveles de suero de
inmunoglobulina especfica isotipos en ciertas especies (por ejemplo, IgE en los caballos y IgG2a en ratas)
probablemente reflejan la adaptacin de las especies a las presiones selectivas inducida por patgenos como
resultado de condiciones de vida de acogida o dietas. Los altos 5'-3'-AGCT frecuencias en las regiones S de
los loci que codifican estos isotipos son, por lo tanto, sugerente de un beneficio evolutivo de tndem 5'-3'AGCT repite con la RSE. RSC est alterada en las clulas B en el que el ncleo S ha sido borrada y est
casi abolido en las clulas B cuando la eliminacin del ncleo S se ve agravado por la abrogacin de MSH2
expression21. Adems, la sustitucin de la regin de ratn S1 con el extremo 5 'AGCT-3'-rica regin S de
Xenopus laevis promueve el cambio de clase a IgG1 (REF. 71), y la sustitucin de la regin S1 ratn de
longitud completa con S1 y S3 ncleos, los cuales son ricas en repeticiones 5'-3'-AGCT, era suficiente para
inducir la RSE en este sitio. Estas observaciones apoyan an ms la importancia crucial de repeticiones 5'-3'AGCT en la RSE. Adems, 5'-3'-AGCT es una versin de un punto de acceso 5'-3'-RGYW de SHM, y esta
secuencia hotspot contiene el motivo desaminacin AID 5'-3'-WRC en ambas hebras de ADN. Por lo tanto, se
repite 5'-3'-AGCT proporcionan el sustrato para la AID para generar deoxyuracils a altas densidades en
ambas hebras de ADN, dando lugar a la formacin de DSB en la regin del ncleo S. Dada la escasez de

repeticiones 5'-3'-AGCT en las zonas que flanquean la regin central S, desaminacin AID mediada en esas
zonas - que depende probablemente en el R-loop formacin-dara lugar a la generacin de SSBs
principalmente, que se puede convertir a DSB de manera MSH2-dependiente.
Por lo tanto, los 5'-3'-AGCT repeticiones centrales proporcionan los sustratos estructurales que median la
afinidad intrnseca de la maquinaria de RSC para las regiones S pero no para otro ADN secuencias en el
locus IGH o en los genes no inmunoglobulinas en el genoma en general.

14-3-3 protenas como objetivo adaptadores.


Repeticiones 5'-3'-AGCT no son slo los sustratos preferidos de la ayuda, sino tambin la objetivos
especficos de las protenas 14-3-3 adaptador, que no se unen a otras iteraciones 5'-3'-RGYW o motivos ricos
en G.
14-3-3 adaptadores son reclutados para S regiones (Fig. 2), y la inhibicin de su unin a las regiones S
usando difopein resultados en RSE disminuida. Adems, las clulas B que son deficientes en 14-3-3 o que
expresan un dominante negativo
Mutante 14-3-3 es defectuoso en CSR70.
14-3-3 protenas tienen un papel importante en la orientacin de la maquinaria de RSC a las regiones S, en
virtud de su capacidad para tender un puente sobre las protenas con ADN u otras protenas. Ellos interactan
directamente con la AID y la protena quinasa A subunidad- cataltica (PKA-C) y median la unin de la AID y
PKA-C a las regiones S, donde fosforila PKA
AID75 (Fig. 2). La unin de las protenas 14-3-3 a la AID depende de la regin carboxi-terminal de AID70, que
contiene la secuencia de exportacin nuclear (NES). Esta regin es prescindible para la actividad
desaminacin de la AID, pero es crucial para la RSE y se ha planteado la hiptesis de que el sitio de unin de
cofactores RSE especficos de la AID.
El fracaso de una ayuda C-terminal truncado mutante (AID1-190) - que se encuentra en algunos pacientes
con sndrome HIGM - para unirse a 14-3-3 adaptadores explica por qu este mutante AID no se puede
concentrar en las regiones S.
De hecho, hace cumplir 'unin' de AID1-190 a 14-3-3 travs de la vinculacin fsica de los dos pptidos
podran rescatar plenamente la RSE en las clulas AUXILIOS deficientes B (TM, EJP, G. Li, J. Moehlman,
Z.X. y P.C., observaciones no publicadas). Por el contrario, la RSE no poda ser rescatado mediante la
vinculacin de AID1-190 a un NES de otra protena, tal como protena quinasa inhibidor-, el VIH-1 Rev,
humano linfotrpico-T virus 1 (HTLV-1) Rex, un mitgeno protena quinasa activada o vinculante RAN-protena
1 (REF. 79). Esto sugiere que 14-3-3 adaptadores son cofactores que se unen a la C-terminal de la AID y son
necesarias para la RSE. Por lo tanto, la orientacin inherente de las regiones S por la maquinaria de RSC
depende de 14-3-3 adaptadores, ya que estas protenas son altamente especficos para las repeticiones 5'-3'AGCT. 14-3-3 adaptadores tienen un papel importante en la regin de ADN S en el reclutamiento y la
estabilizacin de la AID y la PKA.

Transcripcin y RSE focalizacin.


La alta densidad de repeticiones 5'-3'-AGCT en todos los S regiones y el alta avidez inherente de 14-3-3
adaptadores para esas repeticiones asegurar que 14-3-3 adaptadores se pueden unir a cualquier regin S.
Sin embargo, estos adaptadores (as como otros factores RSE) se dirigen solamente las regiones donantes y
aceptor S que sern sometidos a recombination70. Esto es probablemente debido a la presencia de un
estado de la cromatina abierta en estas regiones S que proporciona el acceso de los factores de RSE, como
se refleja por el (constitutiva o inducida) de lnea germinal IH-S-CH transcripcin en las regiones donantes y
aceptor S.
Un papel directo de la lnea germinal IH-S-CH transcripcin en AID focalizacin fue sugerida por la asociacin
selectiva de AID con la RNA polimerasa II y el transcrito S regin DNA80,81. En consecuencia, la RSE se
altera en las clulas B con deficiencia de protenas de unin a AID que tambin funcionan en el metabolismo
del RNA. Tales protenas incluyen la elongacin factores de transcripcin SPT5 y SPT6, polypyrimidine
protena de unin al tracto-2 (PTBP2), que regula el empalme de ARN y el exosoma ARN, que funciones en el
procesamiento del ARN (Fig. 4). ARN polimerasa II se estanc o se detuvo en S regions, tal vez debido a las
conformaciones de ADN secundarias complejas (como estructuras cruciforme similares) ha sido posible
gracias palindromic repite 5'-3'-AGCT. La interaccin de AID con ARN polimerasa II es mediada por SPT5,
que, al igual ARN polimerasa II, se enriquece en S regions83. SPT5, sin embargo, tambin se enriquece en
los promotores de una proporcin sustancial de transcrito activamente no inmunoglobulina genes83,
coherente con los resultados que muestran el genoma unin de AID para genes88 transcrito. La sugerencia
de que la contratacin AID est mediada por SPT5 y ARN polimerasa II estancamiento presta apoyo a la
modelo propuesto que la maquinaria SHM AID-centrado est vinculada a la machinery transcripcional y
explica reciente datos que indican que la ayuda puede generar mutaciones en muchos genes transcritas. El
loci no inmunoglobulina unin de ayuda a las regiones S y seleccionado - junto con el capacidad de la
exosome ARN para permitir AID a deaminate deoxycytosines en ambas hebras de ADN transcritas no
transcritas y - que tambin proporciona una explicacin para la generacin AIDmediated de DSBs en las
regiones S y, por lo tanto las frecuencias ms bajas, todo el genoma. DSBs que no se resuelven a travs de
intra-S o inter-S regin recombinaciones proporcionan el sustrato para translocaciones interchromosomal.
Tales translocaciones pueden ser perjudiciales, particularmente cuando la translocacin implica oncogenes
(tales como MYC), como ocurre a altas frecuencias en el linfoma de clulas B. Esto pone de relieve, adems,
que la expresin de la AID, la actividad y la focalizacin necesidad de ser estrechamente controlados. Por lo
tanto, los mecanismos altamente regulados deben estar en su lugar para dirigir la ayuda a las regiones S
intrnicos, que tienen la mayor densidad en el genoma de las molculas de ayuda que se diriga. AID puede
asociar con la RNA polimerasa II a travs SPT5 y mayo luego 'paseo' en la maquinaria de transcripcin de
'barrido' el transcriptoma hasta que la polimerasa se estanc en regin de ADN S. All, la AID se estabiliza
mediante la unin a 14-3-3 adaptadores (Fig. 4). Esto es una reminiscencia de la focalizacin de p53, que
utiliza un dominio no esencial de obligar 'no especficamente "para y rpidamente deslizarse a lo largo de
ADN hasta que haga' xitos 'un objetivo secuencia que luego es obligado por el dominio del ncleo p53 con
alta affinity95. 14-3-3 mediada por la estabilizacin de la AID en regiones S puede, a su vez, contribuir a un
mayor estancamiento o la pausa de la maquinaria de transcripcin y, por lo tanto, el enriquecimiento de la
ARN polimerasa II en las regiones S. Por lo tanto, la orientacin de la maquinaria de la RSE a las regiones S
que han de someterse a la recombinacin se hace posible por el estado de la cromatina abierta de esas S
regiones. Este estado est habilitada de lnea germinal IH-S-CH transcripcin, y se asegura que 14-3-3
adaptadores tienen acceso a los 5'-3'-AGCT repite slo en las regiones S que han de someterse a la

recombinacin, con todas las dems regiones S restante inaccesibles. Estancamiento de la ARN polimerasa II
en las regiones S durante la transcripcin permite la deposicin de la AID, que se concentra an ms por 143-3 adaptadores.

Epigentica y andamios protenas


En las regiones S, el reclutamiento, la estabilizacin y la funcin enzimtica de la AID, la glicosilasa UNG y
otras enzimas RSE requieren interacciones adicionales, que implican los dominios no catalticos de estas
enzimas, adaptadores no enzimticos (como las protenas 14-3-3) y especfica modificaciones de las histonas
que son inducidos en la regin S objetivos de la RSE.
Funciones de andamios de 14-3-3 y el EPR. En la RSE, la focalizacin de la AID, la insercin de las DSB y la
resolucin de DSBs dependen de la formacin de macromolculas complejos que contienen ADN de la regin
S. Proponemos que estos son nucleados por la unin de homodmeros, heterodmeros 14-3-3 o tetrmeros de
alta avidez a 5'-3'-AGCT repeticiones en tndem en la regin del ncleo S. Adems, como proteins96
andamio, las protenas 14-3-3 estabilizar la unin de la AID y la PKA de ADN de la regin S y potenciar la
actividad de desaminacin AID70. Dentro del mismo complejo macromolecular, la fosforilacin de la AID PKA
mediada en la serina replicacin 38 reclutas protena A (RPA), que mejora la desaminacin AYUDA mediada
deoxycytosines. RPA, probablemente, tambin funciona como un andamio de protenas para estabilizar los
factores de RSE durante la etapa posterior a la desaminacin. Tales factores incluyen UNG98, proteins99
MMR y la complex100 MRE11-RAD50-NBS1 (MRN) durante la generacin de DSBs, as como fosforilados
histona H2AX (H2AX) 101, la protena de unin p53-1 (53BP1) 102 y la protena dependiente de ADN
subunit103 cataltico quinasa durante la resolucin de DSB. El hallazgo de que RPA interacta con la regin
amino-terminal de UNG, que es crucial para CSR104, apoya la idea de que la funcin de andamio RPA tiene
un papel importante en la RSE. Funciones de andamios de la AID y REV1. Adems de posee actividad
desaminacin, molculas AUXILIOS funcionan como elementos de andamio para reclutar a otros factores de
RSE (como UNG, MSH2 y MSH6) a las regiones S y / o para estabilizar los there.AID molculas son, a su
vez, se estabilizaron por estos factores. La estabilizacin de reciprocidad y de cooperacin de la AID con
UNG, MSH2 y MSH6 no implica la interaccin directa de la AID con estos factores y depende de la regin Cterminal de AID78. Esta regin tambin media la unin a 14-3-3 AID, lo que sugiere que las protenas 14-3-3
-que pueden interactuar directamente con UNG (T. Lam y PC, observaciones no publicadas) - AYUDA puente
y UNG para formar un AID-14- compleja 3-3-UNG. Esto podra mejorar el tratamiento de los deoxyuracils
AUXILIOS generados por UNG promover la eventual formacin de DSB. Por otra parte, la AID y UNG pueden
tener un papel durante la etapa de resolucin del OSD en factores que intervienen en C-NHEJ ms de los que
participan en A-EJ, como lo sugiere el aumento microhomology (una caracterstica de la A-EJ) en las uniones
S-S en pacientes estabilizacin que expresan el mutante de truncamiento C-terminal AID1 -190 o que son
deficientes en UNG105. As, media la regin la ayuda C-terminales RSE tanto por la orientacin ayuda a las
regiones a travs de S 14-3-3 protenas adaptadoras, que conduce a la insercin de DSBs, y mediando
funciones de andamio que permiten la estabilizacin de factores de reparacin de ADN, que median OSD
resolution78,105,106. Estas actividades contrastantes de la regin AID C-terminal proporcionan una
explicacin para el descubrimiento de que los niveles detectables de S regin DSBs en las clulas B que
expresan AID1-190 son comparables a los de las clulas B que expresan de tipo salvaje AID106.

De manera similar a AID, UNG media la CSR de una manera dependiente tanto en residues104 aminocido
cataltica y no cataltica. Adems de 14-3-3 y el EPR, el translesion
ADN polimerasa REV1 interacta directamente con UNG a travs de la no cataltica 231WXXF234 motivo de
UNG y recluta UNG a las regiones S para mediar RSE (HZ, C. A. White, L. Thomas, J. Zhang, G. Li, E. S. Yu,
ZX, TM y P.C., observaciones no publicadas). Por lo tanto, UNG se cree que est estabilizado en regiones S
por tres factores: por RPA a travs del dominio N-terminal de UNG98; por 14-3-3 travs de su dominio Cterminal (de una manera independiente de la 231WXXF234 motivo); y por REV1 a travs 231WXXF234 (HZ,
C. A. White, L. Thomas, J. Zhang, G. Li, E. S. Yu, ZX, TM y PC, observaciones no publicadas). Curiosamente,
la actividad cataltica de REV1 (es decir, la incorporacin de deoxycytosines opuestos deoxyuracils y sitios
absicos) es importante en SHM107 pero prescindible en CSR108, lo que sugiere que las funciones de REV1
slo como un andamio de protenas en este proceso. En general, ambos elementos enzimticos y adaptador
de protenas no enzimticas ejercen funciones de andamios en la RSE a travs del ADN-protena y protenaprotena interacciones multivalentes, con lo que la estabilizacin de cada cooperativa otros, as como otros
factores, de ADN de la regin S (Fig. 4).
Modificaciones de las histonas en las regiones S. Las enzimas y molculas adaptadoras son reclutados
selectivamente a y se estabilizaron en las regiones S que han de someterse a la recombinacin porque slo
estas regiones S estn en un estado de la cromatina abierta. Esto es un reflejo no slo de la lnea germinal
IH-S-CH transcripcin, sino tambin de los cambios en modificaciones de las histonas, en las regiones S
aceptor. De hecho, estas regiones pierden modificaciones de las histonas represivas, como trimethylation de
la histona H3 lisina 27 (H3K27me3), y adquieren modificaciones de las histonas permisivas, como H3K4me3
(de la nota, S es 'constitutiva' marcada por las modificaciones que activan en IgM-que expresan las clulas
B). Estas modificaciones de las histonas tienen un papel importante en la RSE de forma independiente de la
lnea germinal IH-S-CH transcripcin, como lo sugiere el cambio de clase defectuoso a IgA que se observ en
una lnea de clulas B de ratn - a pesar de la lnea germinal normales I-S-C transcripcin - siguiendo
pequea interferir regulacin a la baja de ARN mediada histona metiltransferasa expresin y el deterioro
posterior en la generacin de H3K4me3 (REF. 112). Modificaciones de las histonas permisivos son inducidas
por estmulos de RSE que inducen primarias en regiones aceptor S que se especifican por estmulos
secundarios (como la IL-4 o TGF), que por s sola no puede inducir a tales modificaciones.
La induccin simultnea de modificaciones de las histonas (un proceso denominado "cdigo de histonas
escritura") y de la lnea germinal que HS-CH transcripcin sugiere una regulacin coordinada de ambos
procesos por factores de transcripcin que se unen especficamente a los promotores IH (Fig. 4). Tales
factores de transcripcin pueden reclutar PAX-protena de interaccin 1 (PTIP), que tiene un papel crucial en
la iniciacin de la lnea germinal IH-S-CH transcripcin y en la generacin de mltiples modificaciones de las
histonas (H3K4me3, y H3K36me3
Acetilacin H3K27, pero no monometilacin H3K4) en S regions60. En contraste con la escasez de
modificaciones de las histonas permisivas o activadores (particularmente H3K4me3) en los cuerpos de los
genes transcritos (en comparacin con los promotores de dichos genes) en el genoma en large113, tales
modificaciones de las histonas se enriquecen en las regiones S en niveles ms altos que los de los
promotores IH, exones IH y CH exones. Esta diferencia podra deberse a la contratacin y / o estabilizacin
de enzimas modificadoras de histonas a travs del estancamiento del complejo de ARN polimerasa II, y por lo
tanto estas enzimas puede ser enriquecido en las regiones S en la lnea germinal IH-S-CH transcripcin.

De acuerdo con la hiptesis de cdigo de histonas, patrones combinatorios de modificaciones de las histonas
no slo cifrar la informacin para especificar los estados de la cromatina distintos, pero tambin aumentan la
complejidad de chromatininteracting effectors114, determinando as los resultados especficos de informacin
biolgica. Los altos niveles de modificaciones de las histonas especficas en las regiones S que sern
sometidos a la recombinacin sugiera que estas modificaciones tienen un papel en el reclutamiento y la
estabilizacin de los elementos de RSE. Por ejemplo, H3K9me3 (una modificacin de las histonas
nominalmente represiva) en donantes regiones S est obligado por HP1 (protena heterocromatina 1), que
est complejado con KAP1 (protena de dominio asociada KRAB 1) y la ayuda en S pero no en cualquier
regin aceptor S, y las clulas B deficientes para la exhibicin KAP1 redujo la unin de AID para S y CSR115
defectuoso. Adems, 14-3-3 protenas se unen a la modificacin de histonas H3 combinatoria K9 acetilacinS10 fosforilacin (H3K9acS10ph), facilitar crosstalk116,117 de histonas y son probablemente los lectores de
modificaciones especficas de las histonas en las regiones S (Fig. 4). La estabilizacin de las protenas 14-3-3
en regiones S a travs interacciones con repeticiones 5'-3'-AGCT y H3K9acS10ph seran paralelas al
reclutamiento del complejo RAG1 RAG2 a V (D) J centros de recombinacin a travs interacciones con
secuencias seal de recombinacin y H3K4me3 (Ref. 118).
Por lo tanto, los cdigos especficos de las histonas son 'escritos' en las regiones S que han de someterse a
la recombinacin. Las enzimas modificadoras de histonas que son responsables de estos cambios estn
enganchados a la ARN polimerasa II y por lo tanto se convierten enriquecido en las regiones S en la lnea
germinal IH-S-CH transcripcin, que se inicia por la transcripcin especfica factores que son activados por la
combinacin de los estmulos inductores de RSE primarios y secundarios. Tales cdigos histonas son ledos
por factores de RSC, tales como adaptadores 14-3-3, con ello estabilizar an ms las protenas 14-3-3 en
estas regiones S. Finalmente, las protenas 14-3-3, as como otras protenas de andamiaje (tales como EPR y
REV1), estabilizan AID y / o UNG en regin de ADN S y mejorar su actividad enzimtica, contribuyendo as a
la transduccin de la informacin epigentica a factores cruciales de RSE.

Conclusiones
Estmulos de RSE que inducen primarias proporcionan el principal impulso de la RSE mediante la induccin
de la expresin de la AID y otros factores cruciales en materia de RSE, as como por la histona induciendo
modificaciones. Estmulos secundarios especifican la regin (s) aguas abajo (aceptor) S que se someter a la
lnea germinal IH-S-CH transcripcin, modificaciones de las histonas y, eventualmente, recombinacin. Esta
divisin de roles, sin embargo, es borrosa, como estmulos primarios y secundarios sinergia - a travs de la
interaccin combinatoria de factores de transcripcin - Para inducir la AID, transcripcin y las histonas
modificaciones IH-S-CH lnea germinal. Una mejor caracterizacin de la contratacin y la interaccin de estos
factores de transcripcin dara lugar a una mejor comprensin de la dinmica de la apertura de la cromatina y
la accesibilidad en el locus IGH. La induccin de un estado de la cromatina abierta y lnea germinal
IH-S-CH transcripcin en las regiones donantes y aceptor S permite la focalizacin de las protenas 14-3-3 a
estas regiones S. Esta orientacin se basa en la alta avidez inherente de estas protenas de 5'-3'-AGCT
repeticiones, que son caractersticos de toda S regiones.
A travs de la interaccin directa con la AID y otros factores de RSE, las protenas 14-3-3 en regiones S
pueden nucleada el montaje de ADN macromolecular y protenas complejos, en los que las protenas de

andamiaje (ambas enzimas y elementos no enzimticos) estabilizan ms factores de RSE en las regiones S.
La composicin dinmica de tales complejos macromoleculares y la naturaleza de los lectores de cdigos de
histona dentro de los complejos an no se han esclarecido completamente.
La regulacin de la RSE induccin por TLR y estmulos BCRdependent y por diferentes tipos de clulas hay
que explorar, as como la contribucin de la RSE a la modulacin de la diferenciacin de clulas B. Es
probable que esto mejorar nuestra comprensin de la desregulacin de la diferenciacin de las clulas B y
'dirigido fuera de' de la ayuda, que puede conducir a translocaciones cromosmicas y la transformacin
neoplsica.