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CENTRIFUGACIN DE EMBRIONES DE RATN EN FASE DE 2

CLULAS: ESTRATIFICACIN Y RECUPERACIN CITOPLASMTICA


Resumen
Embriones de ratn en fase de 2 clulas, los cuales fueron durante 1h
a 70 000-90 000 x g, lo cual mostr una precisa estratificacin del
citoplasma y una elongacin del ncleo. Los embriones fueron fijados
a diferentes tiempos y fueron observados por microscopa ptica y
electrnica utilizando mtodos citoqumicos y extracciones con
detergente. Entre 40 minutos despus de la centrifugacin, se
recuper el aspecto normal de su morfologa con excepcin de las
tapas de lpidos persistentes en los polos centrpetos de los
blastmeros. La segmentacin, compactacin y blastulacin no
fueron impedidos por centrifugacin. Los tratamientos con colcemid o
citocalasina D retrasaron, mas no evitaron la recuperacin
citoplasmatica. Estos resultados
sugieren que una estructura
resiliente del citoesqueleto que puede estar implicada en este tipo
de regulacin embrionaria.
Introduccin
Embriones
de ratn en
fase de 2 clulas, observados por
inmunofluorescencia, muestran una regionalizacin de miosina. fodrina
y espectrina y en la fase de cuatro clulas en adelante una
regionalizacin de fosfatasa alcalina y actividad de la 5' nucleotidasa,lo
cual se puede demostrar en la membrana celular. Ninguna regin
distinta ha sido reconocida anteriormente, ya sea en el ovocito o en el
vulo fertilizado, lo cual puede ayudar a establecer una lnea de clulas
que enlace los primeros blastmeros con las clulas diferenciadas de
blastocistos. Adems, embriones alterados experimentalmente son
capaces de regular y desarrollar un blastocisto normal.
Estas
observaciones, sin embargo, no excluyen la existencia de una
estructura espacial oculta que puede determinar el desarrollo, aunque
tal determinacin podra ser controlada por la regulacin embrionaria.
Aqu se analiza la estructura espacial de un embrin de 2-celulas por
medio de su centrifugacin y posterior cultivo in vitro. Este mtodo no se
ha utilizado en los mamferos, excepto por un interesante informe de
investigacin preliminar por Mulnard(1970).
Materiales y mtodos
Recoleccin de embriones. (dos clulas colectadas en medio Biggers 4
mg / ml de albmina de suero bovino (BSA) (Calbiochem) de ratones
superovulados de la cepa CF 1, 36 h despus de la supuesto tiempo de
ovulacin).
Procedimiento de centrifugacin. Soluciones de Dextrano (MW 40.000
Sigma) fueron preparadas en medio Biggers a concentraciones de 17%,
15%, 13% y 11% (w / v). Gaseados por separado con C0 2 en aire con el
fin de ajustar el pH entre 7.2 a 7.4 y luego introducidos
secuencialmente en tubos de 0,8 ml de nitrocelulosa. Los embriones

fueron colocados en la capa ms ligera de la gradiente discontnua y los


tubos fueron centrifugaron durante 60 min utilizando el rotor de cubeta
oscilante SW 39 de la centrfuga Beckman modelo L. Las fuerzas
centrfugas aplicadas oscilaron de 15.000 hasta 120.000 x g. La
temperatura del contenido de los tubos vari entre 13 y 18 C, excepto
para los experimentos en los que se llev a centrifugacin a 4 C.
El cultivo in vitro. Despus de la centrifugacin los embriones se
enjuagaron con medio Biggers y, o bien fijado inmediatamente o
cultivadas durante diferentes momentos antes de la fijacin. Los
embriones fueron cultivados en microgotas de medio Bigger con BSA
en placas Petri de plstico (Falcon) bajo aceite mineral a 37 C en
una atmsfera hmeda con 5% de CO, en el aire, pH 7.2 a 7.4. El
nmero de clulas se determinaron por el mtodo de Tarkowski. Antes
de y durante la centrifugacin los embriones fueron expuestos a
temperatura ambiente y a la atmsfera; los controles se trataron de
forma similar.
Microscopa ptica y electrnica. Despus de centrifugacin y cultivo in
vitro, los embriones fueron procesados para microscopa ptica y
electrnica como se inform anteriormente sin la adicin de cido
tnico. La microscopa de luz se llev a cabo en preparaciones
completas en glicerol. En algunas series experimentales,
inmediatamente despus de la centrifugacin los embriones se
lavaron en un buffer de estabilizacin, se permeabilizaron con 0,5%
Triton X-100 en buffer de estabilizacin para 1 min a 37 C y se lav
en el mismo buffer durante 30 s antes de la fijacin.
Tcnicas citoqumicas. La Manifestacin inespecfica de lpidos se logr
mediante Red Oil, Sudn Black y por su osmiofilia. La presencia de
fosfatasa cida se demostr en todos lo embriones segn el mtodo de
Gomori modificado por Weissenfels . EL ADN se demostr mediante
una prueba modificada de Feulgen se haban fijado en alcoholformaldehdo cidoactico.

Inhibidores del citoesqueleto: stos inhibidores se aadieron al medio


de cultivo y al gradiente de Dextrano. Algunos experimentos se
llevaron a cabo con una mezcla de 0,5 ug / ml de colemid (Sigma) y
0,5 ug ml de citocalasina D (Sigma), otros se llevaron a cabo ya sea
con colcemid (2 ug / ml) o con citocalasina D (0,5 giga ml); por ltimo,
algunos experimentos se llevaron a cabo a 4 C. Los embriones
fueron cultivados en medios que contenan inhibidores por 1h antes,
durante y despus de la centrifugacin. Los inhibidores se prepararon
en dimetilsulfoxido (DMSO) y no se observaron diferencias ser entre
los controles con o sin DMSO.
Resultados

Estratificacin: observaciones al microscopio ptico


Despus de la centrifugacin, los embriones se encontraron en las
capas correspondientes a 13% o 15% de Dextrano. Las fuerzas
centrfugas superiores a 30.000 x g indujo una visible y reproducible
estratificacin del citoplasma (ver Figs. 5. 7). Algunos embriones
empezaron a romperse a 120.000 x g.

El embrin 71 fijado tras la centrifugacin a 70000xg o 90.000 x g


mostr bajo el microscopio de luz una ligera elongacin de sus
blastmeros en el sentido de la fuerza centrfuga y algunas veces un
estrechamiento. Los embriones orientados generalmente a s mismos
de tal manera que los estratos estaban en un ngulo de 90 con
respecto al plano de separacin de los blastomeros. El cuerpo polar se
observ con mayor frecuencia en el polo centrfugo.
Una tapa de material lipdico fuertemente teidas con Sudn Negro
o Rojo Aceite o Tetroxido osmio fue encontrado en el polo centrpeto de
cada blastmero (fig. 5). Debajo de la tapa de lpidos se observ una
capa hialina, que en su margen centrpeto se ti dbilmente para la
actividad de fosfatasa cida. Bajo la capa hialina, una capa granular se
extendi hasta el polo centrfugo. En esta capa, el ncleo puede verse
abarcando desde el centro del blastmero al polo centrfugo, como si
hubiese sido empujado en esa direccin por el denso nuclolo (Fig. 7).
La prueba Feulgen no revel ninguna cromatina fuera del ncleo
elongado.
El 33 que fue extrado con Triton X-100 antes de la fijacin y la
observacin a microscopa de luz mostr estratificacin similar a la de
los no extrados. Incluyendo las tapas de lpidos. Sin embargo, la capa
de hialina apareci parcialmente extrada y se observ una reduccin
general en el volumen de los blastmeros de alrededor de 50% (fig.
8).
Estratificacin. Observaciones al microscopio electrnico
En 62 embriones, que se observaron por microscopa electrnica, las
capas descritas por microscopa de luz pueden ser subdivididas en
zonas. La tapa de lpidos corresponde a la zona de lpidos (Fig. 2) y la
capa hialina se subdivide en una zona centrpeta llena de vesculas y
membranas, y una zona centrfuga homognea (Fig. I, 2). La capa
granular est subdividida en una zona centrpeta que se caracteriza
por el material de las mitocondrias y material fibrilar (fig. 3) y una
zona de centrfuga que muestra cuerpos cristaloides (fig. 4).

La zona de lpidos contiene innumerables gotitas y entre ellas,


vesculas
y
vesiculadas
mitocondrias
eran
ocasionalmente
reconocidas (fig. 1). La zona de vesculas y membranas contiene
vesculas de diferente tamao, aisladas o asociadas y una plana y
membranosa cisterna. Las vesculas junto a la zona de lpidos
probablemente corresponden a los lisosomas ya que su localizacin
coincide con la actividad de la fosfatasa cida demostrada en los
embriones en conjunto y las membranas pueden corresponder a
suavizar el retculo endoplsmico. La zona homognea contiene
material fino granular uniformemente distribuido y sin orgnulos *
(Figs. 1,2)

La zona caracterizada por el material de las mitocondrias y fibrilar


tambin contiene la sustancia de Golgi, cuerpos multivesiculares y las
vesculas que son ms pequeas que las que se encuentran en la
zona de vesculas y membranas (Fig. 3). La zona de
cuerpos
cristaloides no se detecta cuando los embriones han sido
centrifugados a menos de 70.000 x g; a esta o fuerzas superiores
esta zona parece llena de material fibrilar y cuerpos cristaloides (fig.
4). El cortex de laclula es claro y muestra una malla fina carecente
de orgnulos. Parece ser afectado por centrifugacin y no cambia
apreciablemente de acuerdo a la fuerza centrfuga aplicada (figuras
4. 11)

En 25 embriones los cuales fueronextrados con detergente


inmediatamente despus de la centrifugacin y antes de la fijacin
para microscopa electrnica, la capa lipdica persiste pero parece
algo extrado y numerosas gotitas de lpido se agregan en unas pocas
gotas grandes (Fig. 8). Todas la citomembranas en sta y las otras
capas han desaparecido, quedando fragmentos de materia amorfa. El
material fibrilar se conserva (fig. 11) y componentes del
citoesqueleto se vuelven distintos con el tratamiento con detergente.
Particularmente evidente se muestran la corteza celular densa, la red
interna de microfilamentos de actina (7 nm) y los microtbulos (21
nm) observados en diversas ubicaciones, especialmente prxima al
ncleo (Figs. 10, II). Cerrar las relaciones espaciales se observaron
entre los microtbulos y las indentaciones en el polo centrpeto del
ncleo, y los microfilamentos se encuentran en todo el ncleo (Fig.
10).
El ncleo, ya sea visualizado en preparados de extraccin con
detergente o no, no se desubica por centrifugacin, de su insercin
en la zona de material mitocondrial y fibrilar y se muestra elongado
hacia polo centrifugo del blastmero. La parte centrpeta final del

ncleo nos muestra indentaciones profundas y el extremo centrfugo


contiene los nucleolos, fusionados en uno o dos (Fig. 6 ").
Restablecimiento de embriones estratificados: Observaciones al
microscopio ptico
Un nmero embriones (66) se fija 30 mm a 4 h despus de ser
centrifugada a 70.000 o 90.000 x g y se observaron al microscopio
ptico. Dentro de 30 a 40 minutos despus de centrifugacin, los
ncleos y nuclolos se encuentran de nuevo en el centro de la clula
y la estratificacin del citoplasma ya ha desaparecido, pero las tapas
de lpidos persistir en los polos centrpetos de ambos blastmeros
(Fig. 14).

En embriones en los que se permiti seguir con su desarrolo, la


segunda divisin por lo general divide a las tapas y conforme se da
escisin, las gotas de lpidos son redistribuidas entre los blastmeros.

La centrifugacin no impide el desarrollo a blastocistos normales


con cerca de 30 clulas (Fig. 15), aunque la blastulation es algo
retrasada. El porcentaje de blastulacin en embriones centrifugados
es de aproximadamente 20% menos que en los embriones no
centrifugada y tratados en condiciones similares: sin embargo, un
aumento en la fuerza centrfuga de 50.000 x g a 90.000 x g no
cambia el porcentaje de blastulacin significativamente (Tabla 1). El
porcentaje blastulacin sobre los controles en experimentos de
centrifugacin es aproximadamente 73%. (Tabla 1) que es
considerablemente ms bajo que el 91-92% observado en nuestros
cultivos estndares. sta diferencia puede atribuirse a bajas
temperaturas y a la alcalinizacin de los medios, cuando los
embriones estn fuera de la incubadora (ver Materiales y mtodos).

Efecto de los
inhibidores del citoesqueleto: observaciones al
microscopio ptico y electrnico
Las observaciones por microscopa de luz en 180 embriones que
fueron tanto centrifugados como cultivados en un medio que
contena una mezcla de colcemid (0,5 ug / ml) y citocalasina D (. 0.5
ug/ ml) revelan que los embriones tratados con esta mezcla de
mineral de drogas son frgiles: a 70.000 x g. 30% de ellos se
rompieron entre la capa hialina y granular, y en 90.000 x g. sto se
observa en el 60% de los embriones. Slo el 10% de los embriones no

tratados se rompieron a 130.000 x g. La estratificacin de los vulos


tratada y no tratada es bastante similar, pero los embriones tratados
a 30.000 xg muestran el efecto producido por 5,000 xg en los vulos
sin tratar.

Los vulos que se centrifugaron y cultivaron en medios que


contienan colcemid
o citocalasina
D se repusieron de la
estratificacin en mucho menos tiempo que vulos control, y su
desarrollo normal se detuvo. Se compar el efecto de estas medicinas
registrando el tiempo que pas despus de la centrifugacin hasta
que el nuclolo recobrara una posicin central en blastmeros, lo que
revela la recuperacin de la forma y la posicin de los ncleos. La
observacin de 144 vulos tratados con colcemid muestra que en el
93% de ellos el nuclolo recuper su posicin central 180 minutos
despus de la centrifugacin, mientras esta situacin se recupero
despus de 240 minutos en el 95% de 236 vulos tratados con
citocalasina D.

La morfologa de los 98 vulos centrifugados tratados con colcemid o


citocalasina D, que se extrajeron del detergente despus de la
centrifugacin, es diferente de la descrita anteriormente para los
vulos sin tratar. Bajo el microscopio ptico la diferencia destacable
es el contorno liso o el polo centrpeto nuclear en vulos tratados con
frmacos, en comparacin con las hendiduras observadas en los
vulos sin tratar.

Los vulos que fueron tratados con colcemid o en frio el ncleo


permanece en la capa granular, mientras que el tratamiento con
citocalasina D causa una separacin del ncleo dejando un espacio
entre el material fibrilar y la membrana nuclear colapsada. El
citoplasma de los vulos tratados con colcemid carece de perfiles de
micro tbulos y los vulos tratados con citocalasina D demuestran
una corteza discontinua y una red interior relajada (suelta floja) del
material fibrilar.

DISCUSION
Estratificacin de los componentes celulares
La estratificacin del citoplasma ha demostrado que al menos dos
tipos de (o estados) de los cuerpos vesiculares pueda ser reconocido
por su densidad: vesculas de luz que se encuentran debajo de la tapa
de lpidos, que incluyen elementos que muestran la actividad
fosfatasa cida y las vesculas pesados que se encuentran en la capa
granular mezclan con el material de las mitocondrias y fibrilar
nuestras observaciones sugieren que este material fibrilar, en virtud
de la fuerza de las pilas centrfugas hasta la formacin de cuerpos
cristaloides.
El alargamiento de los ncleos y la muesca en su fuerza centrpeta
postes pueden atribuirse a un discontinuo de la membrana nuclear en
el citoesqueleto. De hecho, el detergente de vulos extrados revelan
los microtbulos y microfilamentos asociado a la hendiduras
nucleares y estas desaparecen de vulos que han sido tratados con
coloemid o denominado citocalasina o fro
En el no se ha estudiado los otros componentes del citoesqueleto que
han sido identificadas en embriones de preimplantacin, alfa-actinina,
citoqueratina, miosina, fodrin y spectrin.

RECUPERACIN DE LA ESTRATIFICACION
El restablecimiento pasivo segn las densidades relativas
probablemente requeriran un mayor tiempo que el tiempo de
restablecimiento que hablamos y adems esto no explicara porque
las gotas de lpidos se mantienen juntas en dos polos centrpetos, sin
embargo no es posible descartar el rol de una matriz viscosa no
estructurada con comportamiento elstico. En el restablecimiento de
los embriones luego de la centrifugacin. El rol del citoesqueleto esta
influenciado por el retraso observado en el restablecimiento cuando
se usan inhibidores especialmente con cytocalasina d. a pesar que
stos inhibidores a las concentraciones usadas evitan la divisin celular
y el desarrollo normal, el citoesqueleto no se altera y el
restablecimiento puede ser atribuida a una estructura resiliente el

cual esta conectdao a diversas citomenbranas y de este modo los


mantiene o restaura su orden espacial.

EL DESARROLLO DESPUES DE LA RECUPERACION


En todos los experimentos de centrifugacin, la segmentacin y el
desarrollo del blastocisto parcialmente es disparejo probablemente
porque el embrin es cultivado por 1-2ras fuera de la incubadora. Sin
embargo ya que no se observaron alteraciones bajo microscopia obtic
durante la segmentacin, compactacin y formacin del blastocisto
de los embriones centrifugados, al parecer la centrifugacin no causa
alteracin en la organizacin fundamental de la celula asumiendo que
despus del desarrollo sea completamente normal y al menos dos
interpretaciones generales de los resultados son posibles. Primero la
existencia de una estructura preestablecida que o resiste la
cetrifugacion o que fcilmente se recupera esta, lo cual desplaza los
componentes celulares involucrados en la morfognesis a su celular
apropiado. Segundo la usencia en esta etapa de cualquier estructura
morfogenetica espacial. Nuestros resultados sustentaran la segunda
interpretacin, lo cual sin embargo no podemos afirmar debido que el
restablecimeinto desde la estratificacin puede ser un proceso pasivo
o incluso activos el cual no se relaciona con la morfogenista del
blastocisto, adems porque las anormalidades propias de desarrollo
que pueden aparecer luego no han sido descartados.