Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Resumen
Las inmunoglobulinas son herramientas muy utilizadas en la deteccin de molculas de inters
en diferentes tipos de ensayos. Debido a lo dispendioso de algunos modelos utilizados para
la obtencin de este tipo de protenas, las IgY de aves como gallina son una interesante
alternativa gracias al fcil manejo, mantenimiento, gran produccin de anticuerpos y el no
maltrato o sacrificio del animal del cual se obtienen. Estudios han demostrado que las IgY
pueden presentar ttulos muy altos con gran especificidad frente al antgeno de inters.
Varios protocolos se han propuesto para extraer las IgY del huevo, donde el principal
inconveniente son los lpidos de la yema. Dentro de estos mtodos la cromatografa tioflica
ha demostrado ser el mejor para purificar y delipidar estos anticuerpos.
Palabras clave: IgY, inmunoglobulina, inmunoensayoss, purificacin, produccin.
Abstract
Immunoglobulins are useful important tools for laboratory research in the detection of a
variety of target molecules. Due to problems in manipulating some model animals used in
antibody production, IgYs from poultry become a real interesting alternative for research due
to easy handling, maintenance, high immunoglobulin production and a humane treatment
without harm of experimental animal used. Some studies have demonstrated that IgY could
be present at high titer with high antigen specificity. Different methods have been proposed
to extract immunoglobulins from egg yolk by removing lipids. Among the extraction methods,
the thiophilic chromatography has proved to be superior to purify and remove the lipids.
Key words: IgY, immunoglobulin, immunoassays, purification, production.
20
INTRODUCCIN
Al igual que los mamferos, las gallinas producen
anticuerpos en respuesta a un antgeno, los cuales
son transferidos a su descendencia (Patterson et al.,
1962). Se ha encontrado que los anticuerpos con
mayor proporcin en el plasma sanguneo, las IgY,
son transferidos a la yema del huevo a travs del epitelio folicular del ovario durante la oognesis y se van
acumulando, proceso similar a la transferencia de
los anticuerpos a travs de la placenta en mamferos
(Rose & Orlans, 1981). Existen tres grandes isotipos
de anticuerpos en gallinas: una molcula de alto peso
molecular tipo IgM, dos subclases (7-8) del tipo IgG
que constituyen la mayor cantidad de inmunoglobulinas en el plasma y una del tipo IgA que se encuentra
en las secreciones externas como la vescula biliar y el
oviducto (Lebacq-Verheyden, Vaerman, Heremans,
1972). El trmino IgY es comnmente usado para
denotar el tipo de inmunoglobulina G7 de las aves.
Esta nomenclatura fue propuesta por Leslie & Clem
(1969) para reflejar algunas caractersticas particulares que hacen diferentes las IgG de mamferos y
las IgY de aves, en especial su peso molecular. La
cadena pesada de las IgY tiene un peso molecular de
aproximadamente 67 kDa, valor que se encuentra
por debajo del peso de la cadena de las IgM (70
kDa) o la cadena de las IgE (80 kDa). Es muy grande
para homologarla con la cadena de las IgG (50 kDa)
o la de las IgA (60 kDa). Como no se ha encontrado
evidencia sobre la presencia de IgM o IgA en la yema,
las IgY son el anticuerpo presente en mayor proporcin (Rose, Orlans, Buttres, 1974). Las IgA se pre-
Gallina
Numero de animales
Toma de muestra
6DQJUDGRP/VHPDQD
&ROHFFLyQGLDULDKXHYRV
P/GHVDQJUH
KXHYRV P/
\HPDD
Anticuerpos totales
PJ
PJE
PJ
PJ
,J0,J$,J(
1LQJXQR
Anticuerpos especficos
F
21
+LQJH
,J*
&1
9+
&2
&3
3RWHQWLDOVZLWFKUHJLRQV
&/
9/
,J<)F
9+
&1
3RWHQWLDOVZLWFKUHJLRQV
&2
9/
,J<
9+
&1
&2
9/
&/
&3
& 4
&/
Figura 1. Estructura de una IgG representativa de mamferos y una IgY en su forma completa
y truncada (Tomado de Warr et al., 1995).
22
Las aves han sido un modelo til en investigacin bsica en inmunologa. De hecho, el trmino linfocitos
B se gener al conocerse que el sitio donde maduran
estas clulas es la Bursa de Fabricius, presente nicamente en las aves. Adems, el sistema inmune de los
mamferos y de las aves tiene muchas similitudes funcionales (Vainio & Imhof, 1995; Funk & Thompson,
1996). Las aves tienen un buen desarrollo del sistema
inmune tanto humoral como celular y normalmente
tienen grandes concentraciones de anticuerpos en el
suero y an ms en la yema del huevo (Farrely, Branton & Wanke, 1992; Schmidt et al., 1993).
Propiedades de las IgY
Las IgY de gallina tienen algunas caractersticas fisicoqumicas que las diferencian de las IgG de mamfero. No se unen a la protena A de Staphylococcus
aureus (Kronvall, Seal, Finstad & Williams, 1970),
no se unen a la protena G de Streptococcus spp.
ni tampoco a receptores Fc de mamferos (Larsson,
Balw, Lindahl & Forsberg, 1993). Slo se ha encontrado en Streptococcus suis el caso de un tipo de
protena capaz de reconocer IgG de distintos tipos de
animales, incluyendo las IgY de gallinas (Benkirane,
Gottschalk, Jacques & Dubreuil, 1998). En el caso
de IgY de pato se ha encontrado que son capaces
de unirse a la protena A de S. aureus y dbilmente
a la protena G de Streptococcus spp., por lo que
han sido empleadas columnas de Sepharosa-A CL4B para su purificacin (Higgins, Cromie, Liu, Magor
& Warr, 1995).
Tampoco interactan con factores reumatoideos
(RF). El factor reumatoideo es un auto-anticuerpo que
reacciona con la regin constante (Fc) de las inmunoglobulinas G, A o M de mamferos. La enfermedad
usualmente asociada en humanos al RF es la artritis
reumatoidea (RA), aunque este anticuerpo tambin
se encuentra presente en el plasma de pacientes con
diferentes tipos de enfermedades. Los ensayos ms
usados para detectar el RF son las pruebas de aglutinacin en el que el RF reacciona con dos (o ms en el
caso de RF anti-IgM) diferentes anticuerpos causando
aglutinacin. Este mismo tipo de reaccin puede ocurrir en ensayos de ELISA tipo sndwich, en el que el
anticuerpo de captura que reconoce el antgeno de
inters responde positivamente con el anticuerpo de
deteccin en ausencia del antgeno dando como resultado un falso positivo, debido a la interaccin que
ocurre entre anticuerpo de captura RF - anticuerpo
de deteccin al momento de aplicar la muestra de
suero en la que se encuentra el antgeno que se est
1.2) (Dvalos-Pantoja, Ortega-Vinuesa, Bastos-Gonzles & Hidalgo-lvarez, 2000, 2001). Los rangos
de pI para los fragmentos IgY(Fc) y Fc son 7.0-9.5 y
5.5-6.0 respectivamente (Cheung, Thomas & Rylatt,
2003). En otros trabajos se han encontrado rangos
de pI para las IgY de 6.0-8.5 (Cheung et al., 2003)
y 6.5-7.5 (Gee, Bate, Thomas & Rylatt, 2003). Los
anticuerpos de gallina son poco estables a pH bajos
(pH 2-3) por tiempos prolongados (ms de dos horas)
y su actividad puede verse afectada al ser liofilizados
(Li-Chan, 2000).
Zhang (2003) presenta un resumen general de las
propiedades de las inmunoglobulinas Y comparado
con la las inmunoglobulinas G de mamferos.
Aplicaciones de las IgY
Las IgY tienen aplicacin potencial en medicina preventiva (por ejemplo, contra infecciones gastrointestinales) lo cual puede incrementar su uso. Tambin
se han aplicado en estudios biolgicos, como suplemento alimenticio, etc. Tienen un gran campo en
la extraccin y purificacin de compuestos bioactivos o patgenos y en inmunoensayos, gracias a su
gran especificidad. Recientemente se han empleado
como una herramienta biolgica en terapias contra
el cncer y como una herramienta bioqumica para la
caracterizacin de protenas (Song, Yu, Bai, Hester
& Kim, 1985; Sunwoo et al., 2000) e inmunohisto-
23
qumica (Schmidt et al., 1993). Adems, se han producido IgY contra diferentes tipos de antgenos en
mltiples aplicaciones. (Narat, 2003), entre ellos en
antgeno Tn presente en clulas cancergenas (Vega,
Murcia & Prez, 2009).
Extraccin y purificacin de IgY
Diferentes mtodos se han aplicado para la extraccin de las IgY de la yema, ya que aproximadamente el 50% del material de la yema no es acuoso y
puede interferir en ensayos posteriores (Jensenius &
Koch 1997). Dentro de los mtodos utilizados se encuentran delipidacin con PEG 6000 (Polson & Von
Wechmar, 1980; Carrol & Stollar, 1983; Gassmann
et al., 1990; Jensenius & Koch, 1997), sulfato de
dextrano (Jensenius et al., 1981), dilucin con agua
(Akita & Nakai, 1992, 1993; Almeida et al., 2003),
solventes orgnicos como cloroformo (Ntakarutimana, Demedts, Van Sande & Scharp, 1992; Shin,
Choi, Kim, Hur & Yoo, 2002), 2-propanol y acetona (Bade & Stegemann, 1984), alginato de sodio
(Hatta, Sim & Nakai, 1988) y el mtodo - carrageenan (Hatta, Kim & Yamamoto, 1990; Shin, Roe &
Kim, 2004) con cantidades de protena que varan
ampliamente (Tabla 2) debido a las diferentes metodologas empleadas tanto para la extraccin, purificacin y cuantificacin de protena (Sunwoo, Lee,
Menninen, Suresh & Sim 2002).
Tabla 2. Comparacin entre diferentes mtodos de extraccin de IgY presentando sus respectivos rendimientos.
Autor
1WDNDUXWLPDQDHWDO
Fraccin
Cantidad
protena
(mg x yema)
([WUDFWRFUXGR
,J<HVSHFtILFRV
Mtodo
&ORURIRUPR
*DVVPDQQHWDO
([WUDFWRFUXGR
3(*
-HQVHQLXVHWDO
([WUDFWRFUXGR
D
6XOIDWRGHGH[WUDQR
&DUURO 6WROODU
([WUDFWRFUXGR
3(*
$OPHLGDHWDO
([WUDFWRFUXGR
'LOXFLyQDJXDS+
6KLQHWDO
([WUDFWRFUXGR
FDUUDJHHQDQ
,J<7RWDO
,J<WRWDO
,J<HVSHFtILFR
([WUDFWRFUXGR
6XQZRRHWDO
+DWWDHWDO
'LOXFLyQDJXDS+
$OJLQDWRVRGLR
24
Adems de los mtodos cromatogrficos clsicos utilizados para la fragmentacin de extractos proteicos,
se ha evaluado un nuevo tipo de interaccin descubierto por Porath, Malsano y Belew (1985) conocido
como cromatografa de interaccin tioflica (TIC) en
el que se activan soportes con DVS (divinilsulfona).
Estos tipos de ligandos basados en la activacin del
soporte con DVS pueden variar ampliamente, pero
aquellos que contienen grupos con azufre parecen
presentar mayor especificidad por la retencin de
anticuerpos. Se ha encontrado igualmente que la retencin de anticuerpos por cromatografa tioflica es
aplicable en la purificacin de anticuerpos de diferentes especies como ratn, rata, cabra, bovinos y gallinas. Solo se encuentran diferencias en la afinidad de
las distintas clases de anticuerpos, como en el caso
del humano en que las IgG e IgA tienen una buena adsorcin mientras las IgM se retienen en menor
proporcin (Schwarz, Hohen & Wilcheck, 1995). Se
ha propuesto que el mecanismo de retencin de los
anticuerpos a este soporte se debe a un complejo
donor-aceptor de electrones entre regiones ricas y
deficientes de electrones en zonas hidrofbicas hacia el interior de la protena y el grupo tioter como
donor y el grupo sulfona como aceptor del ligando,
donde al parecer el ligando no cumple un papel tan
importante como el grupo sulfona de la DVS (Belew, Juntti, Larsson & Porath, 1987; Scoble & Scopes, 1997). Barroso, Murcia, Vega & Prez, (2005)
compararon algunos mtodos de purificacin donde
encontraron que la cromatografa tioflica era muy
efectiva respecto a otros mtodos.
REFERENCIAS
Almeida, C. M. C., Quintana-Flores, V. M., MedinaAcosta, E., Schriefer, A., Barral-Neto, M. &
Das da Silva, W. (2003). Egg yolk anti-BfpA
antibodies as a tool for recognizing and identifying enteropathogenic Escherichia coli. Scandinavian Journal of Immunology 57, 573-582.
25
Funk, P. E. & Thompson, C. (1996). Current concepts in chicken B cell development. Current
Topics in Microbiology and Immunology 212,
17-28.
Gassmann, M., Thmmes, P., Weiser, T. & Hbscher, U. (1990). Efficient production of chicken
egg yolk antibodies against a conserved mammalian protein. FASEB Journal 4, 2528-2532.
Larsson, A. & Sjquist, J.(1988). Chicken antibodies, a tool to avoid false positive results by
rheumatoid factor in latex fixation test. Journal
of Immunological Methods 108, 205-208.
Leslie, G. A. & Clem, L. W. (1972). Phylogeny of immunoglobulin structure and function. VI. 17s,
7.5s and 5.7s anti-DNP of the turtle Pseudamys
scripta. Journal of Immunology 108: 16561664.
26
Scoble, J. A. & Scopes, R. K. (1997). Ligand structure of the divinylsulfone-based T-gel. Journal
of Chromatogr. A. 787, 47-54.
Shin, N. R., Choi, I. S., Kim, J. M., Hur, W. & Yoo,
H. S. (2002). Effective methods for the production of immunoglobulin Y using immunogens of
Bordetella bronchiseptica, Pasteurella multocida
and Actinobacillus pleuropneumoniae. Journal
of Veterinary Science 3, 47-57.
Shin J. H., Roe, I. H. & Kim, H. G. (2004). Production of anti-Helicobacter pylori urease-specific
immunoglobulin in egg yolk using an antigenic
epitope of H. pylori urease. Journal of Medical
Microbiology 53, 31-34.
Song, C., Yu, J., Bai, D. H., Hester, P. Y. & Kim,
K. (1985). Antibodies to the -subunit of insulin
receptor from eggs of immunized hens. Journal
of Immunology 135, 3354-3359.
Porath, J., Malsano, F. & Belew, M. (1985). Thiophilic adsorption. A new method for protein fractionation. FEBS letters 185, 306-310.