Universidad Andrs Bello

Facultad de Ciencias Biolgicas

Laboratorio de Biologa Molecular y Gentica
Profesores: Lorena Villarroel
Martin Galaz

TRABAJO PRCTICO N2:

Extraccin de DNA plasmidial y electroforesis en gel de
agarosa
BIO041

Autores:

Cynthia Astudillo
Yessica Godoy
Felipe Irarrzabal
Mauricio Toloza
Karen Yuri

Fecha: 13 de abril del 2015

Introduccin
Los plsmidos son molculas circulares de DNA que estn separados del DNA cromosmico de una
clula. Son de tamao variable y el tipo de genes que portan pueden conferirle a la clula ventajas
adaptativas, como genes de resistencia a antibiticos, genes de produccin de sustancias txicas
para otras bacterias o genes que codifican enzimas tiles para degradar sustancias qumicas. (1)
stos se encuentran naturalmente en bacterias y en clulas eucariontes.
Para purificar el DNA plasmidial a partir de bacterias, hay tres pasos: el crecimiento del cultivo
bacteriano, la recoleccin y lisis bacteriana, que corresponde a la recoleccin de bacterias por
centrifugacin a partir del cultivo bacteriano en donde stas son lisadas por detergentes inicos,
solventes orgnicos, alcalinos o calor. (2) Y por ltimo la purificacin del DNA plasmidial, en donde
ste se obtuvo gracias a los mtodos de lisis, pero estn contaminados con grandes cantidades de
RNA y DNA cromosomal, por lo que deben ser removidos. Ya obtenido el DNA plasmidial de buena
calidad, ste puede ser visualizado mediante electroforesis.
La electroforesis en gel de agarosa es una tcnica que separa fragmentos de DNA segn su tamao.
Consiste en someter los fragmentos de DNA inmersos en este gel a un campo elctrico. Como las
molculas de DNA tienen una carga negativa debido a los grupos fosfato que posee, stas son
atradas hacia el polo positivo. Las molculas ms pequeas migran ms rpido que las grandes.
Una vez hecha la electroforesis se tien las bandas con gel red y al iluminar con luz UV se ven
bandas de fluorescencia que corresponderan a las molculas de DNA.
En este prctico se hizo la extraccin de DNA plasmidial y luego se realiz una electroforesis en gel
de agarosa para as visualizar el plsmido extrado.

Objetivos
Generales: Tener la capacidad de comprender, analizar y realizar de manera eficiente un
experimento de extraccin de DNA plasmidial a partir de una transformacin bacteriana y ser
capaces de efectuar una electroforesis en gel de agarosa para as visualizar el plsmido extrado.
Especficos:
1. Tener la capacidad de poder realizar la separacin de DNA plasmidial.
2. Comprender el procedimiento y realizar una electroforesis en gel de agarosa de manera
eficiente.
3. Tener la capacidad de poder analizar los posibles resultados que se obtendrn del trabajo
prctico.

Materiales y Mtodos
Se comienza el prctico preparando 500mL de buffer diluido con 50mL de solucin buffer mezclado
con 450mL de agua destilada, a esta solucin se le extrajeron 150mL de Buffer para proceder a
mezclar con 1,5 gramos del gel agarosa. Luego a los 150mL de solucin buffer en gel agarosa se le
agrega 10L de gel Red, el cual se intercala en la hebra de ADN para dar fluorescencia roja,
mientras que el buffer tiene por finalidad que las sales hagan circular la corriente de los electrodos en
el proceso de electroforesis. Ya preparada esta solucin se introdujo por 5 minutos en el microondas
para que la solucin buffer y el gel agarosa se mezclen homogneamente, hasta hervir y que se
observe transparente sin grumos. Finalmente este gel se introduce en la cmara de electroforesis y
al mismo tiempo se introduce el peine antes que se solidifique el gel.
A nuestro cultivo lquido de caldo control de siembra LB/amp posteriormente incubado, se tapa
correctamente y se procede a revolver en un vrtex para que se re-suspenda, de esto se saca 1,5mL
o 500L del caldo de DNA (+) introducindolo con una micropipeta de 100-1000L con punta azul
con 3 intentos de 500L para mayor exactitud en un tubo Eppendorf nuevo, para luego centrifugar a
8000RPM durante 10 minutos formando un pellet en el fondo con las bacterias de estudio que se
desean conservar y retirando el sobrenadante con un giro rpido del tubo en el cementerio. Adems
se sacaron 500L de la solucin I (sirve para estabilizar la clula en un tampn) y 5L de RNAasa (la
RNAasa tiene por finalidad romper el ARN plasmidial porque al revelar en el gel se ven manchones
producto de este ARN) ambas bajo mechero, los cuales se mezclan e introducen en un tubo
Eppendorf donde tenemos el pellet obtenido. A un tubo con DNA (-) tambin se le agreg de esta
solucin I/RNAasa para tener un control negativo, debido a que este no tiene el plsmido, es decir
que al momento de observar sta no debera aparecer en la cmara de electroforesis. Luego se
transfieren ambas soluciones tanto (+) como (-) a un nuevo tubo de microcentrfuga de 2mL, para
agregar 500L de la solucin II, que es una solucin de NaOH (2M) que tiene por funcin provocar
lisis, esta va a romper la pared celular y ADN cromosomal, por el contrario el plsmido puede
resistirlo ya que es una hebra de ADN circular cerrada covalentemente. Luego estas se mezclan por
inversin de 4-6 veces para obtener un lisado claro (ya agregada la solucin II se debe tener en
cuenta que no se deben sobrepasar los 5 minutos con esta solucin alcalina ya que producira
ruptura tambin del plsmido). Habiendo mezclado cuidadosamente por inversin se procede a
agregar 700L de Buffer de lavado DNA o solucin III, la cual tiene como objetivo neutralizar la
solucin II dejando el pH neutro. Tambin se mezcla por inversin de 4-6 veces inmediatamente
despus de agregar la solucin III y adems se centrifuga a mxima velocidad a 13000RPM durante
10 minutos a temperatura ambiente (37C). Se procede a insertar la columna HiBind DNA mini a un
tubo de 2mL, agregndole 100L de buffer de equilibrio con el objetivo de provocar su activacin,

luego centrifugar a mxima velocidad por 30-60segundos descartando el filtrado. Se trasfiere 700L
del lisado tanto (+) como (-) a la columna HiBind DNA mini, sin transferir el resto de pellet, en donde
se vuelve a centrifugar a mxima velocidad por 60 segundos descartando nuevamente el filtrado. Se
vuelve a repetir todo este procedimiento hasta que todo el lisado sea transferido. Luego se agrega
500L de Buffer HB a ambas columnas (tubos) y se vuelve a centrifugar por 60 segundos
(descartando el filtrado).
Se procede a agregar 700L del Buffer de lavado DNA y centrifugar por 60 segundos, descartando el
filtrado. Tambin se centrifuga la columna vaca durante 2 minutos para retirar los restos de etanol,
traspasando las columnas HiBind DNA mini a nuevos tubos Eppendorf de microcentrifuga de 1,5mL.
Luego se agrega 80-100mL del Buffer de Elucin (agua desionizada estril de pH 8,5) directamente
en el centro de la columna, el cual se mantiene a temperatura ambiente (37C) durante 1 minuto,
luego se centrifuga a mxima velocidad por 60 segundos.
De ambos tubos de 100L se extrae 20L y a estos se le agrega 4L de la solucin cargadora (6X)
en donde hay un colorante bromo fenol que le otorgar la tonalidad azul al DNA (el bromo fenol al ser
una molcula pequea se adelanta a las protenas y cido nucleico indicando cuando detener la
electroforesis). Para finalizar el experimento se procedi a realizar la electroforesis en donde con una
micropipeta de 2-20 uL en el primer bolsillo se introdujo el DNA Ladder, terminado esto se cambia la
punta de la micropipeta por una nueva para agregar al segundo bolsillo el DNA (+) eliminando el
cementerio la punta nuevamente y finalmente en el tercer bolsillo se introdujo la micropipeta con una
punta nueva el DNA (-), finalizado esto se programa la cmara de electroforesis para que funcione
hasta los 45 minutos a 90C.

Resultados
*Experimento nmero 1: Transformacin Gentica Bacteriana
Clculo de la Tasa de Transformacin:
Frmula:
Tasa de transformacin = N total de clulas que crecen en placa / Cantidad ADN (ug) en placa.
1. El N total de colonias verde fluorescente que crecen en placa LB/amp/ara
2. N de plsmido pGL0 en clulas bacterianas presente en placa LB/amp/ara Segn:
A) Cantidad inicial de ADN al iniciar el experimento.
Formula:
-

ADN (ug) = [ADN (ug/uL)] x Volumen ADN (uL)

ADN (ug) = 0.2 (ug/uL) x 10 (uL)
ADN (ug) = 2 (ug)

Nota: La concentracin de ADN (ug/uL) se calcula:

-

[ADN (ug/uL)] = 50 (ug) ADN / 250 (uL)

[ADN (ug/uL)] = 0.2 (ug/uL)

B) Determinacin de la fraccin de ADN realmente transferido a la placa de LB/amp/ara.

Frmula:
-

Fraccin ADN utilizada = Volumen en placa (uL) / Volumen total tubo (uL)
Fraccin ADN utilizada = 100 (uL) / 510 (uL)
Fraccin ADN utilizada = 0.2

Entonces N de plsmido pGLO en clulas bacterianas presente en placa LB/amp/ara se calcula:

-

ADN pGLO transferido (ug) = cantidad total ADN pGLO usada (ug) x Fraccin de ADN pGLO
ADN pGLO (ug) = 2(ug) x 1.96 (ug)
ADN pGL0 (ug) = 3.92 (ug)

Finalmente hacemos el conteo para proceder con el clculo final de la tasa de transformacin:
-

Tasa de transformacin = 380 (colonias verdes) / 3.92 (ug)

Tasa de transformacin = 96.93 (colonias verdes/ ug)

Tras la incubacin de las placas a 37C y situarlas bajo luz UV se observ lo siguiente:
Placas de agar
1.- LB/amp/+DNA

2.- LB/amp/ara/+DNA

3.-LB/amp/-DNA

4.- LB/-DNA

Color
Blanco (Fenotipo
silvestre)

Nmero de colonias
No se aprecian colonias.

Verde fluorescente

No se logra distinguir la
cantidad de colonias que
hay en la placa. Slo se
ve un manchn de color
verde fluorescente.

No hay crecimiento de
colonias por lo tanto no
se observa algn color

No se aprecian colonias.

Blanco (Fenotipo
silvestre)

No se aprecian colonias,
solo se observa una
mancha de color blanco.

RESULTADOS DE EXTRACCION DE DNA PLASMIDIAL Y ELECTROFORESIS EN GEL DE

AGAROSA.
Se observa en la electroforesis en gel de agarosa lo siguiente:
DNA Ladder (escalera):
Se observa la escalera con bandas de referencia (no muy bien demarcadas) que van desde 1kpb a
15kpb.
DNA (+):
Se observa una banda cercana a la banda de referencia de 5kb.
DNA (-):
Se logra apreciar igual a la banda del DNA (+).

Ejercicio
Un bilogo se propone clonar el gen Lys A que est involucrado en la biosntesis del aminocido
lisina en Escherichia coli. Se dispone de un vector cuyo mapa gentico se representa en la siguiente
figura y corresponde al pBR 322 que posee los genes de resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina.

El pBR 322 se abre por accin de Bam HI. Adems, se dispone de DNA proveniente de una cepa
silvestre de Escherichia coli tratado con Bam HI. Estos DNA se mezclan en presencia de la enzima
ligasa. Los plsmidos recombinados producidos por ligacin se usan para transformar cepas de
bacterias auxtrofas para lisina [lys A-]. Las bacterias transformadas se colocan en siete medios de
seleccin y, despus de la incubacin, se registra la presencia o la ausencia de colonias. Los
resultados se muestran en la siguiente tabla:

1) Enuncie dos hiptesis que expliquen el crecimiento de bacterias en el medio 1.

R: La primera hiptesis podra ser que hay crecimiento de colonias en el medio 1 porque est
ausente tanto la tetraciclina como la ampicilina, stas seran las que evitaran el crecimiento debido a
que el pBR 322 posee genes de resistencia a stos.

La segunda hiptesis es que al no estar presente la lisina, no podra afectarle ya que al ser una
bacteria extrofa, sta puede producirla y por lo tanto no afecta en su crecimiento.

2) Cul es el tipo de plsmido presente en las bacterias seleccionadas en el medio 2?

R: Es un plsmido de resistencia, debido a que contiene genes de resistencia a antibiticos como la
tetraciclina y la ampicilina.
3) Qu propiedades debe tener el medio que permite la seleccin de bacterias que poseen un
plsmido que lleva el gen Lys A silvestre? Por qu?
R: El medio que permitira la seleccin de bacterias que poseen el plsmido deseado debera
carecer de los antibiticos y de lisina. Ya que si los antibiticos estn presentes es muy probable que
no crezcan las colonias, adems al no estar la lisina impedira que las bacterias auxtrofas crezcan
en el medio. Por lo tanto de esa manera las que llevan el gen Lys A podran sobrevivir.
4) Solamente uno de los siete medios de cultivo utilizados permite seleccionar sin
ambigedad las bacterias que poseen el plsmido deseado. Cul es?
R: El medio 4 permite seleccionar sin ambigedad, debido a que estando solo ste presente en el
medio no hay crecimiento de colonias, no como cuando hay slo ampicilina en donde de todas
formas hay un crecimiento. Por esa razn la tetraciclina es la que permite la seleccin de las
bacterias que contienen el plsmido deseado. Adems posee la lisina, que al estar en el medio
permite tambin el crecimiento.

5) Qu se puede concluir en cuanto al lugar donde se localiza el sitio Bam HI en el DNA

vector?
R: Se puede concluir que la diana BamHI est dentro del gen de resistencia a la tetraciclina.

Discusin

Los resultados obtenidos en el experimento N 1 sobre la transformacin a luz normal y bajo luz
ultravioleta no estuvieron tan lejanos de lo esperado. A continuacin un anlisis de cada placa.
1. Placa LB/amp/DNA+: Crecimiento bacteriano de color blanco (Fenotipo silvestre) con o sin luz
ultravioleta debido a que no expresa el gen GFP, ya que no est presente el azcar
arabinosa, el cual regula la expresin de dicho gen. (3)
No se aprecian colonias, solo se observa una mancha de color blanco debido a que no se
realiz bien la siembra homognea en la superficie del agar.
2. LB/amp/ara/DNA+: Crecimiento de color verde fluorescente por la expresin del gen GFP
debido a que est presente la azcar arabinosa que regula la expresin en dicho gen.(3)
No se aprecian colonias, solo se observa una mancha de color verde fluorescente debido a
que no se realiz adecuadamente la siembra homognea en la superficie de agar.
3. LB/amp/DNA- : No hay crecimiento bacteriano debido a que estas bacterias no fueron
transformadas con el plsmido pGL0, por ende no poseen el gen de resistencia amp. (3)
4. LB/DNA- : Esta cepa al no ser transformada con el plsmido pGLO no expresa el gen GFP,
pero si presenta crecimiento bacteriano de color blanco (Fenotipo silvestre) debido a que en el
medio de cultivo no est presente la ampicilina.(3)

Por otra parte los resultados de la Extraccin de DNA plasmidial y electroforesis en gel agarosa
en el experimento N 2 no cumplieron nuestros objetivos a cabalidad. Esto porque:
1. En el DNA Ladder las bandas no se ven bien demarcadas debido a que no se utiliz la
concentracin de DNA adecuada, en este caso se ocup ms de lo necesario.
2. En la corrida de DNA+ se logr el objetivo ya que se observa solo una banda cercana a la de
referencia de 5kb de DNA Ladder, una cantidad de pb muy cercano al indicado en la gua de
laboratorio para el plsmido PGL0. Esto nos demuestra que el plsmido fue extrado y
purificado correctamente. (2)

3. Finalmente en la corrida DNA- se observa una banda menos definida que en la corrida de
DNA+. Esto que no debiese haber ocurrido se explica por una contaminacin de la muestra
DNA- a causa de un mal uso de la micropipeta (No cambiar las puntas cuando corresponde).

Conclusin

En el presente trabajo se logr aprender y comprender el proceso de separacin de DNA plasmdico

y purificarlo para su posterior utilizacin en la digestin de ste mediante el uso de enzimas de
restriccin (ARNasa), las cuales nos permiten recombinar molculas de DNA, pero no son capaces
de cortar ste simplemente en cualquier ubicacin, cada enzima tiene una secuencia de DNA
especfica a la que se une y lo corta. Se logr comprender el principio de la electroforesis que se
basa en la separacin mediante cargas y por tamao de las hebras de DNA en donde ste con carga
negativa tiene que correr hacia el polo positivo y la utilizacin de un marcador de peso molecular que
nos permite comparar los diferentes puntos de corte. Se procedi al revelado en donde se tien las
bandas de DNA con algn agente fluorescente en presencia de luz ultravioleta dando como resultado
una escalera que son los fragmentos de ADN plasmdico. En el prctico se tuvo que mantener un
manejo metdico de los instrumentos, adems de seguir adecuadamente los procedimientos que
requeran medios estriles y la preocupacin de los estudiantes de seguir las medidas estndar
correspondientes para disminuir los errores y as poder obtener los resultados esperados.

Bibliografa
(1) http://medmol.es/glosario/87/
(2) Universidad Andrs Bello. Gua de laboratorio N3: Extraccin de DNA plasmidial y
electroforesis en gel de agarosa, curso BIO041 Biologa Molecular y Gentica general, 2015.
(3) Universidad Andrs Bello. Gua de laboratorio N2: Transformacin Gentica Bacteriana,
curso BIO041 Laboratorio de Biologa Molecular y Gentica General, 2015.