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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

ANTECEDENTES
La cromatografa (chromo= color y graphie=escritura, escribir en
colores) fue inventada el 1903 por el botnico ruso Mikhail Tswett.
Ismailov y Scraiber utilizaron lminas de vidrio para colocar capas muy
delgadas de almina y luego aplicaron extractos vegetales, dando as la
primera forma de cromatografa de capa fina. Egon Stahl (1956) di el
nombre de cromatografa de capa fina, estandariz los procedimientos,
equipos y adsorbentes dando un auge a esta tcnica simple,
econmica y eficiente.
FUNDAMENTO
La cromatografa en capa fina (en ingls thin layer chromatography o
TLC) es una tcnica analtica rpida y sencilla que permite:
Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar
as, por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificacin.
Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podran ser
idnticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma
sustancia.
Realizar el seguimiento de una reaccin. Es posible estudiar cmo
desaparecen los reactivos y cmo aparecen los productos finales o, lo
que es lo mismo, saber cundo la reaccin ha acabado.
El fundamento de la separacin implica que los aminocidos cuya
cadena lateral (R) tenga un carcter ms apolar, tendrn tendencia a
desplazarse con la fase mvil, mientras que los aminocidos que sean
polares, ya sean con carga o sin carga, sern retenidos por la fase
estacionaria. Ello es as, porque la fase mvil est formada por solventes
que son ms apolares que el agua, que es el solvente de la fase
estacionaria.
Una mezcla compleja que no se separa por completo en un solo
cromatograma, usa la cromatografa bidimensional.
Basada en el principio anterior, con la diferencia en la tcnica,
la muestra se aplica en una esquina y el cromatograma se corre en
forma paralela a uno de los bordes del papel, al terminar el
primer cromatograma la hoja se rota 90 y se realiza una cromatografa
paralela al segundo borde utilizando otro sistema de solventes. Dado
que cada compuesto migra a una velocidad caracterstica en un sistema
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de solventes
determinado,
la
segunda
cromatografa
debera
incrementar en grado sustancial la separacin de la mezcla de
componentes.
Los dos adsorbentes (fase
estacionaria) ms ampliamente
utilizados son la gel de slice
(SiO2) y la almina (Al2O3),
ambas de carcter polar. La
almina anhidra es el ms
activo de los dos, es decir, es el
que retiene con ms fuerza a los
compuestos; por ello se utiliza
para
separar
compuestos
relativamente
apolares
(hidrocarburos,
haluros
de
alquilo, teres, aldehdos y cetonas). El gel de slice, por el contrario, se
utiliza para separar sustancias ms polares (alcoholes, aminas, cidos
carboxlicos). El proceso de adsorcin se debe a interacciones
intermoleculares de tipo dipolodipolo o enlaces de hidrgeno entre el
soluto y el adsorbente. El adsorbente debe ser inerte con las sustancias
a analizar y no actuar como catalizador en reacciones de
descomposicin. El adsorbente interacciona con las sustancias mediante
interaccin dipolodipolo o mediante enlace de hidrgeno si lo
presentan.
Tras la eliminacin del disolvente, se determina la posicin de los
componentes con un reactivo de revelado (ninhidrina), y se determina la
posicin de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente,
calculndose el correspondiente valor de Rf. La identificacin de tales
compuestos se suele realizar comparando sus Rf con los de compuestos
de referencia (patrones) de naturaleza qumica conocida.
Rf = Frente o distancia del soluto
Frente o distancia del disolvente

OBJETIVO
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Separar los aminocidos presentes en el jugo del jitomate por


cromatografa bidimensional en capa fina.
Identificar los aminocidos separados por comparacin de sus
valores de Rf con los de soluciones tipo de aminocidos.
Comparar el grado de resolucin de la cromatografa
bidimensional, con el de la unidimensional.

RESULTADOS:
En cada placa cromatografa se observan manchas de diferentes
tamaos correspondientes a cada uno de los aminocidos y a diferentes
distancias. De acuerdo a la relacin de migracin para las sustancias
aqu utilizadas se obtuvieron los siguientes valores de Rf para cada una
de ellas.

Figura 1: Cromatograma 1 Unidimensional. Fase mvil: cloroformo-metanol-amoniaco, de


izquierda a derecha. Aminocidos: Arginina, Lisina, Glutamina, Histidina, Glicina, Prolina,
Metionina, Fenilalanina, Triptofano, Tirosina.

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Figura 2: Cromatograma 2 Unidimensional. Fase mvil: Butanol-cido actico-agua, de izquierda


a derecha. Aminocidos: Arginina, Lisina, Glutamina, Histidina, Glicina, Prolina, Metionina,
Fenilalanina, Triptfano, Tirosina.

II Fase
Mvil

I Fase

Figura 3: Cromatograma 3 Bidimensional de aminocidos tipo. Fase mvil I: cloroformo-metanolamoniaco. Fase mvil II: butanol-cido actico-agua.

II Fase
Mvil

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I Fase

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Figura 4: Cromatograma 4 Bidimensional del jugo de jitomate. Fase mvil I: cloroformo-metanolamoniaco. Fase mvil II: butanol-cido actico-agua.

Tabla 1. Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en


las 2 fases mviles.
1.
Fase
Cromatograma 1

Mvil

Aminocido

2 Fase Mvil Cromatograma


2

Frent
e del
solut
o

Frente del
disolvente

Rf

Frente
del
soluto

Frente
del
disolvent
e

Rf

Arginina
(Arg)

1.5

7.8

0.1923

1.4

7.9

0.1772

Lisina (Lys)

2.4

7.8

0.3076

1.2

7.9

0.1518

Glutamina
(Glu)

2.8

7.8

0.3846

3.3

7.9

0.4177

Glicina (Gly)

3.8

7.8

0.4871

2.6

7.9

0.3291

Prolina (Pro)

4.3

7.8

0.5512

2.7

7.9

0.3417

Triptfano
(Thr)

4.5

7.8

0.5769

3.2

7.9

0.4050

Histidina
(His)

4.8

7.8

0.6153

1.5

7.9

0.1898

Tirosina (Tyr)

5.1

7.8

0.6538

4.7

7.9

0.5949

Metionina
(Met)

6.4

7.8

0.8205

4.8

7.9

0.6075

Fenilalanina
(Phe)

6.8

7.8

0.8717

5.3

7.9

0.6708

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Tabla 2. Cromatograma bidimensional tipo desarrollado en las 2


fases mviles.

Aminocido

1.
Fase
Cromatograma 3

Mvil

2
Fase
Cromatograma 3

Mvil

Frent
e del
solut
o

Frente del
disolvente

Rf

Frente
del
soluto

Frente
del
disolvent
e

Rf

Lisina Lys

1.2

7.9

0.1518

1.0

7.8

0.1282

Arginina Arg

1.4

7.9

0.1772

1.3

7.8

0.1666

Histidina His

1.5

7.9

0.1898

1.6

7.8

0.2051

Glicina Gly

2.6

7.9

0.3291

2.0

7.8

0.2564

Prolina Pro

2.7

7.9

0.3417

2.5

7.8

0.3205

Triptfano
Thr.

3.2

7.9

0.4050

2.8

7.8

0.3589

Gutamina Glu

3.3

7.9

0.4177

3.1

7.8

0.3974

Tirosina Tyr.

4.7

7.9

0.5949

4.7

7.8

0.6025

Metionina
Met

4.8

7.9

0.6075

4.8

7.8

0.6153

Fenilalanina
Phe.

5.3

7.9

0.6708

5.4

7.8

0.6923

Tabla 3. Cromatograma bidimensional problema desarrollado en


las 2 fases mviles.

Aminocido

1.
Fase
Cromatograma 4
Frent
e del
solut

Frente del
disolvente

Mvil

Rf

2
Fase
Cromatograma 4
Frente
del

Frente
del
disolvent

Mvil

Rf

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o
Lisina Lys
Arginina Arg
Histidina His
Glicina Gly
Triptfano
Thr
Glutamina
Glu
Torosina Tyr.
Metionina
Met.
Fenilalanina
Phe

soluto

1.0
1.3
1.6
2.0
2.5

7.8
7.8
7.8
7.8
7.8

0.1282
0.1666
0.2050
0.2564
0.3589

1.0
1.2
2.2
2.5
2.7

7.9
7.9
7.9
7.9
7.9

0.1265
0.1518
0.2784
0.3164
0.3417

2.8

7.8

0.3974

2.9

7.9

0.3670

3.1
4.7

7.8
7.8

0.6025
0.6153

3.1
3.8

7.9
7.9

0.3924
0.4810

4.8

7.8

0.6923

5.3

7.9

0.6708

Tabla
4.
Cromatograma
bidimensionales
desarrollado en las 2 fases mviles.

Rf creciente en la 1
fase mvil
0.1282
0.1666
0.2564
0.3589
0.3974
0.6923

Rf en la 2 Fase
mvil
0.1265
0.1518
0.2784
0.3670
0.3924
0.6708

problema

(IV)

Aminocido
correspondiente
Lisina Lys
Arginina Arg
Glicina Gly
Triptfano Thr
Glutamina Glu
Fenilalanina Phe

DISCUSIN:
La cromatografa en capa fina como mtodo cualitativo y cuantitativo,
siempre requiere contar con un estndar de referencia; en este caso se
tuvieron 10 Aminocidos tipo (Arginina, Lisina, Glutamina, Glicina,
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Prolina, Triptfano, Histidina, Tirosina, Metionina, Fenilalanina) para


comparar su valor de factor de retardo (Rf) y el color de la mancha del
estndar
al
ser
revelada
con
agentes
qumicos,
con
los datos experimentales obtenidos.
La mayora de los aminocidos pudo identificarse en cada una de las
placas desarrolladas gracias al revelado que se hizo con una solucin de
ninhidrina; ya que esta reacciona debido a la presencia del grupo NH2,
permitiendo el reconocimiento de los mismos por la coloracin
denominada prpura de Ruhemann. Sin embargo, la prolina no tiene
dicho grupo libre, sino NH- (que no produce amonio libre al reaccionar
con ninhidrina) por lo que genera una mancha de color amarillo obscuro
la cual se observo plenamente en la placa II y III.
Al realizar los clculos de Rf para determinar en especfico cada uno de
los aminocidos encontrados en nuestra solucin problema, ninguno de
ellos present el mismo, ya que la tendencia de estos para asociarse con
mayor fuerza a una u otra fase mvil (I: Cloroformo-metanol-amoniaco
17% (2:2:1), II: butanol-cido actico-agua (3:1:1)), no es la misma por
su naturaleza qumica; pero ello constituye una ventaja, puesto que as
es posible caracterizar a un compuesto ms especficamente registrando
sus Rf en varios disolventes..
Nuestros valores pueden considerarse satisfactorios; ya que de 10
aminocidos tipo se identificaron 6 en el jugo de jitomate a partir de la
comparacin de la tabla 2 y 3. De los que no fue posible hacerlo se debe
a las caractersticas tan similares que tienen los aminocidos unos con
otros, pues se aglutinaron en un slo espacio. Incluso algunos factores
que pudieron haber afectado al Rf son: el grado de pureza del
adsorbente, la concentracin del ambiente de la cmara y la
temperatura; puesto que la fase mvil recorri en un tiempo muy corto
al esperado cada uno de los cromatogramas.
Comparando la cromatografa unidimensional y bidimensional se
destaca que la segunda fue ms eficiente debido a que, la muestra se
encuentran expuesta a 2 fases mviles, lo que quiere decir que tendr 2
separaciones de acuerdo a las propiedades de cada fase, dando como
resultado el incremento en el grado de separacin de cada uno de los
aminocidos presentes en nuestra solucin problema.
CONCLUSIN:
Se logr separar cada uno de los aminocidos presentes en el jugo del
jitomate por cromatografa bidimensional y debido a que cada uno de
ellos presentes en la muestra tiene un Rf caracterstico; se logro la
identificacin de: Lisina, Arginina, Glicina, Triptfano, Glutamina y
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Fenilalanina.
PREGUNTAS EXTRAS:
1.- Investigar en la literatura los aminocidos que contiene el jugo
empleado como problema. Compare con sus resultados y concluya.
Nutriente
cido asprtico
cido glutmico
Alanina
Arginina
Cistina
Fenilalanina
Glicina
Hidroxiprolina
**Histidina
Isoleucina

Cantidad
113 mg.
314 mg.
24 mg.
17 mg.
0,93 mg.
22 mg.
17 mg.
0 mg.
12 mg.
21 g.

Nutriente
Leucina
Lisina
**Metionina
**Prolina
Serina
**Tirosina
Treonina
Triptfano
Valina

Cantidad
28 mg.
27 mg.
7 mg.
15 mg.
26 mg.
11 mg.
21 mg.
6 mg.
21 mg.

Observando la tabla, se verifica que las concentraciones de los


aminocidos no encontrados en el jitomate son muy bajas **por lo cual
no se logr su identificacin en la cromatografa unidimensional en la
prctica.
** Aminocidos no identificados en la solucin problema.
2.- Escriba la reaccin completa y con nombres, de la ninhidrina con un
aminocido.

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3.- Es posible cambiar el orden de las fases mviles?


Si es posible cambiar el orden, siempre y cuando realicemos
la
eliminacin de la primera fase mvil con aire caliente para no causar
problemas a la segunda; ya que la separacin de los aminocidos de
jugo se da en cuanto a las polaridades de cada uno.
4.- Indique las posibles fuentes de error en esta tcnica.
-No usar guantes de ltex para la preparacin de las placas
cromatograficas.
-La temperatura de las cmaras.
-El haber raspado la slica de las placas cromatograficas.
-No dispersar bien la ninhidrina en la placa resultando que no se revelen
algunas separaciones.
-Contaminacin de los reactivos.
-Marcar las placas con pluma o plumn.
- Colocar mal los cromatogramas en la cmara.

BIBLIOGRAFA:

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Skoog, Douglas A., Crouch, F. James Haller., Principios de Anlisis


Instrumental. Sexta Edicin. Cengage Learning. Mxico, 2008. pg 851
http://depa.fquim.unam.mx/proteinas/estructura/EPamm2.html
http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htm
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf
http://www.cromlab.es/reac_der_aa_ninhydrin.htm
http://www.quimicaorganica.org/foro/1-introduccion-a-la-quimicaorganica

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