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ANTECEDENTES
La cromatografa (chromo= color y graphie=escritura, escribir en
colores) fue inventada el 1903 por el botnico ruso Mikhail Tswett.
Ismailov y Scraiber utilizaron lminas de vidrio para colocar capas muy
delgadas de almina y luego aplicaron extractos vegetales, dando as la
primera forma de cromatografa de capa fina. Egon Stahl (1956) di el
nombre de cromatografa de capa fina, estandariz los procedimientos,
equipos y adsorbentes dando un auge a esta tcnica simple,
econmica y eficiente.
FUNDAMENTO
La cromatografa en capa fina (en ingls thin layer chromatography o
TLC) es una tcnica analtica rpida y sencilla que permite:
Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar
as, por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificacin.
Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podran ser
idnticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma
sustancia.
Realizar el seguimiento de una reaccin. Es posible estudiar cmo
desaparecen los reactivos y cmo aparecen los productos finales o, lo
que es lo mismo, saber cundo la reaccin ha acabado.
El fundamento de la separacin implica que los aminocidos cuya
cadena lateral (R) tenga un carcter ms apolar, tendrn tendencia a
desplazarse con la fase mvil, mientras que los aminocidos que sean
polares, ya sean con carga o sin carga, sern retenidos por la fase
estacionaria. Ello es as, porque la fase mvil est formada por solventes
que son ms apolares que el agua, que es el solvente de la fase
estacionaria.
Una mezcla compleja que no se separa por completo en un solo
cromatograma, usa la cromatografa bidimensional.
Basada en el principio anterior, con la diferencia en la tcnica,
la muestra se aplica en una esquina y el cromatograma se corre en
forma paralela a uno de los bordes del papel, al terminar el
primer cromatograma la hoja se rota 90 y se realiza una cromatografa
paralela al segundo borde utilizando otro sistema de solventes. Dado
que cada compuesto migra a una velocidad caracterstica en un sistema
Prctica No. 1 Separacin e Identificacin de Aminocidos de jugos de frutos
por Cromatografa Bidimensional en capa fina.
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de solventes
determinado,
la
segunda
cromatografa
debera
incrementar en grado sustancial la separacin de la mezcla de
componentes.
Los dos adsorbentes (fase
estacionaria) ms ampliamente
utilizados son la gel de slice
(SiO2) y la almina (Al2O3),
ambas de carcter polar. La
almina anhidra es el ms
activo de los dos, es decir, es el
que retiene con ms fuerza a los
compuestos; por ello se utiliza
para
separar
compuestos
relativamente
apolares
(hidrocarburos,
haluros
de
alquilo, teres, aldehdos y cetonas). El gel de slice, por el contrario, se
utiliza para separar sustancias ms polares (alcoholes, aminas, cidos
carboxlicos). El proceso de adsorcin se debe a interacciones
intermoleculares de tipo dipolodipolo o enlaces de hidrgeno entre el
soluto y el adsorbente. El adsorbente debe ser inerte con las sustancias
a analizar y no actuar como catalizador en reacciones de
descomposicin. El adsorbente interacciona con las sustancias mediante
interaccin dipolodipolo o mediante enlace de hidrgeno si lo
presentan.
Tras la eliminacin del disolvente, se determina la posicin de los
componentes con un reactivo de revelado (ninhidrina), y se determina la
posicin de cada mancha relativa al frente alcanzado por el solvente,
calculndose el correspondiente valor de Rf. La identificacin de tales
compuestos se suele realizar comparando sus Rf con los de compuestos
de referencia (patrones) de naturaleza qumica conocida.
Rf = Frente o distancia del soluto
Frente o distancia del disolvente
OBJETIVO
Prctica No. 1 Separacin e Identificacin de Aminocidos de jugos de frutos
por Cromatografa Bidimensional en capa fina.
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RESULTADOS:
En cada placa cromatografa se observan manchas de diferentes
tamaos correspondientes a cada uno de los aminocidos y a diferentes
distancias. De acuerdo a la relacin de migracin para las sustancias
aqu utilizadas se obtuvieron los siguientes valores de Rf para cada una
de ellas.
II Fase
Mvil
I Fase
Figura 3: Cromatograma 3 Bidimensional de aminocidos tipo. Fase mvil I: cloroformo-metanolamoniaco. Fase mvil II: butanol-cido actico-agua.
II Fase
Mvil
Figura 4: Cromatograma 4 Bidimensional del jugo de jitomate. Fase mvil I: cloroformo-metanolamoniaco. Fase mvil II: butanol-cido actico-agua.
Mvil
Aminocido
Frent
e del
solut
o
Frente del
disolvente
Rf
Frente
del
soluto
Frente
del
disolvent
e
Rf
Arginina
(Arg)
1.5
7.8
0.1923
1.4
7.9
0.1772
Lisina (Lys)
2.4
7.8
0.3076
1.2
7.9
0.1518
Glutamina
(Glu)
2.8
7.8
0.3846
3.3
7.9
0.4177
Glicina (Gly)
3.8
7.8
0.4871
2.6
7.9
0.3291
Prolina (Pro)
4.3
7.8
0.5512
2.7
7.9
0.3417
Triptfano
(Thr)
4.5
7.8
0.5769
3.2
7.9
0.4050
Histidina
(His)
4.8
7.8
0.6153
1.5
7.9
0.1898
Tirosina (Tyr)
5.1
7.8
0.6538
4.7
7.9
0.5949
Metionina
(Met)
6.4
7.8
0.8205
4.8
7.9
0.6075
Fenilalanina
(Phe)
6.8
7.8
0.8717
5.3
7.9
0.6708
Aminocido
1.
Fase
Cromatograma 3
Mvil
2
Fase
Cromatograma 3
Mvil
Frent
e del
solut
o
Frente del
disolvente
Rf
Frente
del
soluto
Frente
del
disolvent
e
Rf
Lisina Lys
1.2
7.9
0.1518
1.0
7.8
0.1282
Arginina Arg
1.4
7.9
0.1772
1.3
7.8
0.1666
Histidina His
1.5
7.9
0.1898
1.6
7.8
0.2051
Glicina Gly
2.6
7.9
0.3291
2.0
7.8
0.2564
Prolina Pro
2.7
7.9
0.3417
2.5
7.8
0.3205
Triptfano
Thr.
3.2
7.9
0.4050
2.8
7.8
0.3589
Gutamina Glu
3.3
7.9
0.4177
3.1
7.8
0.3974
Tirosina Tyr.
4.7
7.9
0.5949
4.7
7.8
0.6025
Metionina
Met
4.8
7.9
0.6075
4.8
7.8
0.6153
Fenilalanina
Phe.
5.3
7.9
0.6708
5.4
7.8
0.6923
Aminocido
1.
Fase
Cromatograma 4
Frent
e del
solut
Frente del
disolvente
Mvil
Rf
2
Fase
Cromatograma 4
Frente
del
Frente
del
disolvent
Mvil
Rf
o
Lisina Lys
Arginina Arg
Histidina His
Glicina Gly
Triptfano
Thr
Glutamina
Glu
Torosina Tyr.
Metionina
Met.
Fenilalanina
Phe
soluto
1.0
1.3
1.6
2.0
2.5
7.8
7.8
7.8
7.8
7.8
0.1282
0.1666
0.2050
0.2564
0.3589
1.0
1.2
2.2
2.5
2.7
7.9
7.9
7.9
7.9
7.9
0.1265
0.1518
0.2784
0.3164
0.3417
2.8
7.8
0.3974
2.9
7.9
0.3670
3.1
4.7
7.8
7.8
0.6025
0.6153
3.1
3.8
7.9
7.9
0.3924
0.4810
4.8
7.8
0.6923
5.3
7.9
0.6708
Tabla
4.
Cromatograma
bidimensionales
desarrollado en las 2 fases mviles.
Rf creciente en la 1
fase mvil
0.1282
0.1666
0.2564
0.3589
0.3974
0.6923
Rf en la 2 Fase
mvil
0.1265
0.1518
0.2784
0.3670
0.3924
0.6708
problema
(IV)
Aminocido
correspondiente
Lisina Lys
Arginina Arg
Glicina Gly
Triptfano Thr
Glutamina Glu
Fenilalanina Phe
DISCUSIN:
La cromatografa en capa fina como mtodo cualitativo y cuantitativo,
siempre requiere contar con un estndar de referencia; en este caso se
tuvieron 10 Aminocidos tipo (Arginina, Lisina, Glutamina, Glicina,
Prctica No. 1 Separacin e Identificacin de Aminocidos de jugos de frutos
por Cromatografa Bidimensional en capa fina.
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Fenilalanina.
PREGUNTAS EXTRAS:
1.- Investigar en la literatura los aminocidos que contiene el jugo
empleado como problema. Compare con sus resultados y concluya.
Nutriente
cido asprtico
cido glutmico
Alanina
Arginina
Cistina
Fenilalanina
Glicina
Hidroxiprolina
**Histidina
Isoleucina
Cantidad
113 mg.
314 mg.
24 mg.
17 mg.
0,93 mg.
22 mg.
17 mg.
0 mg.
12 mg.
21 g.
Nutriente
Leucina
Lisina
**Metionina
**Prolina
Serina
**Tirosina
Treonina
Triptfano
Valina
Cantidad
28 mg.
27 mg.
7 mg.
15 mg.
26 mg.
11 mg.
21 mg.
6 mg.
21 mg.
BIBLIOGRAFA: