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Manual de Hemostasia y Trombosis

1.- OBJETIVO
Realizar de una manera adecuada y correcta las tcnicas del laboratorio para evaluar la Hemostasia Primaria y/o secundaria

2.- ALCANCE
Aplica a todas las muestras y/o pacientes que acuden al AADC solicitando dichas pruebas.

3.- POLITICAS
3.1.- El horario para la toma y/o recepcin de las muestras ser de 7:00 a 9:00 de la maana de lunes a viernes.

3.2.- Para hacer efectiva la toma de la muestra el usuario debe cumplir con las condiciones descritas en el instructivo Requisitos
para toma de muestra.
3.3.- No usar muestras coaguladas.

4.-CONTENIDO

TECNICAS PARA LA DETERMINACIN DE PRUEBAS DE HEMOSTASIA Y FIBRINOLISIS

Tiempo de sangrado
Agregacin Plaquetaria
Tiempo de Protrombina (TP)
Tiempo de Tromboplastina Parcial activada (TTPa)
Fibringeno
Tiempo de Trombina (TT)
Factor VIII

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Factor IX
Lisis de Euglobulinas
Sulfato de protamina

Nota: Para las pruebas de TP, TTPa, TT y Fibringeno consultar el lineamiento para el manejo del equipo Diagnostica Star y los insertos
correspondientes de cada reactivo

TIEMPO DE SANGRADO (MTODO DE IVY)

PRINCIPIO
La

prueba de Tiempo de sangrado (TS) valora la capacidad hemosttica global in vitro y consiste en medir el tiempo

transcurrido desde la realizacin de una pequea incisin cutnea hasta que cesa la hemorragia a travs de ella. La prueba mide el
tiempo necesario para obtener un tampn hemosttico eficaz y, por tanto, representa una valoracin global y simultnea de los
procesos de adhesin, agregacin y liberacin plaquetarias.
El mtodo original del corte en el lbulo de la oreja, introducido por Duke en 1912, es poco sensible y menos reproducible, por
lo que no es aconsejable seguir utilizndolo hoy en da. En 1941, Ivy introdujo la aplicacin de un manguito de presin sangunea en la
parte superior del brazo y se mantiene a una presin de 40 mmHg para controlar la presin intracapilar en el antebrazo. Se elige y
prepara un sitio en la superficie anterior del antebrazo para realizar una pequea incisin. El tiempo de sangrado se define como el
tiempo entre la realizacin de una pequea incisin en la piel que produce sangrado y el momento en que ste se detiene. Aunque
esta definicin es aparentemente muy simple, el tiempo de sangrado tiene muchas variables. Es la prueba de hemostasia ms difcil
de efectuar de forma rutinaria, ya que es relativamente personal y subjetiva. No obstante, si se realiza con cuidado puede dar
resultados reproducibles y brindar informacin importante para la evaluacin de los pacientes con tendencia al sangrado.

Material:
Esfigmomanmetro
Lanceta

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Algodn
Alcohol
Cronmetro
Papel filtro Whatman # 42 (110 mm/dimetro)

Tcnica
1.-Se coloca el esfigmomanmetro en el brazo del paciente y se regula a 40 mmHg, mantenindolo a esta presin a lo largo de toda la
prueba.
2.-Desinfectar con el algodn la parte superior de la cara anterior del antebrazo.
3.-Con una lanceta se realiza manualmente un corte aproximado de 1cm de longitud por 1mm de profundidad, en la parte superior de
la cara anterior del antebrazo, en una zona sin vello y alejada de las venas superficiales, aprox. a unos 3 cm por debajo del pliegue del
codo y paralelo al mismo.
4.-Inmediatamente despus de realizar la incisin se pone en marcha el cronmetro.
5.-La sangre que brota de forma espontnea se va secando con un papel filtro cada 30 segundos, con la precaucin de que el papel
solo contacte con la sangre y no con la herida.
6.- Anotar el tiempo que tarda en cesar la hemorragia, que ser el resultado de la prueba.
Interpretacin del resultado
Los lmites de referencia para el tiempo de sangrado con la metodologa descrita, es de 2 hasta 8 minutos, y son claramente
patolgicos los tiempos superiores a 10 minutos y se consideran graves los superiores a 20 minutos.
La prueba se alarga por reduccin importante del nmero de plaquetas o por alteraciones funcionales de estas, congnitas o
adquiridas. Es sensible a las reducciones marcadas del hematocrito. El tiempo de sangrado puede prolongarse tambin cuando existe
una reduccin o una anormalidad en ciertos factores plasmticos que intervienen en la adhesividad y agregacin de las plaquetas,
como el factor von Willebrand, el fibringeno, o el factor V.

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La ingesta de aspirina en los das que preceden a la prueba suele inducir ligeras alteraciones en los resultados de sujetos normales,
pero magnifica la prolongacin secundaria a cualquier defecto hemosttico.
PRUEBA DE AGREGACIN PLAQUETARIA
Fundamento.- El estudio de la agregacin plaquetaria se ha hecho tcnicamente asequible con el moderno instrumental y la
aparicin de reactivos de simple utilizacin. Las plaquetas se agregan unas con otras en las fases iniciales del proceso hemosttico,
por lo que un defecto grave en esta etapa se asocia con hemorragia potencial, mientras que la hiper agregacin puede producir o
facilitar la trombosis. El proceso de agregacin se estudia en el laboratorio utilizando sustancias con capacidad agregante, como ADP,
epinefrina y Ristocetina. El mtodo empleado generalmente es el turbidimetria, la agregacin plaquetaria es un mtodo fundamental
para obtener informacin sobre la hemostasia primaria. Consiste en disponer de un plasma rico en plaquetas (PRP), obtenido a partir
de sangre citratada, en una cubeta transparente, a una temperatura de 37C y con agitacin continua por medio de una barrita de
hierro sometida a un campo magntico giratorio. La cubeta es atravesada por un haz de luz y cuando, se le adiciona un agente
inductor, se produce la agregacin, aumenta la transmisin de luz a travs de la cubeta y su intensidad es recogida grficamente.
MATERIAL
Agregmetro
Cubetas y barritas de agitacin magntica
Micropipetas
Puntas de 200 L y 1 mL
Plasma Citrato del paciente y testigo
Agentes Agregantes:
ADP
Adrenalina
Ristocetina
Mtodo.- ptico

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Tcnica
Preparacin de la muestra.
1.-Obtencion de plasma rico en plaquetas (PRP)
a.-Obtener sangre con anticoagulante de citrato sdico al 3.2 %, en los tubos habitualmente utilizados para pruebas de coagulacin.
(Paciente y Testigo). Tomar la cantidad necesaria para las pruebas a realizar.
b.-Centrifugar la sangre a 900 rpm por 15 minutos para obtener el plasma rico en plaquetas (PRP). Esto se debe hacer despus de
tomar la muestra ya que la vida media de las plaquetas es de aproximadamente 3 hrs.
c.-Separar 500 L del PRP y ponerlo en un tubo de plstico (falcon) rotulado como PRP para el paciente y el mismo procedimiento se
hace con el testigo.

2.-Obtencion de plasma pobre en plaquetas (PPP)

a.-Centrifugar de nuevo el remanente de los tubos de sangre total a 3500 rpm por 15 minutos para obtener el plasma pobre en
plaquetas (PPP).
b.-Se obtiene un plasma claro donde todas las plaquetas por la fuerza centrfuga ya estn sedimentadas al igual que los eritrocitos.
3.-Cuantificacion de plaquetas del PRP
Al PRP que se obtiene; realizar un conteo automatizado de plaquetas (SYSMEX KX-21). Una vez obtenida la tira con el resultado de
las plaquetas estas se ajustan a 200 mil si fueran necesarias.
Calculo para ajustar las plaquetas a 200 mil
Frmula:
C1V1 = C2V2

V1 = C2V2
C1

C1= # de plaquetas automatizadas

V1 = ? (Vol del plasma rico en plaquetas)
C2= 200 (concentracin final)

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V2= 2 ml (volumen final)

Reactivos.
Adrenalina.-Preparar una dilucin 1:10 con solucin salina. Tomar de esta dilucin 50L y aadirlo al PRP y/o usar 5L del reactivo.

ADP.- Aadir 5 L de este reactivo al PRP

Ristocetina.-Aadir 5 L de este reactivo al PRP
PROGRAMA AGROLINK PARA AGREGACIN PLAQUETARIA.
1.- Encender el regulador
2.-Encender el equipo Chrono-Log Aggro/Link que es complementario del equipo de agregometra.
3.-Conectar la computadora.
4.-Esperar que el equipo alcance una temperatura de 37C
5.-Seleccionar el Icono Aggrolink
6.-Seleccionar Run New
7.-En la ventana de Run Test llenar los siguientes datos
Test Identificacin: en trace 1 poner los datos del paciente
Test Procedure: seleccionar edit
Define Test Procedure: seleccionar el agonista a usar.
Seleccionar Ok.
PROCEDIMIENTO
1.-Disponer de 450 L de PRP en tantas cubetas como pruebas se vayan a realizar conteniendo una barrita de agitacin cada una de
ella.

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2.-En otra cubeta disponer de 450 L de PPP para usarlo como blanco.
3.-Introducir la cubeta de PPP y una de PRP en el agregmetro en sus posiciones correspondientes.
4.-Presionar en el equipo Chrono-log Lumi-aggregometer los botones de Set baselines aprox. 30 seg. Para obtener el ajuste de la
densidad ptica y para que la agregacin empiece en 0%.
5.-Dispensar en el fondo de la cubeta que contiene el PRP el agente agregante de la prueba a realizar permitir que esta se desarrolle
durante 5 a 6 min y luego detener la prueba. Observar el % de agregacin del Paciente Testigo.
6.-Retirar la cubeta de PRP y sustituirla por otra para la segunda prueba, en la que se seguirn los mismos pasos.
7.-Despus de terminar de realizar las pruebas se sale del programa y apagar el agregmetro, la computadora y reguladores.

INTERPRETACION DEL RESULTADO

Es habitual que los enfermos presenten una agregacin de 70% o menor con los agonistas mencionados. Las enfermedades
de las glicoprotenas plaquetarias, como la tromboastenia de Glazmann, presentan un defecto grave en la agregacin con respuesta a
agentes como el ADP o la colgena. En la enfermedad de Von Willebrand, la agregacin con Ristocetina resulta anormal en la forma
habitual y ms frecuente de la enfermedad, ya que la Ristocetina slo produce Agregacin en presencia del factor de Von Willebrand.
Esta prueba tambin se puede utilizar para valorar el efecto de los anti-agregantes plaquetarios, como la aspirina, adems de los
casos de tendencia a la trombosis, como el llamado sndrome de las plaquetas pegajosas.
DETERMINACION DEL FACTOR VIII
El FVIII es una glicoprotena con un peso molecular de aproximadamente 280 KDa. Se encuentra en el hgado, el bazo. El FVIII
circula en al plasma formando un complejo no covalente con el factor Von Willebrand (FVIII/FvW). La trombina y el factor Xa activan el
factor VIII para que este desencadene la activacin del factor X por el factor IXa en presencia de fosfolpidos y iones de calcio. La
deficiencia congnita del factor VIII se manifiesta como hemofilia A cuya gravedad depende de la calidad del factor VIII presente:
< 1%

Hemofilia severa

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1-5%

Hemofilia moderada

5-25% Hemofilia leve

PRINCIPIO.- Despus de aadir plasma deficiente del factor VIII a una muestra de plasma citratada diluida, el sistema de coagulacin
endgeno es activado por un reactivo TTPa apropiado. La adicin de iones calcio provoca la coagulacin ulterior hasta la formacin de
cogulos de fibrina. El incremento del tiempo de coagulacin es inversamente proporcional a la actividad del factor VIII y se indica
como % de la actividad normal. La conversin del tiempo en segundos a un valor porcentual se realiza con una curva de calibracin.
MATERIAL
Reactivo: Plasma Humano deficiente de VIII (liofilizado). Este se disuelve con 1 ml de agua desionizada. Mezclar suavemente para
obtener una solucin Homognea. No agitar para evitar la formacin de espuma. Dejar reposar 30 minutos de 18 a 25C.

Sangre obtenida con citrato de sodio del paciente y testigo

Coagulmetro

Reactivo FVIII

Reactivo de TTPa

TCNICA
Hacer una dilucin 1:10 del plasma paciente y del plasma testigo hacer dilucin 1:10, 1:20, 1:40, 1:80.
1.-Colocar las cubetas en el coagulmetro
2.-Aadir la balinita
3.-Anadir 50 L del reactivo de FVIII
4.-Aadir 50 L de la muestra diluida 1:10 del paciente
5.-Aadir 50 L del reactivo de TTPa

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6.-Activar el cronometro (Incubar a 37C durante 5 minutos)

7.-Aadir 50 L del Cloruro de calcio.
8.-Observar la formacin del cogulo y anotar el tiempo en segundos en que esto ocurrio.
9.-Hacer lo mismo con las otras diluciones del testigo (1:10, 1:20, 1:40, 1:80) para la obtener la curva de calibracin.
10.-Usando un papel antilogaritmico graficar la concentracin del tiempo en segundos de las diluciones del testigo y obtener la
concentracin del FVIII del paciente.
DETERMINACION DEL FACTOR IX
PRINCIPIO.-El factor IX es una glicoprotena con un peso molecular de aproximadamente 56 kilodalton. Se sintetiza en el
hgado como precursor fisiolgicamente indiferente de la coagulacin para adquirir su forma definitiva por accin de la carboxilasa
dependiente de la vitamina K. Despus de aadir plasma deficiente del factor IX a una muestra de plasma citratado diluido, el sistema
de coagulacin endgeno se activa con un reactivo TTPa apropiado. La adicin de iones calcio provoca la coagulacin ulterior hasta
la formacin de cogulos de fibrina. El tiempo de coagulacin prolongado es inversamente proporcional a la actividad del factor IX y se
indica como porcentaje de la actividad normal. La conversin del tiempo en segundos a un valor porcentual se realiza con una curva
de calibracin.

El factor IX se ve activado por dos factores: el factor XIa en presencia de iones clcicos; el factor VIIa en presencia de iones
clcicos fosfolpidos. Al formar un complejo con el factor VIIIa, el factorIXa transforma el factor X en Xa en presencia de iones calcio y
fosfolpidos. La deficiencia congnita del factor IX se manifiesta como hemofilia B cuya gravedad depende de la cantidad del fcator IX
presente:
< 1%

Hemofilia severa

1-5%

Hemofilia moderada

5-25% Hemofilia leve

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Estados de deficiencia adquirida se producen durante el tratamiento con anticoagulantes orales, en hepatopatas como la cirrosis o la
hepatitis, en caso de absorcin trastornada de la vitamina K por ejemplo: en enfermedades hemorrgicas del recin nacido, en ictericia
o en tratamiento con antibiticos.

MATERIAL
Reactivo: Plasma Humano deficiente de IX (liofilizado). Este se disuelve con 1 ml de agua desionizada. Mezclar suavemente para
obtener una solucin Homognea. No agitar para evitar la formacin de espuma. Dejar reposar 30 minutos de 18 a 25C.
Sangre obtenida con citrato de sodio del paciente y testigo
Coagulmetro
Reactivo FIX
Reactivo de TTPa
TCNICA
Hacer una dilucin 1:10 del plasma paciente y del plasma testigo hacer dilucin 1:10, 1:20, 1:40, 1:80.
1.-Colocar las cubetitas en el coagulmetro
2.-Anadir la balinita
3.-Anadir 50 L del reactivo de FIX
4.-Aadir 50 L de la muestra diluida 1:10
5.-Aadir 50 L del reactivo de TTPa
6.-Activar el cronometro (Incubar a 37C durante 180 segundos)
7.-Aadir 50 L del Cloruro de calcio.
8.-Observar la formacin del cogulo y anotar el tiempo en segundos en que esto ocurri.

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9.-Hacer lo mismo con las diluciones del testigo (1:10, 1:20, 1:40, 1:80) para la obtener la curva de calibracin.
10.-Usando un papel antilogaritmico graficar la concentracin del tiempo en segundos para obtener la concentracin del FIX del
paciente.
LISIS DE

EUGLOBULINAS

PRINCIPIO.-La fibrinlisis se estudia mediante la prueba de lisis de Euglobulinas. La fraccin de Euglobulinas del plasma es
precipitada por dilucin y acidificacin a pH 5.3. En el precipitado se encuentran el fibringeno y plasmingeno, que en su estado
activo se convierte en plasmina. Esta prueba consiste en precipitar las euglobulinas plasmticas mediante cido actico diluido. La
precipitacin de las euglobulinas, permite la eliminacin de inhibidores de la fibrinlisis en el sobrenadante. Las Euglobulinas
plasmticas precipitan con el cido al 1% y se vuelven a quedar en suspensin en la solucin de buffer de boratos para coagular ms
tarde cuando es aadido el CaCl2.
Muestra biolgica: Plasma citratado del paciente y testigo
Reactivos: Cloruro de calcio (CaCl2 ) 0.025 M
cido actico al 1%
Buffer de boratos pH 9
TCNICA
1.-Marcar dos tubos de 10 ml aprox. uno para el paciente y otro para el testigo
2.-Agregar a cada uno de los tubos 9 ml de agua desionizada, 100 L de Ac. Actico al 1%.
3.-Al tubo del testigo agregar 500 L de su plasma
4.-Al tubo paciente agregar 500 L de su plasma
5.-Mezclar bien y guardar a 40 C por 20 min.
6.-Luego repartir en proporciones iguales en 2 tubos de 7 ml el contenido del tubo de 10 ml (dos paciente y dos testigo)

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7.- Centrifugar 3 min a 1000 rpm

8.-Despus decantar el sobrenadante, escurrir y dejar secar (aprox 10 min)
9.-Aadirle 500 L de buffer de boratos a cada tubo
10.-Meter los tubos a bao mara a 370 C y con un aplicador de manera agitar en el fondo y despus aadirle 500 L de CaCL2
11.-Mezclar bien y se deja en el bao mara a 37 0C
12.-Checar la formacin del cogulo y empezar a contar el tiempo si no se disolvi el cogulo despus de 120 minutos la prueba es
negativa.

SULFATO DE PROTAMINA
Fundamento:
La adicin de sulfato de protamina al plasma da por resultado la formacin de fibras de fibrina o gelificacin en presencia de
monmeros de fibrina a productos de degradacin primarios de la fibrina (fdp). Esta prueba aunque parezca fcil de realizar requiere
tiempo, debe solicitarse cuando el paciente presenta un cuadro clnico que sugiera una hemorragia masiva y que la sangre no forme
cogulo, adems de que cuando las otras pruebas de coagulacin, como el TP, TTPa, TT estn prolongados, debe considerarse como
una urgencia cuando se sospecha la activacin del sistema fibrinoltico.
La prueba es insensible para el fibringeno y productos de degradacin del fibringeno (FDP). Es negativa en plasma normal y
fibrinlisis primaria. Es positivo en Coagulacin Intravascular diseminada (CID).
Muestra
Sangre Obtenida con Citrato de sodio al 3.8% del paciente y testigo
Solucin salina
Ampolleta de Protamina

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Tcnica:
1.-Centrifugar las muestras 15 minutos a 3500 rpm
2.-Realizar diluciones seriadas 1:5, 1:10, 1:20, 1:40 y 1:80 de la Protamina con Solucin salina. (Todas las diluciones se preparan en
tubos de 5ml)
3.-Marcar 4 tubos con cada una de esas diluciones y agregarle 200 L de esas diluciones y luego aadirle 200 L del plasma del
paciente a cada tubo
4.-Realizar lo mismo con la muestra del testigo
5.-Mezclar bien e incubar a 37C
6.-Observar a los 15, 30, 45 y 60 minutos si hay formacin del cogulo.
INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS

Se considera positiva si se observa formacin del cogulo en la dilucin 1:10 del paciente.

Negativa si no hay formacin del cogulo.

5.-

DOCUMENTOS DE REFERENCIA

Cdigo
(cuando aplique)

Nombre del documento

Lugar de almacenamiento

N/A

Fundamentos de Interpretacin Clnica de los Examenes de laboratorio.Ruiz

Arguelles G. Ed. Medica panamerica.2005

Laboratorio AADC

N/A

Manual de Tcnicas de laboratorio en Hematologa 1era. Ed.

Laboratorio de AADC

Limitations of using PRP in the study of platelet agggregation. Cronolog-Log.

Laboratorio de AADC

Lineamiento para el manejo de Residuos Peligrosos Biolgicos infecciosos (RPBI).

Laboratorio de AADC

N/A
L-CIRB-AADC-01

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Revisin: 02

Fecha de emisin:
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6.- CONTROL DE REVISIONES

NIVEL DE
REVISIN
01

02

SECCIN
Y/O PGINA
Todo el
documento
Todo el
documento

DESCRIPCIN DE LA MODIFICACIN Y MEJORA

Se elimin el cdigo de CIPLADE que no corresponda a este manual.

Se mejor la redaccin del escrito
Se elimin el ndice, la introduccin y el glosario.

FECHA DE MODIFICACIN

18- Enero- 2013

18 de Agosto del 2015

Nota: La seccin 10 ser utilizada a partir de la primera modificacin a este documento. La revisin 00, se mantendr en blanco.

7.- CONTROL DE EMISIONES

Elabor

Revis

Aprob

M en C. Irma Quintal Ortiz

Tcnico Acadmico

QFB. Gabriela Alonzo Salomn

Responsable del AADC

Dr. Jorge Zavala Castro

Director del CIR

Las firmas avalan la responsabilidad de las personas que: elaboran el documento, revisan su adecuacin y aprueban para su
implementacin dentro del Sistema de Gestin de la Calidad de la Universidad Autnoma de Yucatn.