Las Caspasas: Un enemigo en nosotros

La existencia de la maquinaria apopttica fue predicha a partir de la observacin de la estereotpica

morfologa de las clulas a punto de morir, bajo condiciones fisiolgicas, como resultantes de injurias
leves. Estos cambios reflejan complejos eventos bioqumicos llevados a cabo por una familia de
proteasas denominadas caspasas. En funcin de que es poco conocido el mecanismo de regulacin
de las caspasas, resulta importante primero revisar la protelisis, que a diferencia de la mayora de las
modificaciones postranslacionales, es irreversible. Esto implica que la nica forma de controlar una
proteasa es limitando su actividad ya que una vez que se ha producido el clivaje de una protena, la
nica correccin posible es sintetizarla nuevamente. Considerando esta caracterstica general de la
protelisis, no debe sorprendernos encontrar estas enzimas en procesos tan irreversibles como el
desarrollo, el ciclo celular y el ms irreversible de todos: la muerte celular.
La mayora de las proteasas son sintetizadas como precursores de muy baja actividad cataltica. En
general, el precursor es convertido a la forma activa por procesamiento proteoltico, lo que se produce
por otra proteasa o por autocatlisis, disparada por la unin a un cofactor o por la remocin de un
inhibidor. El precursor puede acumularse en grandes cantidades y activarse en funcin de la demanda.
Las proteasas pueden regular su propia activacin. Esto puede realizarse a travs de retroalimentacin
positiva o negativa, generando un lazo de amplificacin en el que la proteasa activa puede directa o
indirectamente activar al precursor, resultando en una tasa de activacin exponencial y asegurando
que la proteasa cumpla su objetivo rpidamente.
Donde existe una proteasa existe un inhibidor. El inhibidor puede establecer un umbral que regula la
concentracin de la proteasa activa en la clula. Este umbral previene de las consecuencias de la
activacin espontnea, un evento no deseado si la enzima activa puede matar la clula.
Las reacciones proteolticas pueden ser especficas. La especificidad de las proteasas es a menudo
determinada por una combinacin de las estructuras primaria, secundaria o terciaria de las protenas
que actan como substrato. La protelisis que gobierna procesos biolgicos crticos (por ejemplo el
ciclo celular o la muerte celular) es altamente especfica e involucra un restringido conjunto de
substratos.
Que son las caspasas?
Las caspasas fueron implicadas en la apoptosis a partir del descubrimiento que el producto gnico
CED-3, requerido para la muerte celular en el nemato de Caenorhabditis elegans, est relacionado con
la enzima convertidora de interleucina-1b de mamferos (ICE-1 o caspasa-1). la caspasa-1 , fue el
primer miembro identificado de una gran familia de proteasas cuyos miembros tienen distintos roles en
los procesos de inflamacin y apoptosis (Fig. 1A). En apoptosis las caspasas funcionan tanto en el
desensamble (efectores) como iniciando los procesos que conducen al desensamble celular
(iniciadoras).

Las caspasas comparten similitudes en la secuencia de aminocidos, estructura y especificidad por el

substrato. Todas ellas son expresadas como proenzimas que contienen tres dominios: un dominio
terminal-NH2, una subunidad grande y una pequea. La activacin involucra el procesamiento
proteoltico entre los dominios, seguido por la asociacin de las subunidades grande y pequea para
formar un heterodmero. La estructura cristalina de dos de las caspasas activas (caspasas-1 y -3)
muestra que, en ambos casos, dos heterodmeros se asocian para formar un tetrmero, con dos sitios
catalticos que parecen funcionar independientemente. Dentro de cada dominio cataltico las unidades
grande y pequea estn ntimamente asociadas, contribuyendo ambas con los residuos necesarios
para la unin al substrato y la catlisis.
Dos caractersticas de la estructura de las proenzimas, son centrales para el mecanismo de activacin
de estas proteasas. Primero, el dominio amino-terminal, que es altamente variable en secuencia y
longitud, est involucrado en la regulacin de la activacin de estas enzimas. Segundo, todos los
dominios derivan de la proenzima por clivaje en el sitio de consenso de las caspasas, implicando que
estas enzimas pueden ser activadas tanto autocatalticamente como por una cascada de enzimas con
especificidad similar.
Las caspasas estn entre las proteasas ms especficas, con un inusual y absoluto requerimiento para
el clivaje en la posicin posterior al c. asprtico. El reconocimiento de al menos cuatro ac. aminoterminales en el sitio de clivaje es tambin un requerimiento para una catlisis eficiente. El tetrapptido
de reconocimiento preferencial difiere significativamente entre las caspasas, explicando la diversidad
de sus funciones biolgicas.
Su especificidad es an ms estricta: no todas las protenas que contienen la secuencia ptima de
tetrapptidos son clivados, implicando que la estructura terciaria puede influenciar el reconocimiento
del substrato. El clivaje de protenas por caspasas es no solo especfico sino altamente eficiente
(kact / Km > 106 M-1 s-1). La estricta especificidad de las caspasas es consistente con la observacin que
la apoptosis no va acompaada de una indiscriminada digestin proteica, sino que un selecto conjunto
de protenas es clivado de forma coordinada, usualmente en un solo sitio, resultando en su prdida o
cambio de funcin.
Cmo las caspasas matan a una clula
Los eventos apoptticos incluyen fragmentacin del DNA, condensacin de cromatina, vesiculacion de
la membrana, encogimiento celular, y desensamble de las clulas en vesculas rodeadas de
membrana (cuerpos apoptticos). In vivo, este proceso culmina con el encierre de estos cuerpos por
las clulas vecinas, previniendo las complicaciones que podran resultar de la liberacin del contenido
intracelular.
Estos cambios ocurren en una secuencia predecible y reproducible, que puede completarse entre los
30 y 60 minutos.
El cmo las caspasas contribuyen a este proceso no est completamente comprendido, principalmente
debido a que la mayora de los substratos conocidos han sido hallazgos fortuitos. Como resultado de
los 40 o algo as de los que han sido identificados, la relacin de su clivaje con la muerte celular es
bien conocida solo para un poco. Sin embargo esos pocos ejemplos sugieren que un subconjunto de
caspasas (efectoras) es responsable de los cambios celulares que ocurren durante la apoptosis y
proveen una idea del mecanismo empleado

Uno de los roles de las caspasas es inactivar protenas que protegen clulas vivas de la apoptosis. Un
ejemplo claro es el clivaje de ICAD/ DFF45, un inhibidor de la nucleasa responsable de la fragmentacin
del DNA, CAD (caspase-activated deoxyribonuclease). En clulas no-apoptticas, las CAD estn
presentes como un complejo inactivo: ICAD. Durante la apoptosis, el complejo ICAD es inactivado por
caspasas liberando CAD que funciona como una nucleasa. Sin embargo, este sistema no es tan
simple como aparenta: las CAD sintetizadas en ausencia de ICADno son activas, implicando que el
complejo CAD- ICADse forma co-translacionalmente, y que ICAD es requerido tanto para la activacin
como para la inhibicin de esta nucleasa.
Otros reguladores negativos de apoptosis son las protenas Bcl-2. Aparentemente cuando son
clivadas, no solo se eliminan sus propiedades antiapoptticas, sino que algunos de los fragmentos
resultantes promueven apoptosis. Que tales feedbacks positivos estn involucrados en el control de
apoptosis no debe sorprender, dada su importancia en la regulacin de otros sistemas proteolticos.
Las caspasas contribuyen a la apoptosis a travs del desensamble de la estructura celular, como lo
ilustra la destruccin de la lmina nuclear, una estructura rgida que tapiza internamente la membrana
nuclear y est implicada en la organizacin de la cromatina. La lmina est formada por polmeros de
protenas filamentosas intermedias. Durante la apoptosis estas son clivadas en un sitio nico por las
caspasas causando el colapso de la lamina y contribuyendo a la condensacin de la cromatina. Las
caspasas indirectamente tambin reorganizan estructuras por el clivaje de protenas involucradas en la
regulacin del citoesqueleto, incluyendo la gelsolina, la quinasa de adhesin focal y la quinasa
2 activada por p21. El clivaje de estas protenas resulta en la desregulacin de su actividad. Por
ejemplo en el caso de la gelsolina (una protena que rompe los filamentos de actina en una va
regulada, unindose a su extremo + y previniendo el intercambio de los filamentos) su clivaje por una
caspasa genera fragmentos constitutivamente activos.
La disociacin de dominios regulatorios y efectores es un carcter distintivo de la funcin de las
caspasas. Por ejemplo las caspasas desactivan o desrregulan las protenas involucradas en la
reparacin de DNA (tales como la DNA-PKCs), del empalme del mRNA (tal como U1-70K) y de la
replicacin del DNA (como el Factor de Replicacin C). Aunque la relacin de estos clivajes con la
muerte celular no han sido completamente clarificados, resulta muy probable que el desensamblaje de
funciones reparativas y homeostticas crticas facilitan el desensamblaje celular.
Las caspasas participan en apoptosis en una forma planeada y ejecutada . Las caspasas cortan el
contacto con las clulas vecinas reorganizan el citoesqueleto, y apagan la replicacin y reparacin del
DNA, interrumpen el empalme, destruyen el DNA, rompen la estructura nuclear, inducen a la clula
exhibir seales que las marcan para ser fagocitadas y desintegran las clulas en cuerpos apoptticos.
Conforme se desarrollen mejores tcnicas para encontrar nuevos substratos para las caspasas, mejor
se comprendern los mecanismos usados para que estos cambios se produzcan.
La consideracin de estrategias teraputicas potenciales para inducir selectivamente apoptosis en las
clulas (por ejemplo cancerosas) origina varias preguntas acerca de los substratos, por ejemplo, Cul
es el mnimo conjunto de substratos que pueden ser clivados para eliminar inocuamente una clula?
Claramente el clivaje de ICADparece resultar en la muerte celular, pero es poco probable que promueva
la fagocitosis de las clulas. Desde otro punto de vista, quizs disparar la "engullida" de una clula,
podra ser suficiente para "sepultarla" viva.
El descubrimiento que muchas protenas claves poseen sitios de clivaje para caspasas desafa la
comprensin de la vida y su evolucin. En efecto, Qu pudo ocurrir, para que las clulas
evolucionasen de tal manera que puedan ser tan rpidamente desensambladas? Por qu en los

componentes celulares coexisten dos funciones opuestas: el soporte de la vida y tambin los
mecanismos que conducen a su muerte?

Cmo son reguladas las caspasas?

La observacin que los precursores de las caspasas son constitutivamente expresados (an en
neuronas) pero que las clulas vivas pueden ser inducidas a sufrir apoptosis rpidamente, indica que
la regulacin de las caspasas es "sofisticada" y efectiva. Los complejos sistemas proteolticos, que a
menudo involucran una combinacin de proteasas regulatorias, cofactores, retroalimentaciones y
umbrales, que convergen para controlar la actividad de una proteasa efectora, que lleva adelante la
funcin de todo el proceso. Esta intrincada regulacin da cuenta de una caracterstica espectacular de
estos sistemas: mantienen la proteasa efectora inactiva pero, en respuesta de cantidades mnimas de
un inductor apropiado, son capaces de activar grandes cantidades de sta rpidamente.
Dada la funcin de las caspasas como mediadores de muerte celular, la complejidad de su regulacin
podra rivalizar con la de los sistemas de complemento y de coagulacin.
Activacin de caspasas efectoras: Numerosas evidencias genticas y bioqumicas soportan que el
modelo de activacin de caspasas efectoras: una seal proapopttica culmina en la activacin de un
iniciador de caspasas que activa las caspasas efectoras, resultando en el desensamble celular.
Diferentes iniciadores de caspasas actan mediando distintos conjuntos de seales. Por ejemplo la
caspasa-8 est asociada con apoptosis por receptores de muerte celular. En contraste la caspasa-9
esta involucrada en la muerte celular inducida por agentes citotxicos. Este modelo explica porqu
distintas seales apoptticas inducen los mismos cambios bioqumicos y morfolgicos.
Activacin de caspasas iniciador: Las evidencias disponibles indican que la activacin de caspasas
iniciadoras requiere la unin de cofactores especficos, un mecanismo que es comnmente observado
en proteasas. Esta unin es disparada por la unin de una seal proapopttica y mediada a travs de,
por lo menos, uno de los dos diferentes motivos estructurales que residen tanto en el prodominio de la
caspasa como en el del co-factor correspondiente. Por ejemplo la activacin de la procaspasa-8
requiere de la asociacin con su co-factor FADD (Fas-associated protein with death domain) con el
DED (death effector domain), mientras que la procaspasa-9 involucra un complejo con el cofactor Apaf1 a travs del CARD (caspase recruitment domain) La activacin de la caspasa-9 tambin requiere
citocromo c y desoxiadenosina trifosfato, indicando que la activacin de caspasas puede requerir de
mltiples cofactores.
Cmo la unin de cofactores puede llevar a la activacin?
Ya que no existe una estructura cristalina de un precursor de caspasas, los modelos propuestos se
basan en evidencias indirectas. El modelo de induccin por proximidad o de oligomerizacin, est
basado en tres observaciones: las procaspasas tienen actividad baja, pero detectable, requieren de
dimerizacin para su activacin y las procaspasas sobreexpresadas en las clulas y entrecruzadas
artificialmente se tornan activas. El modelo argumenta que las caspasas estn en estado de latencia
en las clulas debido a que se encuentran en estado monomrico a bajas concentraciones. Los
cofactores actan llevando a dos o ms precursores de caspasas a un estado de estrecha proximidad,
permitindole realizar una activacin autoproteoltica intermolecular. Sin embargo existen unas cuantas

cuestiones que este elegante modelo debera clarificar. Por ejemplo no est probado que el iniciador
de precursores de caspasas sea realmente monomrico en las clulas vivas.
Muy poco es lo que se conoce de la regulacin de la interaccin entre procaspasas y sus cofactores.
Un ejemplo fue provisto por el descubrimiento del FADD-like ICE innhibitory proteins (FLIPs). Estas
protenas son similares en secuencia a la procaspasa-8 excepto por que carecen del residuo cataltico
esencial. Estas protenas probablemente compiten con la procaspasa-8 para unir su cofactor FADD,
previniendo as la activacin de la caspasa. Parece ser que la caspasa-8 no es la nica que posee un
seuelo, como ha sido sugerido por los descubrimientos del CARD , ARC (apoptosis repressor with
caspase recruitment domain) Los factores que determinan cmo los cofactores eligen entre las
procaspasas y sus seuelos an no han sido dilucidados.
La compartimentalizacin de las caspasas y sus cofactores podra ser otra manera de regular la
activacin de las caspasas. Esta nocin est soportada por el descubrimiento que los extractos de
algunas clulas vivas pueden activar caspasas espontneamente, sugiriendo que todos los
componentes para la activacin de las caspasas estn presentes pero secuestrados en las clulas
vivas. Esta observacin llev al descubrimiento que el citocromo c es requerido para la activacin de
caspasa-9 in vitro y la subsecuente hiptesis que la apoptosis puede ser disparada por induccin de
cambios mitocondriales que resultan en la liberacin de este cofactor. Otro ejemplo es provisto por el
descubrimiento que la caspasa-8 es activada cuando es reclutada por el complejo receptor FAS. La
determinacin de la ubicacin subcelular de las caspasas y sus cofactores es un rea de intensa
investigacin en la actualidad, ya que permitira contribuir a una mejor comprensin de la regulacin de
las caspasas.
Pueden las Caspasas ser el blanco de tratamientos de enfermedades?
Hay dos tipos opuestos de enfermedades que involucran una desrregulacin de la apoptosis. Estn
aquellas en las que la apoptosis es excesiva, causando dao a los tejidos normales y aquellas en las
que la apoptosis es prevenida permitiendo el crecimiento de los tejidos malignos. En concordancia con
esto, las dos estrategias a seguir sern: inhibicin de las caspasas o induccin de la apoptosis va
activacin de las caspasas, respectivamente.
Inhibicin de las caspasas. La apoptosis excesiva ha sido responsabilizada en varias patologas
serias para las que usualmente existen limitadas opciones teraputicas. Por ejemplo podemos incluir
en este grupo a las enfermedades neurodegenerativas, la injuria por reperfusin isqumica,
enfermedades de respuesta a injertos, y enfermedades autoinmunitarias. Las caspasas constituyen
atractivos blancos potenciales de estas condiciones dado el indispensable rol de estas molculas en la
apoptosis y las perspectivas de las terapias basadas en inhibidores de pequeas molculas.
Adicionalmente existen un cmulo de evidencias que estas metodologas pueden resultar exitosas en
el tratamiento de estas patologas. Por ejemplo el tratamiento con p35 previene la disminucin de los
mutantes de Drosophila con degeneracin retiniana, indicando que la inhibicin de caspasas puede
funcionalmente rescatar clulas de la muerte. En adicin, los inhibidores peptidil-caspasas son
efectivos en modelos animales de stroke, injuria por isqumia - reperfusin miocrdica, patologas
hepticas e injurias cerebrales traumticas.

Muchas cuestiones significativas an deben ser determinadas, particularmente en relacin con el

tratamiento de desrdenes crnicos. Cules son los mejores blancos de las caspasas para la
inhibicin de la apoptosis? Para responder esta pregunta se requiere un mejor conocimiento de del rol
de caspasas individuales en diferentes tejidos. Pueden las enfermedades crnicas ser tratadas con
seguridad sin riesgo de desarrollar enfermedades autoinmunes o progresiones tumorales? Para este
tipo de patologas puede requerirse la liberacin de inhibidores selectivos. Es probable que al menos
inicialmente, resulte ms realista considerar el tratamiento de desrdenes agudos.
Desde una perspectiva pragmtica, Podr ser identificado un inhibidor de caspasas con propiedades
apropiadas para su uso in vivo?. A la fecha, se han usado dos clases mayores de drogas inhibidoras
de proteasas: los inhibidores de la enzima conversora de angiotensina (ACE) y los inhibidores de las
proteasas del virus de inmunodeficiencia adquirida. Existen actualmente otros pocos ejemplos, pero no
muy extendidos en la prctica clnica. Esto refleja en parte, las dificultades prcticas de generar
pequeas molculas, inhibidores no-peptdicos de las enzimas proteolticas, que sean selectivos,
estables y con capacidad de penetrar la membrana efectivamente.
Existen elegantes trabajos experimentales sobre inhibicin de cistena - proteasas que han significado
un punto de partida, en la identificacin de varias clases de potentes inhibidores de caspasas
reversibles e irreversibles. Estudios con estos componentes proveern sin dudas respuestas a muchas
de las cuestiones relacionadas con el potencial teraputico de la inhibicin de las caspasas.
Tratamiento del Cncer. Dos problemas principales de las quimioterapias convencionales son: la
toxicidad para las clulas normales y las fallas en la capacidad de matar las clulas cancergenas.
Ambos problemas se originan del mecanismo indirecto por el cual, tanto las drogas quimioteraputicas
como la irradiacin, matan a las clulas. El dao se produce tanto sobre las clulas normales como
sobre las cancerosas y este dao es trasladado a travs de mltiples pasos hacia la muerte celular, de
forma similar a lo que ocurre con la activacin de las caspasas que conduce a la apoptosis. Cuando
estos pasos son comprometidos la terapia falla.
Una estrategia alternativa es disear un tratamiento que active las caspasas directamente. Una
posibilidad involucra la activacin de complejos de receptores que estn directamente unidos a
caspasas iniciadoras.) Debido que los receptores de muerte son tambin expresados en clulas
normales, el principal desafo de esta estrategia es activar estos receptores selectivamente en las
clulas cancerosas.
Otro mtodo puede provenir de la observacin que las oncoprotenas que desrregulan el ciclo celular
pueden activar caspasas e inducir apoptosis. Asimismo, la transformacin oncognica puede ser
pensada como una seal proapopttica, que est presente solo en clulas transformadas. Cuando
esta seal esta desacoplada de la activacin de la caspasa, la clula sobrevive. La comprensin de
cmo esta seal puede ser re- acoplada a la activacin de la caspasa puede proveer una oportunidad
para selectivamente destruir a las clulas transformadas.Si ste u otros mtodos pueden resultar
beneficiosos, no est an claro. Es de esperar que en el futuro las clulas tumorales puedan
analizarse por sus defectos en la activacin de caspasas, como se hace actualmente con las

proteasas de la coagulacin, y los tratamientos puedan basarse en esta informacin ms que en una
compilacin de reglas empricas como es la base de la quimioterapia clsica.
En suma, se ha producido un progreso substancial en relacin con la comprensin de las propiedades
catalticas y estructurales de las caspasas activas, y su contribucin a la apoptosis. El objetivo de
futuras investigaciones ser comprender la regulacin de estas enzimas. Esto debera facilitar los
esfuerzos por manipular la maquinaria apopttica con fines teraputicos.

Jorge Juica Navea

Tania Ledezma Maluenda
Sebastin Lpez Acosta
Nicols Olivares Mondaca