Bioensaios de toxicidade aguda com frmacos: diclofenaco de sdio e paracetamol

Keila da Silva Machado a, Maressa Pomaro Casali b, Diego Moure Oliveira c, William
Deodato Isique d, Maurcio Augusto Leite e, Alessandro Minillo f.
a, b, c, d, e, f: Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira, Universidade Estadual
Paulista, Avenida Brasil, 56, Ilha Solteira, Brasil. E-mail: alminillo@yahoo.com.br
*Autor para correspondncia:
E-mail: k_silva28@yahoo.com.br
Palavras-chaves: Biomonitoramento, teste de sensibilidade, ecotoxicologia,
Ceriodaphnia silvestrii
Ttulo abreviado: Bioensaios com frmacos
ABSTRACT The pharmacs represent a group of emergent environmental
contaminants with high persistency in the aquatic environments. The presence of these
xenobiotic compounds can come to generate a series of adverse effects in aquatic
organisms, such as acute and chronic. The aim of this study was to determine the acute
toxicity of sodium diclofenac and paracetamol in the Ceriodaphnia silvestrii in
laboratorial conditions. In order to do so, jars containing organisms were separately
exposed to six different concentrations (3.12; 6.25; 12.5; 25; 50 and 100 g.mL-1) of
each compound, sodium diclofenac and paracetamol, including a control concentration
kept in cultivation medium for each one of this compounds. The tests were run in the
dark, in controlled temperature ((25 0C) and 48 hours duration, being the LC50-48h
calculated using the program Trimmed Spearman-Karber. The diclofenac and
paracetamol compounds LC50-48h were 25 and 41.88 g.mL-1, respectively. These
results point to the risks of pharmacs presence in aquatic environments and the
monitoring environmental agencies needs in overseeing the levels of these compounds
that are disposed in the sewerage systems effluents at big urban areas.

RESUMO Os frmacos representam um grupo de contaminantes ambientais

emergentes com elevada persistncia nos ambientes aquticos. A presena destes
compostos xenobiticos pode gerar uma srie de efeitos adversos em organismos
aquticos, como agudos e crnicos. O objetivo desse estudo foi determinar a toxicidade
aguda dos frmacos diclofenaco de sdio e paracetamol em Ceriodaphnia silvestrii em

condies de laboratrio. Para tanto, lotes, contendo organismos, foram separadamente

expostos a seis diferentes concentraes (3,12; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 g.mL-1) de
cada um dos compostos, diclofenaco de sdio e paracetamol, incluindo uma
concentrao controle mantida em meio de cultivo para cada um destes compostos. Os
testes foram realizados no escuro, com temperatura controlada (25 0C) e durao de 48
horas, sendo calculada a CL50-48h utilizando o programa Trimmed Spearman-Karber.
As CL50-48h dos compostos diclofenaco e paracetamol foram 25 e 41,88 g.mL-1,
respectivamente. Esses resultados apontam para os riscos da presena dos frmacos nos
ambientes aquticos e para as necessidades dos rgos de monitoramento ambiental na
fiscalizao dos nveis desses compostos descartados nos efluentes de esgotos sanitrios
nos grandes centros urbanos.

INTRODUO
A evoluo humana trouxe, de maneira direta e indireta, uma enorme gama de
agentes poluentes aos cursos naturais de gua, inclusive parcela subterrnea do meio.
Dentre essa gama de poluentes os frmacos representam uma linha de contaminantes
ambientais. Estes compostos designam qualquer droga que seja utilizada com fim
medicinal e so desenvolvidos para persistirem no meio mantendo suas propriedades
qumicas, que, se usadas irregularmente, podem causar a contaminao das guas doces.
Resduos de frmacos tm sido encontrados em diversas matrizes (Hilton e
Thomas, 2003; Castiglioni et al., 2004) e as fontes de contaminao da gua por
frmacos, sejam eles de consumo humano ou animal, so inmeras (Suchara, 2007). A
mais significante rota de entrada de frmacos no ambiente aqutico atravs de
estaes de tratamento de esgoto (Bound e Voulvoulis, 2004).

Um ponto crtico na avaliao do impacto ambiental de frmacos em ambiente

aqutico saber se existe um nvel elevado dessas substncias e se estes so suficientes
para exercer efeitos adversos nos seres vivos. Segundo Suchara (2007), a presena de
frmacos residuais no meio ambiente pode apresentar efeitos adversos em organismos
aquticos e terrestres, ocorrendo em qualquer nvel da hierarquia biolgica, tais como
clula, rgo, organismo, populao e ecossistema.
Em termos de peculiaridade, esses grupos de compostos possuem uma srie de
agravantes, em razo de sua elevada persistncia no meio aqutico. Mesmo aqueles que
possuem meia-vida curta so passveis de causar exposies crnicas devido a sua
introduo continua no ambiente. Mesmo se a concentrao de alguns frmacos
encontrados no ambiente for baixa, a combinao deles pode ter efeitos pronunciados
devido ao mecanismo de ao sinrgica (Reis Filho et al., 2007).
A avaliao ecotoxicolgica aguda tem como objetivo identificar a variabilidade
das respostas aos agentes entre as diferentes espcies, indicar a toxicidade comparativa
e detectar contaminaes agudas. No Brasil, os testes de toxicidade aguda vm sendo
empregados no monitoramento de efluentes industriais com o intuito de minimizar o
impacto ambiental, avaliar a eficincia das estaes de tratamento, bem como avaliar os
requisitos para a obteno e manuteno de licenas junto aos rgos ambientais de
alguns estados (Magalhes e Ferro-Filho, 2008).
A avaliao dos efeitos sobre os componentes biolgicos, por meio do
biomonitoramento e testes de toxicidade, representa uma forma mais efetiva para
predizer ou detectar impactos diversos, pois enquanto as anlises qumicas identificam e
quantificam alguns dos poluentes presentes, os bioensaios avaliam o efeito global destes
sobre os sistemas biticos, medindo a capacidade que os compostos qumicos tm de

interferir nas vias bioqumicas celulares, causando-lhes efeitos adversos (Costa e

Espndola, 2000).
Nesse contexto o biomonitoramento e a ecotoxicologia tornam-se teis no
estudo dos efeitos causados pelos frmacos no ambiente, bem como no monitoramento
de corpos d gua. Considerando estes aspectos, o objetivo deste estudo foi de
determinar a toxicidade aguda dos frmacos diclofenaco e paracetamol no
microcrustceo Ceriodaphnia silvestrii.

METODOLOGIA
Testes ecotoxicolgicos agudos
Todos os bioensaios ecotoxicolgicos com o microcrustceo Ceriodaphnia silvestrii
foram realizados no Laboratrio de Saneamento da Faculdade de Engenharia da UNESP,
Campus de Ilha Solteira. Neste trabalho foram realizados dois testes de toxicidade aguda em
Ceriodaphnia silvestrii, um com o frmaco diclofenaco de sdio e outro com paracetamol.
Para os testes agudos, foram preparadas solues estoque de diclofenaco de sdio e
paracetamol com concentrao de 100 g.mL-1. Os organismos-teste foram expostos a seis
concentraes crescentes de 3,12; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 g.mL-1, alm do controle
mantido com meio de cultivo. Para cada concentrao testada foram utilizados cinco
organismos (neonatos entre 6 a 24 horas de vida) com quatro rplicas, em frascos de 30 mL.
Paralelamente aos testes das amostras, foi realizado o controle, visando observar a
sobrevivncia dos organismos nas condies de teste. A durao dos testes foi de 48 horas,
efetuando-se a contagem dos organismos mortos aps esse perodo. Os organismos foram
mantidos no escuro, sem alimentao, temperatura variando entre 23 e 27 0C. Medidas de
pH, dureza, condutividade e temperatura foram tomadas no incio e final dos testes. Como
critrio de mortalidade, foi utilizada a imobilidade dos neonatos durante aproximadamente
4

10 segundos. Para o clculo estatstico da CL50-48h foi usado o programa Trimmed

Spearman-Karber (Hamilton et al., 1977).
Manuteno dos organismos testes
Os exemplares de C. silvestrii para o cultivo foram provenientes da cultura-estoque
mantida no Laboratrio de Saneamento da FEIS UNESP. Para o cultivo de Ceriodaphnia
silvestrii foram utilizados bqueres contendo 2 litros de gua de manuteno e 60
organismos de mesma idade, sendo as culturas mantidas em incubadora com controle de
temperatura (25 2oC) e luz (12 horas) (ABNT, 2005). Como alimento para a Ceriodaphnia
silvestrii, foi utilizada a alga Pseudokirchneriella subcapitata (Selenastrum capricornutum),
na concentrao de 105 clulas/mL, fornecida diariamente. As trocas de gua foram
realizadas periodicamente (trs vezes por semana), separando-se as fmeas adultas ovadas,
descartando-se os organismos jovens (neonatos).

Teste de sensibilidade
Para o controle das condies fisiolgicas de clones de espcies utilizadas em
ensaios de toxicidade foram realizados testes de sensibilidade com uma substncia de
referncia, o cloreto de sdio (10 g.L-1), com concentraes variando entre 0,3; 0,6; 1,0; 1,3;
1,6; 2,2 g.L-1. Durante a realizao desses testes, para cada tratamento, foram utilizados 10
mL da soluo com 5 organismos, em rplica, totalizando 4 rplicas (ABNT, 2003). Os
resultados foram expressos em porcentagem de organismos imveis, utilizando-se o
programa computacional Trimmed Sperman-Karber de Hamilton et al. (1977) para
encontrar a faixa de sensibilidade dos organismos testados.

RESULTADOS E DISCUSSO

Os testes de sensibilidade com cloreto de sdio (NaCl), tiveram a finalidade de

acompanhar a sensibilidade do bioindicador (Ceriodaphnia silvestrii) sendo os
resultados apresentados na Tabela 1, onde os valores encontrados variaram entre 1,22 e
1,52 g.L-1, sendo, portando, a concentrao letal, de 1,36 g.L-1. O pH final das
concentraes variaram em torno de 7 e a dureza em torno 46 mg CaCO3.L-1.

Tabela 1: Testes de sensibilidade com Ceriodaphnia silvestrii utilizando NaCl.

Mdia e desvio padro dos valores da CL50- 48h para NaCl (g.L-1)
Organismo-teste

Ceriodaphnia silvestrii

CL 50

1,36

Desvio padro
Intervalo de confiana de
95% (1,22 1,52)

Segundo Rodgher e Rocha (2005), os valores de 0,75 a 1,43 g.L-1 foram os

valores encontrados aps a realizao de vrios testes para a determinao da CL50.
Oliveira Neto e Botta-Paschoal (2000) determinaram faixas de sensibilidade entre 1,41 e
1,67 g.L-1 para Ceriodaphnia silvestrii. Os valores encontrados nesse trabalho para a
sensibilidade com NaCl so semelhantes aos valores dos trabalhos citados acima,
portanto, comprovam a faixa de sensibilidade de C. silvestrii em relao a esse
composto.
Os resultados dos bioensaios de toxidade aguda com diclofenaco de sdio so
encontrados na Tabela 2, mostrando uma Cl50 para esse frmaco de 25 g.mL-1,
variando entre 21,30 e 29,37 g.mL-1. O pH final das concentraes variaram em torno
de 7,2 e a dureza em torno 32 mg CaCO3.L-1.
Tabela 2: Valores de CL50-48h de Ceriodaphnia silvestrii com diclofenaco de sdio.

Mdia e desvio padro dos valores de CL50-48h para diclofenaco de sdio em g.mL-1
Organismo-teste
Ceriodaphnia silvestrii

CL50
25,0

Desvio padro
Intervalo de confiana de
95% (21,30 29,34)

Os resultados dos bioensaios de toxidade aguda com paracetamol so

encontrados na Tabela 3, mostrando uma CL50 para esse frmaco de 41,88 g.mL-1,
variando entre 29,79 e 58,89 g.mL-1. O pH final das concentraes variaram em torno
de 7,1 e a dureza em torno 50 mg CaCO3.L-1.

Tabela 3: Valores de CL50-48h de Ceriodaphnia silvestrii com paracetamol.

Mdia e desvio padro dos valores de CL50, 48h para paracetamol em g.mL-1
Organismo-teste
Ceriodaphnia silvestrii

CL50
41,88

Desvio padro
Intervalo de confiana de
95% (29,79 a 58,89)

Atualmente, so escassos os estudos no pas que retratem os efeitos dos

frmacos no meio ambiente, de forma semelhante, sobre os efeitos destas substncias
em microcrustceos. Os nveis de toxidade dos frmacos encontrados nesse trabalho
apresentaram concordncia aos reportados na literatura com destaque para Bila e
Dezotti (2003), que detectaram concentraes mdias de diclofenaco entre 0,02 a 0,06
g.L-1 em guas superficiais brasileiras e de paracetamol entre 0,14 e 6 g.L-1 em
efluentes de esgoto. Ternes et al. (1999), tambm reportou a concentrao de 1,2g.L-1
de diclofenaco em gua de rio na Alemanha e Kolpin et al.(2002) detectou um valor
acima de 10 g.L-1 de paracetamol presente em gua de crrego nos Estados Unidos.
At mesmo em efluente de tratamento de esgoto na Sua foi detectada a presena de
7

0,15 a 2,0 g.L-1 de diclofenaco, segundo Tauxe-Wuersch et al. (2005). Portanto, os

resultados encontrados demonstraram os riscos da presena desses compostos aos
componentes da biota aqutica e necessidade de monitoramento mais rgido desses
compostos nos ecossistemas aquticos.

CONCLUSES
A CL50- 48h de C. silvestrii para paracetamol e diclofenaco de sdio foi de 25 e
41,88 g.mL-1, respectivamente;
Os resultados encontrados apontam para o risco dos frmacos aos ambientes
aquticos;
Novos estudos so necessrios na avaliao de outros frmacos sobre
microcrustceos de modo a ampliar o espectro da ecotoxicologia destes compostos
xenobiticos.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

ABNT (2003). Ecotoxicologia aqutica Toxicidade aguda Mtodo de ensaio com

Daphnia spp (Cladocera, Crustacea) NBR 12713, p. 17.

ABNT (2005). Ecotoxicologia aqutica Toxicidade crnica Mtodo de ensaio com

Ceriodaphnia spp (Crustacea ,Cladocera) NBR 13373, p.15.

Bila, D.M. & Dezotti, M. Frmacos no meio ambiente. Qumica Nova, Rio de Janeiro,
v. 26, n. 4, p.523-530, 2003.

Bound, J. P.; Voulvoulis, N. Pharmaceuticals in the aquatic environment- a comparison

of risk assessment strategies. Chemosphere, v. 56, p. 1143-1155, 2004.

Castiglioni, A.; Fanelli, R.; Calamari, D.; Bagnati, R.; Zucatto, E. Methodological
approaches for studying pharmaceuticals in the environment by comparing predicted
and measured concentrations in River Po, Italy. Regulatory
Toxicology and Pharmacology, v.39, p. 25-32, 2004.

Costa, J.B. & Espndola, E.L.G. Avaliao ecotoxicolgica da gua e sedimento em

tributrios do reservatrio de Barra Bonita (Mdio Tiet Superior, SP).

Hamilton, M.A.; Russo, R.C.; Thurston, R.V. Trimmed Spearman-Karber method for
stimating median lethal concentrations in toxicity bioassays. Environmental Science and
Technology, v. 11, p. 714-719, 1977.

Hilton, M. J. & Thomas, K. V. Determination of selected human pharmaceutical

compounds in effluent and surface water samples by high-performance liquid 111
chromatographyelectrospray tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography
A, v. 1015, p. 129141, 2003
Kolpin, D. W.; Furlong, E. T.; Meyer, M. T.; Thurman, E. M.; Zaugg, S. D.; Barber, L.
B.; Buxton, H. T. Pharmaceuticals, Hormones, and Other Organic Wastewater
Contaminants in U.S. Streams, 1999-2000: A National econnaissance. Environmental
Science & Technology, v. 36, n. 6, p. 12021211, 2002.

Magalhes, D.P. & Ferro-Filho, A.S. A ecotoxicologia como ferramenta no

biomonitoramento de ecossistemas aquticos. Oecol. Bras., v. 12, n. 3, p. 355-381, 2008.

Oliveira-Neto, A.L. ; Botta-Paschoal, C.M.R. (2000) Sensibilidade do Cladocera

Planctnico Ceriodaphnia silvestrii (Famlia Daphnidae) aos metais Cdmio, Cromo e
Chumbo. In: Ecotoxicologia: perspectiva para o sculo XXI.

Reis Filho, Ricardo Wagner et al. Farmcos, ETEs e corpos hdricos. Revista Ambente
e gua, Taubat, v. 2, n.3, p.55-61, 2007.

Rodgher, S.; Espndola, E. L. G.; Rocha, O.; Fraccio, R.; Pereira, R. H. G.; Rodrigues,
M. H. S. Limnological and ecotoxicological studies em the cascade of reservoirs in the
Tite river (So Paulo, Brazil). Brazilian Journal of Biology, So Carlos, v.65, n.4,
2005.

Suchara, E. A. Desenvolvimento de metodologias analticas para determinao de

frmacos em fluidos biolgicos e amostras ambientais por cromatografia lquida e
gasosa. 2007. 109 f. Dissertao (Doutorado) - Universidade Federal De Santa Catarina,
Florianpolis, 2007. Cap. 1.

Tauxe-Wuersch, A.; Alencastro, L.F.; Grandjean, D.; Tarradellas, J. Occurrence of

several acidic drugs in sewage treatment plants in Switzerland and risk assessment.
Water Research, v. 39, p. 1761-1772, 2005.

10

Ternes, T. A.; Stumpf, M.; Muller, J.; Haberer, K.; Wilken, R. D.; Servos, M. Behavior
and occurrence of estrogens in municipal sewage treatment plants I. Investigations in
Germany, Canada and Brazil. The Science of the total Environment, v. 225, n. 1/2, p.
81-90, 1999.

11