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QBQ 126 Biologia Molecular

PCR
Sequenciamento de DNA

PCR (Reao em cadeia da polimerase)


Histrico
The PCR method a
copying machine for
DNA molecules
-Tcnica foi criada por Karry Mullis em 1983.
-Prmio Nobel em Qumica em 1993.
-A tcnica explora as caractersticas da
replicao do DNA.
- Objetivo: produzir milhes de cpias de DNA
a partir de quantidades iniciais muito pequenas
de DNA.

109 molculas

1 molcula DNA
30 ciclos
de PCR

PCR (Reao em cadeia da polimerase)


Taq DNA polimerase:

DNA polimerase termicamente estvel


da bactria Thermus aquaticus

Hotsprings at Yellowstone National Park

~700C, temperatura tima da Taq DNA polimerase

PCR (Reao em cadeia da polimerase)


Ciclo de PCR e suas etapas

1-DENATURAO (950C)
2-HIBRIDIZAO DOS PRIMERS (550C)

3-EXTENSO (720C)

PCR (Reao em cadeia da polimerase)

-Primers: ~18-20 nucleotdeos


-Regio amplificada: em geral 50-2000 pb, mas
pode ser maior

-Duas caractersticas importantes da PCR:


sensibilidade e especificidade

PCR (Reao em cadeia da polimerase)

PCR (Reao em cadeia da polimerase)

PCR em tempo real quantitativa (qPCR)

PCR (Reao em cadeia da polimerase)


Aplicaes
Mdica- testes genticos para identificao de
doenas, diagnsticos de doenas infecciosas,
estudos de mutaes, teste pr-natal etc.
Anlise Fornsica
Teste de Paternidade

Pesquisa bsica e aplicada- clonagem e


amplificao do DNA, anlise da expresso
gnica etc.

PCR (Reao em cadeia da polimerase)


Aplicaes
Uso da PCR para se clonar um gene ou cDNA
RT-PCR

PCR (Reao em cadeia da polimerase)


Aplicaes
Anlise de sequncia microsatlite hipervarivel
ou VNTR (nmero varivel de repeties
in tandem)

PCR (Reao em cadeia da polimerase)


Aplicaes
Anlise de sequncia microsatlite hipervarivel
ou VNTR (nmero varivel de repeties
in tandem)

PCR (Reao em cadeia da polimerase)


Aplicaes
Anlise fornsica

SEQUENCIAMENTO DE DNA

No final da dcada de 70 dois mtodos de sequenciamento de


DNA foram desenvolvidos:

Gilbert
Sequenciamento qumico

Sanger
Sequenciamento enzimtico

Mtodo de Sanger ou de terminao de cadeia com


didesoxirribonucleosdeos trifosfato (ddNTPs)

Mtodo de Sanger ou de terminao de cadeia com


didesoxirribonucleosdeos trifosfato (ddNTPs)

Mtodo de Sanger ou de terminao de cadeia com


didesoxirribonucleosdeos trifosfato (ddNTPs)

(Mtodo manual)

Mtodo de Sanger ou de terminao de cadeia com


didesoxirribonucleosdeos trifosfato (ddNTPs)

(Mtodo automtico)

Mtodo de Sanger ou de terminao de cadeia com


didesoxirribonucleosdeos trifosfato (ddNTPs)

(Mtodo automtico)

Eletroforese
em capilar

Sequenciamento de Genomas

Marcos no sequenciamento genmico

O genoma humano

Variaes na sequncia genmica entre indivduos


SNPs
(Single Nucleotide Polymorphisms)

CNVs:
(Copy Number Variation)
Quando o nmero de cpias de um
determinado gene varia de um
indivduo para outro.

Variaes na sequncia genmica entre indivduos


Anemia falciforme: exemplo onde SNPs causa alterao na
sequncia de aminocidos

Novas tcnicas de sequenciamento de DNA permitem


o sequenciamento de milhes de pares de bases em
uma nica corrida
Sequenciamento
automtico de DNA
Sequenciamento
de nova gerao

Sequencing centers producing the Sanger sequence


data for mammalian genome projects are factory-like
outfits with a large number of personnel.
Maria Nemenuk, Broad Institute

The latest next-generation sequencing instruments


can generate as much data in 24 h as several
hundred Sanger-type DNA capillary sequencers,
but are operated by a single person.

Nature Methods - 5, 16 - 18 (2008)

Next generation sequencing


(sequenciamento de nova gerao)

-Sequenciamento automtico de Sanger (1 gerao).


-Tecnologias desenvolvidas aps esta so conhecidas como
sequenciamento de nova gerao.
Plataformas mais comuns:
454 (Roche)
SOLiD (Applied Byosysthems)
Solexa (Illumina)

Bioinformtica!!

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