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Resumen
La prueba de deteccin de enzimas bacteriana o medicin del tiempo de
decoloracin del azul de metileno en leche se basa en que cuando se aade una
pequea cantidad de azul de metileno a la leche y la mezcla se incuba a 37C, se
produce una decoloracin debida al metabolismo bacteriano. La velocidad a la que
se produce el cambio de color es directamente proporcional al nmero de
grmenes presentes. De esta manera se puede determinar de manera indirecta la
calidad higinica de la leche. En este artculo se describe el fundamento de la
determinacin de la prueba de la Reductasa, peroxidasa y fosfatasa bacteriana en
leche. Tambin se explica cmo interpretar los resultados en trminos de
crecimiento microbiano y calidad higinica de la leche.(1)
Introduccin
Marco terico
L
leche
contiene
numerosas
enzimas relacionadas con el grupo de
las albuminas, con las cuales
generalmente precipitan. Algunas se
encuentran concentradas en la
membrana superficial de los glbulos
grasos y son arrastradas por la nata
( reductasa aldehidica y fosfatasa)
otras precipitan con la casena a pH
otras sean secretadas por el tejido
glandular mamario. (2)
REDUCTASA
La mayora de los grmenes de la
leche cuando se multiplican elaboran
enzimas reductasas que modifican el
potencial de xido-reduccin de la
misma.
Para
demostrar
ese
fenmeno basta aadir a la leche una
sustancia que se decolore al pasar de
la forma oxidada a la forma reducida.
La rapidez con que cambia de color
est en funcin de la poblacin
bacteriana y, por ello, puede ser un
ndice del grado de contaminacin de
la leche. El colorante ms empleado
en la industria lctea para realizar
esta prueba es el azul de metileno,
pero tambin se pueden utilizar la
resazurina y el cloruro de 2, 3, 5,
trifenil-tetrazolium, ya que son
colorantes fcilmente absorbibles por
las clulas vivas y se decoloran a una
velocidad proporcional a la actividad
de las reductasas microbianas.(1)
La presencia de microorganismos en
la leche y por su accin reductora, se
produce una modificacin del color
del azul de metileno, pasando de
color azul intenso a azul claro,
pudiendo desaparece totalmente de
acuerdo a la carga microbiana
presente. Una leche con un contenido
bajo en microorganismos, no modifica
el tinte azul del colorante o tarda
mucho tiempo en modificarlo.
Se pueden calcular aproximadamente
los resultados de la prueba del azul
de metileno segn la Tabla 1.
FOSFATASA
La fosfatasa es una enzima
normalmente presente en la leche
cruda. En las condiciones ordinarias
de pasteurizacin (lenta, rpida o
ultrarpida) la enzima se inactiva. Se
ha demostrado que esta enzima es
ms difcil de destruir que la mayora
de
los organimos patognicos
termoresistentes que pudieran estar
presentes en la la leche, como por
ejemplo el bacilo tuberculoso.
La prueba es de gran utilidad para
decidir si la leche ha sido o no
pasteurizada, si la leche pasteurizada
se ha mezclado con leche cruda, o
incluso su la pasteurizacin ha sido
deficiente.
Este mtodo se basa en la hidrlisis
del fenil fosfato que en presencia de
la fosfatasa de la leche libera fenol;
este se determina colorimtricamente
hacindolo reaccionar con 2.6
dibromoquinonclorimida obtenindose
un color azul. (2).
PEROXIDASA
La peroxidasa es una enzima que
cataliza la oxidacin de ciertos
Materiales y mtodos
Fotografa 2
Determinacin peroxidasa
Antes de iniciar el procedimiento la
leche se debe mezclar bien, estar a
una temperatura entre 20 y 30C y no
estar acidificada.
1. Medir en 1 tubo de ensayo 3ml
de leche. Agregar 10 gotas de
Guayacol
2. Agitar y esperar 1 minuto.
Observar el color.
3. Agregar 5 gotas de peroxido
de
hidrogeno
(
agua
oxigenada)
4. Observar el color.
Interpretacin:
Fotografa 1.
Fotografa 4
Fotografa 3
Resultados
TRAM
PEROXIDASA
Fotografa 5
Fotografa 6.
Tabla 1
Grup
o
Muestra
TRAM
Leche cruda
Suba
Leche cruda
Suba
Leche UHT
Alpina
Leche cantina
Usme
Leche cantina
Usme
Leche cantina
Suba
30 min
NEGATIVA
60 min
30 min
NEGATIVA
60 min
NEGATIVA
30 min POSITIVA
60 min POSITIVA
30 min POSITIVA
60 min POSITIVA
30 min POSITIVA
60 min POSITIVA
30 min
NEGATIVA
60 min POSITIVA
4
5
6
Discusin
Fosfatas
a
alcalina
POSITIV
A
Peroxida
sa
POSITIV
O
NEGATIV POSITIV
A
O
NEGATIV
A
NEGATIV
A
NEGATIV
A
POSITIV
A
NEGATIV
A
POSITIV
O
NEGATIV
O
POSITIV
O
Referencias
1. Garca Martnez, Eva. Fuentes
Lpez, Ana , Fernndez
Segovia, Isabel. Determinacin
de la calidad higinica de la
leche mediante la medicin
indirecta
del
tiempo
de
reduccin del azul de metileno
o prueba de la reductasa
microbiana. Disponible en
https://riunet.upv.es/bitstream/h
andle/10251/38380/Eva
%20Garc%C3%ADa.
%20Calidad%20leche2014.pdf?sequence=1.
Consulta el 13 de septiembre
del 2015.
2. cH ALAIS CIENCIA DE LA
LECHE, principios de tcnica