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24 DE ABRIL DE 2015

CULTURAS CELULARES
BIOLOGIA E BIOQUMICA
TRABALHO REALIZADO POR:
CTIA FERREIRA, N 9130336
FILIPA SILVA, N 9130338
HELENA ALVES, N 9130341

Biologia e Bioqumica

Contedo
1 Introduo ............................................................................................................................... 2
2 Materiais Utilizados ................................................................................................................. 4
3 Procedimento Experimental.................................................................................................... 5
4 Procedimento Prtico .............................................................................................................. 7
5 Tratamento de Dados .............................................................................................................. 8
6 Concluso .............................................................................................................................. 10
7 Bibliografia............................................................................................................................. 11

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Biologia e Bioqumica

1 Introduo
No mbito da unidade curricular de Biologia e Bioqumica foi-nos proposto a elaborao
de um trabalho experimental, cujo tema Culturas Celulares.
As clulas vegetais e animais podem prolongar o seu crescimento in vitro, quando
isoladas de tecidos vivos, se os nutrientes e todos os outros fatores necessrios sua
sobrevivncia, crescimento e proliferao forem corretamente fornecidos. Quando este
processo realizado em laboratrio, em condies controlada de temperatura, humidade,
oxignio e dixido de carbono, este denominado por cultura celular.
A cultura de clulas permite que as mesmas funcionem como unidades independentes,
estas so capazes de crescer e se dividir normalmente, de forma similar a quando esto a crescer
in vivo, isto se os nutrientes necessrios forem fornecidos ao meio de cultura e possuem
crescimento ilimitado at que um dos suplementos essenciais se esgote.
O meio de cultura um lquido onde as clulas crescem e multiplicam-se, possuindo na
sua composio sais inorgnicos, aminocidos essenciais e no essenciais, vitaminas,
antibiticos, uma fonte de energia, como a glicose, e um indicador de pH.
Dependendo do tecido de origem, numa cultura celular, as clulas podem crescer tanto
suspensas no meio de cultura, quando aderem formando monocamadas no fundo da garrafa
em que so cultivadas. As clulas em suspenso derivam de linhagens que originalmente no
necessitam de adeso ao substrato para proliferao. As clulas aderidas necessitam de ligar-se
ao substrato para se dividir e crescer, sendo esta ligao essencial porque as clulas perdem a
ancoragem ao substrato, elas param de proliferar e morrem.
As culturas celulares podem ser de trs tipos:

Primrias, so produzidas a partir de clulas retiradas de um tecido por processos de


desagregao por mtodos mecnicos, enzimticos ou qumicos. As culturas primrias
so portanto formadas a partir clulas que sobrevivem aos processos de desagregao,
aderem-se ao substrato da garrafa de cultura, ou mantm-se em suspenso, e
proliferam. As clulas primrias possuem morfologia idntica ao do tecido das quais se
originam. A cultura primria permite pouco nmero de divises celulares, aps as quais
entram em estado de senescncia e morrem;
Finitas, so formadas aps a primeira passagem de uma cultura primria. Estas culturas
iro proliferar por um nmero finito de divises celulares, aps as quais iro morrer. O
potencial proliferativo de algumas culturas finitas pode ser prolongado atravs da
introduo de genes virais transformantes.
Contnuas, este tipo de culturas iro fatalmente morrer ou eventualmente adquirir uma
mutao estvel capaz de produzir uma cultura contnua. Esta mutao sofrida pelas
clulas conhecida como transformao ou imortalizao.

Existe um grande nmero de aplicao para clulas animais ou vegetais cultivadas, de entre
eles:

Estudos fisiolgicos e bioqumicos de clulas normais ou tumorais;


Estudos dos efeitos de compostos qumicos ou drogas variadas sobre tipos especficos
de clula;
Estudos para a gerao de tecidos artificiais;
Sntese de produtos biolgicos a partir de culturas celulares em larga escala;

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Biologia e Bioqumica

Produo de protenas recombinantes glicosdeas, as quais no podem ser produzidas


por bactrias, uma vez que estas no possuem metabolismo necessrio.

Para que haja uma manuteno do equilbrio do meio celular necessrio colocar as linhas
celulares numa incubadora a uma temperatura de 37C e uma atmosfera de 5% de CO2. Os
meios celulares de cultura so o que mais varia entre as linhas celulares. O que pode variar o
pH, os fatores de crescimento, concentrao de glicose e a presena ou ausncia de outros
nutrientes.
O fator de crescimento mais utilizado para a suplementao dos meios de cultura o Soro
Fetal Bovino (FBS). Para alm disso, necessrio adicionar um antibitico e um fungicida.
Uma cultura de clulas necessita de estar livre de contaminaes. A taxa de multiplicao
de clulas animais relativamente baixa, comparada com clulas bacterianas. Enquanto as
bactrias podem-se duplicar a cada 30 minutos, as clulas animais requerem 18 a 24 horas. Isto
torna as culturas de clulas animais mais vulnerveis contaminao uma vez que um pequeno
nmero de bactrias introduzido na garrafa de cultura pode crescer rapidamente em uma
populao de clulas normal. Para evitar a introduo de microrganismos na cultura, vrios
cuidados bsicos de manipulao e preveno devem ser tomados. Todo o trabalho da cultura
de clulas deve ser realizado em um fluxo laminar inspecionado e em bom estado de
funcionamento. Antes do procedimento, a luz ultravioleta que fica dentro do fluxo laminar deve
ser ligada e mantida por, no mnimo, 30 minutos e de preferncia, com os materiais a serem
expostos a ela. Todo o material utilizado deve ser desinfetado com agentes prprios. Todos os
equipamentos e materiais utilizados na cultura celular devem ser esterilizados. obrigatrio o
uso de luvas e a cada vez que so retiradas as mos do espao interno do fluxo, devem lavar-se
com lcool de 70%. O uso de fogo dentro do fluxo tambm pode minimizar a ocorrncia de
contaminao. Utilizando estes cuidados fundamentais, possvel evitar a contaminao do
meio de cultura com microrganismos nocivos.

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Biologia e Bioqumica

2 Materiais Utilizados
Equipamentos
Cmara de fluxo de ar laminar
Incubadora CO2 a 37C
Centrifugadora
Microscpio de contraste de fase/invertido
Pipetador automtico
Micropipetas ou pipetas automticas
Contador automtico ou Camara de Newbauer
Banho-maria

Reagentes
Meio de cultura (500mL)
Glutamina
FBS
Antibiticos (Penstrep)
Fungicidas Fungizona (1%)
lcool 70%
PBS (tampo fosfato)
RKO
Tripsina
Azul Tripano
Consumveis
Frascos de cultura (27 cm2/75cm2)
Tubos de falcon (15mL e 50mL)
Pipetas graduadas de plstico e degradveis
Pipetas Pasteur descartveis
Eppendorfeis
Criotubos de DNSO

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Biologia e Bioqumica

3 Procedimento Experimental
A Inicio da Cultura
1- Retirar o meio de cultura do frigorfico e coloc-lo na estufa/banho a 37 cerca de 40
minutos antes de iniciar a cultura.
2- Marcar um tubo Falcon de 15 mL com a sigla da linha celular.
3- Colocar 4 mL de meio de cultura no Falcon.
4- Retirar a alquota da linha celular da arca a -80C.
5- Com uma pipeta de Pasteur adicionar meio de cultura ao criotubo com a alquota
congelada, homogeneizar e passar para o Falcon.
6- Repetir o passo anterior as vezes necessrias para que o criotubo fique vazio (este passo
deve ser feito o mais rapidamente possvel dado que o DMSO txico acima de 4C).
7- Centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos.
8- Marcar 1 frasco de cultura de 25 mL com nome da linha, meio de cultura utilizado, data e
o nome do grupo e colocar 4 mL de meio no frasco de cultura.
9- Aps centrifugao rejeitar o sobrenadante.
10- Colocar 1 mL de meio de cultura no Falcon para ressuspender o pellet (deixar o meio
escorrer pelas paredes).
11- Colocar o meio com as clulas no frasco de cultura.
12- Espalhar o meio homogeneamente pelo fundo da caixa.
13- Colocar o frasco de cultura na estufa a 37C com 5% de CO2.
B Mudar o Meio de Cultura
1 - Retirar o meio de cultura do frigorfico e coloc-lo na estufa a 37 cerca de 40 minutos
antes de iniciar o procedimento.
Se as clulas ainda estiverem em suspenso:

Se as clulas estiverem aderentes:

1- Marcar um tubo Falcon de 15 mL com a


sigla da linha celular.

1- Inclinar o frasco de cultura para que o


meio se concentre num dos cantos inferiores
da caixa.
2- Com uma pipeta de Pasteur recolher o
meio de cultura e rejeitar no lixo.

2- Inclinar o frasco de cultura para que o


meio se concentre num dos cantos inferiores
da caixa.
3- Com uma pipeta de Pasteur recolher o
meio de cultura e coloc-lo no Falcon.
4- Centrifugar a 1200 rpm durante 5
minutos.
5- Colocar 4 a 6 mL de meio num novo frasco
de cultura.
6- Aps centrifugao, rejeitar o
sobrenadante e ressuspender o pellet em
1mL de meio de cultura.
7- Colocar o meio com as clulas no frasco
de cultura previamente identificado.
8- Espalhar o meio homogeneamente pelo
fundo da caixa.
9- Colocar a caixa de cultura na estufa a 37C
com 5% de CO2.

3- Colocar novo meio no frasco de cultura.


4- Espalhar o meio homogeneamente pelo
fundo do frasco.
5- Colocar o frasco de cultura na estufa a
37C com 5% de CO2.

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Biologia e Bioqumica
C Dividir a Cultura
1- Retirar o meio de cultura e a tripsina do frigorfico e coloc-los na estufa a 37 cerca de 40
minutos antes de iniciar o procedimento.
2- Retirar o meio do frasco de cultura e rejeit-lo no lixo.
3- Colocar 2 mL de tripsina no frasco de cultura e coloc-lo na estufa durante 5-6 minutos,
at as clulas se soltarem todas do fundo do frasco. Verificar ao microscpio.
4- Marcar um tubo Falcon de 15 mL com as indicaes referentes linha celular.
5- Colocar 4 mL de meio de cultura no frasco de cultura para neutralizar a tripsina e ir
passando as clulas para o Falcon (at o frasco ficar completamente vazio e limpo de
clulas).
6- Centrifugar 5 minutos a 1200 rpm.
7- Colocar 4 mL de meio no frasco de cultura.
8- Rejeitar o sobrenadante aps centrifugao.
9- Colocar 1 mL de meio de cultura no Falcon para ressuspender o pellet (deixar o meio
escorrer pelas paredes).
10- Colocar o meio com as clulas no frasco de cultura.
11- Espalhar o meio homogeneamente pelo fundo da caixa.
12- Colocar o frasco de cultura na estufa a 37C com 5% de CO2.

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Biologia e Bioqumica

4 Procedimento Prtico
1- Retirar o meio de cultura e a tripsina do frigorfico e coloc-los na estufa a 37 cerca de 40
minutos antes de iniciar o procedimento.
2- Retirar o meio do frasco de cultura e rejeit-lo no lixo.
3- Colocar 2 ml de tripsina no frasco de cultura e coloc-lo na estufa durante 5-6 minutos,
at as clulas se soltarem todas do fundo do frasco. Verificar ao microscpio.
4- Marcar um tubo Falcon de 15 ml com as indicaes referentes linha celular.
5- Colocar 4 ml de meio de cultura no frasco de cultura para neutralizar a tripsina e ir
passando as clulas para o Falcon (at o frasco ficar completamente vazio e limpo de
clulas).
6- Centrifugar 5 minutos a 1200 rpm.
7- Rejeitar o sobrenadante aps centrifugao e ressuspender o pellet em 4 ml de meio de
cultura.
8- Num eppendorf preparar a soluo de Azul tripano e clulas. Efetuar uma diluio das
clulas de 1/5 num volume final de 250 L. O Azul tripano deve estar a no volume final.
a. 50 L de clulas
b. 125 L de Azul tripano
c. 75 L de meio de cultura
9- Prepare a cmara de Neubauer: humedea os lados esmerilados com a soluo que vai
fixar a lamela, e coloque a lamela.
10- Toque com a pipeta que contm a suspenso de clulas num dos lados da cmara, junto
lamela. Deixe sair a quantidade estritamente necessria para preencher por difuso o
espao de contagem, mas no deixe sair soluo em excesso para no inutilizar a contagem.
11- Deixe repousar a cmara no mnimo durante 3 minutos.
12- Conte as clulas usando o microscpio.
13- Calcule a concentrao de clulas na suspenso fornecida (nmero de clulas contadas
por unidade de volume, ml ou mm3 clulas que corarem de azul estaro mortas.
14- Apresente os clculos efetuados. Se necessitou de efetuar diluies no se esquea de
entrar com o seu valor nos clculos.

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Biologia e Bioqumica

5 Tratamento de Dados

Ao efetuar a contagem das clulas consideramos que contam as clulas que se


encontram no interior do quadrado mais pequeno e nos limites superior e lateral esquerdo.
N de clulas
Contagem 1
Contagem 2

Quadrado 1
8
7

Quadrado 2
15
14

Total de clulas
Mdia de Clulas Total
Volume de cada Quadrado

Quadrado 3
9
9

Quadrado 4
7
17

Quadrado 5
8
16

110
11
4x10-6 ml

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Biologia e Bioqumica

(2) ()
= 5.5 106 /

11
<=>
2
3
4 106

Clculo do Volume Inicial


= <=> 11.3 106 = 1 106 4 <=>
= 0.35398 = 35

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Biologia e Bioqumica

6 Concluso
A atividade experimental realizada teve como objetivos a execuo de culturas
celulares, a sua posterior manipulao, e a quantificao celular e deliberar a viabilidade celular.
A viabilidade celular delimita a quantidade de clulas que se encontram vivas ou mortas
numa amostra total de clulas. uma medida direta com o nmero de clulas saudveis de uma
amostra.
O Azul Tripano um corante vital, cuja reatividade baseada no facto de este ser
carregado negativamente e no interagir com a clula, a menos que a membrana esteja
danificada. Em suma, todas as clulas que excluem o corante so viveis.
Ao longo da atividade podemos concluir que as clulas observadas ao microscpio
encontravam-se num nmero razovel sendo que poucas estavam coradas com o Azul Tripano.
No processo de contagem de clulas s foram contabilizadas as clulas que no estavam
coradas com o corante utilizado porque as que estavam coradas eram mortas, logo no eram
viveis.
Em suma, podemos concluir que a nossa atividade foi bem-sucedida pois o nmero de
clulas mortas era reduzido e as clulas estavam a crescer de forma saudvel.

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Biologia e Bioqumica

7 Bibliografia

Manual de protocolos prticos de apoio s aulas da componente Biologia.


Martins, M. R. 2013.

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