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[ESCRIBIR

EL NOMBRE
DE LA
COMPAA]

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO
IONICO

Integrantes: | lvarez - Costanzo - Diaz Zegarra -Gerez- HollmanHurtado- Lucero- Macuso- Ruggieri- Strack

INTRODUCCIN.
La cromatografa de intercambio inico es un mtodo que permite la separacin de molculas
basada en sus propiedades de carga elctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria o
intercambiador inico, y la fase mvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la superficie cargas
electrostticas fijas, que retienen contraiones mviles que pueden intercambiarse por iones de la
fase mvil, la cual suele ser una disolucin acuosa con cantidades moderadas de metanol u otro
disolvente orgnico miscible con agua que contiene especies inicas generalmente en forma de
buffer. Los iones de sta compiten con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria.
FUNDAMENTO
El principio bsico de la cromatografa de intercambio inico es que las molculas cargadas se
adhieren a los intercambiadores de forma reversible de modo que dichas molculas pueden ser
asociadas o disociadas cambiando el ambiente inico. La separacin mediante intercambiadores
inicos se realiza por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al
intercambiador utilizando condiciones que originan una unin fuerte y estable; a continuacin, se
eluye de la columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza inica, compitiendo los
componentes del buffer con el material por los sitios de unin.
+

R A es un intercambiador aninico en la forma A y B representa a los aniones en la disolucin.

PROPIEDADES DE LOS INTERCAMBIADORES INICOS

Un intercambiador inico es, por lo general, un polmero que tiene grupos cargados unidos. La
mayora de las protenas son estables dentro de un margen de pH determinado (es decir, hay un
margen en el que no se desnaturalizan), en el que estn cargadas positiva o negativamente. Por lo
tanto si una protena es estable a valores de pH por encima del punto isoelctrico, se debe utilizar
un intercambiador anicnico. Si es estable a valores de pH situados por debajo del punto
isoelctrico, debe utilizarse un intercambiador catonice.
INTERCAMBIADORES ANINICOS: Son portadores de grupos con cargas positivas que unen
aniones de forma reversible. Si el grupo cargado es positivo, es un intercambiador de aniones. Los
intercambiadores dbilmente bsicos ms corrientes son los grupos aminos alifticos o aromticos.
INTERCAMBIADOR CATINICO: Los intercambiadores catnicos son portadores de grupos con
carga negativa que unen cationes de modo reversible. Un grupo tpico que se utiliza en los
intercambiadores de cationes es el grupo sulfnico, SO-3. Si se une un H+ al grupo, se dice que el
intercambiador se encuentra en forma cida y puede, por ejemplo, intercambiar un H+ por un Na+
o dos H+ por un Ca+2. El grupo cido sulfnico es un intercambiador de cationes fuertemente
cido. Otros grupos de utilizacin corriente son el carbonilo e hidroxilo fenlico, dos
intercambiadores catinicos dbilmente cidos.

Los polianiones y policationes se unen a los intercambiadores de aniones y de cationes. Sin


embargo, las protenas y los polielectrolitos (polmeros poliionicos) que son portadores de cargas
positivas y negativas pueden unirse tanto a los cambiadores de cationes como a los de aniones,
dependiendo de su carga neta. La afinidad con la que un polielectrolito concreto se une a un
cambiador ionico determinado depende de las identidades y de las concentraciones de los dems
iones presentes en la disolucin, debido a la competencia entre los diversos iones por los sitios de
unin sobre el intercambiador inico. Las afinidades de unin de los polielectrolitos portadores de
grupos cidos-base dependen tambin, en gran medida, del PH ya que sus cargas netas varan
con dicho valor.
La matriz puede estar hecha de diferentes materiales. Los de uso ms corriente son el dextrano, la
celulosa, poliacrilamida, copolmeros del estireno y divinilbenceno, en los que el divinilbenceno
contiene los grupos cargados y se entrecruza con las cadenas de poliestireno. La eleccin entre
intercambiadores fuertes o dbiles est basada en el efecto del pH sobre la carga y la estabilidad.
Por ejemplo, si se va a cromatografa una sustancia dbilmente cida que necesita pH muy altos o
muy bajos para su ionizacin, se requiere un intercambiador fuerte debido que este funciona a pH
extremos. No obstante, si la sustancia es lbil, es preferible la utilizacin de intercambiadores
dbiles. Los intercambiadores dbiles son tambin excelentes para la separacin de molculas con
una carga elevada de aquellas con poca carga, debido a que los iones dbilmente cargados no se
unen, por lo general, al intercambiador. Permiten, asimismo, una mayor resolucin de las
sustancias si las diferencias de carga son muy pequeas.
Para una correcta eleccin de la porosidad y del tamao de la malla es necesario tener en cuenta
que las molculas pequeas se separan mejor sobre matrices con tamao de poro pequeo (o
sea, un elevado grado de entrecruzamientos) debido a que la capacidad disponible es grande,
mientras que las macromolculas necesitan un tamao de poro mayor. Los intercambiadores de
celulosa han probado ser los mejores para la purificacin de molculas grandes como protenas y
polinucletidos. Ello es debido a que la matriz es fibrosa, por lo que todos los grupos funcionales
se encuentran en la superficie y disponibles, incluso, para las molculas mayores.

PROCEDIMIENTO
Esta tcnica est basada en 4 etapas:
1- Equilibrio:
El primer paso es el equilibrio de la fase estacionaria con las condiciones iniciales deseadas.
Cuando el equilibrio se ha logrado, toda la fase estacionaria se encuentra asociada a iones
complementarios (que pueden ser cloro o sodio). Por ejemplo, un intercambiador catinico
+
sulfonado asociado a Na producto de la disociacin de NaOH.
2- Aplicacin y Lavado:
El paso siguiente es sembrar la muestra a la cual queremos filtrar a travs de la columna mediante
un lavado especfico. Para ello es necesario aplicar un buffer con el mismo pH y fuerza inica que
el buffer inicial para que todas las protenas cargadas se unan al intercambiador. Por ejemplo: A la
forma sdica de la resina lavada se le aade una solucin cida (pH=3) de la mezcla de
aminocidos; a dicho pH los aminocidos se encuentran en forma de cationes con carga neta
positiva. Los aminocidos catinicos tienden a desplazar algunos de los iones ligados a las

partculas de resina. A pH 3 los aminocidos ms bsicos se unirn a la resina de forma ms


estrecha que los ms cidos.
3- Elusin:
Las molculas captadas por el intercambiador son eludas debido a cambios en la composicin del buffer. La
elusin puede realizarse de dos formas diferentes; la ms usual consiste en aumentar progresivamente la
concentracin de un contra in, de modo de desplazar el equilibrio de unin de la macromolcula hacia la
forma libre. El contrain es normalmente una sal, disuelta en eluyente (NaCl, KCl, etc).
Las macromolculas de una mezcla se irn desplazando de manera secuencial, de acuerdo a la fuerza de
unin: las que posean menos densidad de carga eluiran antes, mientras que para las de mayor carga neta el
tiempo de retencin ser mayor.
La otra manera es realizar un cambio en el PH del solvente; esta tcnica se emplea con intercambiadores
dbiles. La lgica es que al cambiar el PH, de modo de acercarnos al PI de cada protena, la carga neta de
esta ir disminuyendo y en algn punto dejara de interaccionar con la matriz. Sin embargo, esta tcnica
posee sus desventajas. Dado que es este caso las protenas se eluiran a un PH igual a su PI su solubilidad
estar disminuida y pueden precipitar. Adems, La disminucin del pH protonar a los grupos negativos de
los aminocidos, por lo que su carga neta tender a ser positiva, por lo cual se necesitaran intercambiadores
cationicos ( portadores de grupos con cagas negativas) que van a unir estos cationes de forma reversible; en
contraposicin el aumento del PH provocara una desprotonacin de los grupos positivos de los aminocidos,
por lo cual su carga neta tendera a ser negativa; necesitndose asi intercambiadores anionicos que unan
reversiblemente cargas negativas.
Las diversas fracciones pueden analizarse cuantitativamente mediante la reaccin con ninhidrina. Los
aminocidos aninicos aparecen primero y los ms catinicos aparecen posteriormente (con un
intercambiador catinico).
4- Regeneracin:
Por ltimo, se remueven las partculas que an estn asociadas al intercambiador. Los iones que
se adhieren a los sitios activos de la resina son de muy diferente tipo y pueden ser removidos total
o parcialmente durante el proceso de regeneracin. Una vez agotadas las resinas, se pueden

regenerar a su forma inicial para reanudar la operacin de intercambio. As, el intercambio


inico es un proceso cclico y no continuo. La regeneracin de las resinas se hace segn
reacciones inversas.
Tipos de regenerantes

El cloruro de sodio (NaCl) se emplea normalmente para regenerar las resinas fuertemente cidas
usadas en ablandamiento, y las resinas fuertemente bsicas en la eliminacin de nitratos.
En ablandamiento, el cloruro de potasio (KCl) puede tambin emplearse cuando la presencia de
sodio en la solucin tratada es indeseable.
En ciertos procesos de tratamiento de condensados muy calientes, el cloruro de amonio (NH4Cl)
se puede utilizar tambin.
En la eliminacin de nitratos, la resina fuertemente bsica se puede regenerar con otros
compuestos que producen iones de cloruro, tales como el cido clorhdrico (HCl).

o
o

o
o

En el proceso de descationizacin la primera etapa de una desmineralizacin la resina


fuertemente cida (SAC) se debe regenerar con un cido fuerte. Los regenerantes ms comunes
son el cido clorhdrico y el cido sulfrico.
El cido clorhdrico (HCl) es muy eficaz y no produce precipitados en el lecho de resina.
El cido sulfrico (H2SO4) es ms fcil de transportar y almacenar y a veces ms barato, pero es
menos eficaz que el clorhdrico: la capacidad til de la resina SAC es menor. Adems, su
concentracin se debe ajustar precisamente para impedir la precipitacin de sulfato de calcio en la
resina (detalles abajo). Una vez precipitado en la columna, CaSO4 es muy difcil disolver de nuevo.
El cido ntrico (HNO3) se puede tambin emplear, por lo menos en principio, pero no es
recomendado, porque puede producir reacciones muy exotrmicas, hasta explosiones. Por lo
tanto, hay que considerar el cido ntrico como peligroso.
En descarbonatacin, lo mejor es regenerar la resina dbilmente cida (WAC) con cido
clorhdrico (HCl). El sulfrico se debe aplicar a concentraciones muy bajas (< 0,8%) para que no
precipite sulfato de calcio. La cantidad de agua de dilucin es por lo tanto muy grande. Otros
cidos ms dbiles pueden tambin regenerar resinas WAC, por ejemplo el cido
actico (CH3COOH) o el cido ctrico, una molcula con tres grupos COOH: (CH2COOHC(OH)COOH-CH2COOH = C6H8O7).
En desmineralizacin las resinas fuertemente bsicas se regeneran siempre con sosa
custica (NaOH) aunque la potasa custica (hidrxido de potasio KOH) es otra opcin, pero en
general ms cara.
Las resinas dbilmente bsicas (WBA) se regeneran en general tambin con sosa custica, pero
otras bases ms dbiles se pueden emplear:
Amonaco (NH4OH)
Carbonato de sodio (Na2CO3)

FACTORES QUE AFECTAN LA RETENCIN

Tiempo de retencin (Tr): En la cromatografa de intercambio inico la retencin est


basada en la atraccin entre iones del soluto y la carga complementaria de la fase
estacionaria. Los intercambiadores inicos favorecen la unin de iones de mayor carga y
radio inferior. Cuando la retencin de los compuestos se ve afectada, se favorece la
elusin de ellos para ser recolectados en una serie de fracciones.

pH: Las resinas cidas fuertes siguen ionizadas incluso en disoluciones muy cidas, en
cambio las resinas cidas dbiles se protonan a un pH prximo a 4 y pierden su capacidad
de intercambio catinico, reducindose as, el tiempo de retencin. Los grupos muy
bsicos de amonio cuaternario siguen siendo catinicos a cualquier valor de pH. Los
bsicos dbiles de amonio terciario se desprotonan en disoluciones moderadamente
bsicas y pierden entonces su capacidad, reducindose tambin el tiempo de retencin.

Cargas: La fuerza de enlace de la muestra depende de la magnitud de la carga. La fuerza


de retencin es mayor y, por consiguiente la de elusin es menor, mientras ms cargado
se encuentre el compuesto, ya sea negativa (aniones) o positivamente (cationes).

Gradiente: Aumentando la concentracin de la fase mvil, los iones compiten cada vez
ms favorablemente con la muestra por los sitios activos cargados de la fase estacionaria.

Esquema del gradiente del Buffer con contraiones cargados negativamente. Se presenta un grfico
con el poder de elusin (fuerza inica) y el porcentaje de protena eluda, que muestra una
gradiente directamente proporcional.

Porosidad: El tamao del poro de la resina al que se une el compuesto mvil por
intercambio inico influye directamente en la capacidad de unin. En membranas cuyo
tamao de poro es pequeo (menor de 600) no hay espacio suficiente para unir el in
dentro de dichos poros por lo que la cantidad de intercambiador por unidad de superficie es
menor. Sin embargo, en membranas con tamao de poro mayor (mayor de 600) se
puede unir el compuesto mvil dentro de dichos poros, con lo que se incrementa la
cantidad de intercambiador por unidad de superficie. La porosidad busca una mayor
superficie de intercambio.

Donde existe mayor porosidad (derecha), se puede unir el compuesto mvil dentro de estos poros
incrementando la cantidad de intercambiador de superficie.
BIBLIOGRAFA
(1) http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia(2) Harris, Daniel C.Anlisis
Qumico Cuantitativo,
(2) http://www.itescam.edu.mx/principal/sylabus/fpdb/recursos/r49958.PDF
(3) Lehninger, Principios de bioqumica, quinta edicin.
(4) Voet Bioquimica, tercera edicin y cuarta edicin.