Transformacin bacteriana en E. coli.

Introduccin
La transformacin es el proceso en el que las clulas procariontes toman DNA
exgeno del ambiente, alterando a su fenotipo y el de sus descendientes. En
general la entrada del DNA a las clulas es independiente de la fuente del DNA (o
de sus secuencias), pero es muy dependiente del estado fsico-qumico del DNA
(tamao, hebra simple o doble, lineal o circular, relajado o superenrollado). La
eficiencia con la que la clula blanco tima el DNA exgeno vara ampliamente
entre especies procariticas y dentro una especie, de las cepas . Algunas
especies pueden ser manipuladas en el laboratorio para incrementar la eficiencia
con la que toman el DNA. Las clulas pre-tratadas que toman el DNA ms
eficientemente se dice que son competentes.
El efecto que tiene el DNA al entrar en una clula blanco y en los descendientes
depende completamente de la secuencia especfica del DNA exgeno. El DNA
exgeno pasar a la descendencia slo si este se integra en el material gentico
de la clula blanco o si el mismo tiene un origen de replicacin (ori), que funcione
en la clula blanco. Transformaremos clulas de E. coli para demostrar la
habilidad de este DNA para modificar permanentemente la herencia gentica de
las clulas que lo adquieren. Se transformar con un plsmido que contiene su
propio ori y un gen de resistencia a antibitico. Las clulas blanco que adquieran
el plsmido se transformarn, de un fenotipo sensible al antibitico, a otro,
resistente al antibitico. Despus de mezclase con el plsmido, encontraremos a
las clulas resistentes al antibitico sembrando las clulas tratadas sobre cajas de
agar que contienen antibiticos. El antibitico matar cualquier clula que no
adquiero al plsmido.

Procedimiento
Preparacin de bacterias competentes con cloruro de
calcio.
1. Descongelar un glicerol stock de la cepa adecuada de E. coli, adicionarlo a un
matraz Erlenmeyer de 250 ml con 50 ml de medio TY 2X precalentado e incubarlo
a 37 C en un bao de agua durante una hora sin agitacin. Posteriormente
incubarlo de 2 a 3 horas a 37 C con agitacin a 250 rpm. La densidad ptica del
cultivo no debe sobrepasar 0.8 en el momento de la cosecha.
2. Transfiera 40 ml del cultivo a un tubo de centrfuga de polipropileno de 50 ml y
colecte las clulas por centrifugacin a 5000 rpm durante 8 minutos a 4 C en una
centrfuga con un rotor JA20 o similar.
3. Decantar el sobrenadante y resuspender el botn en la mitad del volumen (20
ml) de cloruro de calcio 50 mM frio, incubar durante 20 minutos en bao de hielo,
centrifugarlo como anteriormente.
4. Decantar el sobrenandante con mucho cuidado y resuspender el botn en la
dcima parte del volumen inicial (4 ml) de cloruro de calcio 50 mM fro, esto nos
dar las suspensin de clulas competentes.

Preparacin de
congeladas

clulas

competentes

para

almacenar

1. Transferir 166 l de las clulas competentes en un tubo Eppendorf de 1,5 ml

estril.
2. Adicionar 34 l de glicerol 100% v/v estril a las alcuotas de 166 l de la
solucin de clulas competentes, dando una concentracin final de 17% de
glicerol.
3. Las clulas competentes se colocan a -70 C y pueden guardarse
indefinidamente.
4. Para usarse, sacar del congelador y dejar descongelar por algunos minutos a
37 C. Seguir la tcnica de transformacin.

Transformacin
Nota: Es necesario trabajar con mucho cuidado para mantener la esterilidad y no
contaminar las muestras.
1. Cada grupo tomar dos tubos con 200 l de clulas competentes para la
transformacin. Los tubos debern conservarse sobre hielo.
2. Adicionar 2 l de plsmido slo a uno de los tubos. Los dos tubos se
incubarn 30-60 minutos sobre hielo. (El tubo al que se le agreg el DNA
es el experimento y al que no se le agreg nada es el control negativo).
3. Colocar ambos tubos en un bao de agua a 42C por 90-120 segundos.
Remover el tubo inmediatamente hacia el hielo e incubarlo otros 5 minutos
(Al finalizar este paso el DNA presente debi entrar en algunas clulas).
4. Adicionar 900 l de LB a cada tubo resupendiendo suavemente las clulas.
Incubar 30-60 min, esto permitir a las clulas recobrarse del trauma del
tratamiento de competencia y empezar la expresin de los genes
funcionales recin introducidos.
5. Despus de la incubacin, resuspender las clulas de ambos tubos y
sembrar por separado 100 l de cada uno en cajas con LB, o el antibitico
al que confiera resistencia el plsmido
(generalmente 50g/ml),
previamente etiquetadas, y esparcir uniformemente sobre el agar con una
varilla de vidrio doblada como bastn de hockey esterilizada mediante
flameo con alcohol.
6. Pipetear 1.98 ml de medio LB en cuatro tubos estriles y arreglelos en dos
hileras de tubos.
7. Agitar en vortex el tubo con el cultivo tratado con el plsmido e
inmediatamente pipetear 20 l en el primer tubo de la primera serie y agite
vigorosamente. Este tubo contendr la dilucin 1 a 100. Cambiar la punta
de la pipeta e inmediatamente pipetear 20 ml de esta dilucin 1:100 al
segundo tubo y agitar vigorosamente. Se realizaron dos diluciones seriales
1:100. Cul es la dilucin final en el segundo tubo? Ahora repita las
diluciones con el tubo del control negativo.
8. Agitar la dilucin final y pipetear 100 l de clulas diluidas en cajas con LB
mrquelas como transformadas. Untarlas en la superficie de la placa con
la varilla de vidrio esterilizada. Repetir el procedimiento para la dilucin final
del tubo del control negativo y mrcar.

9. Incubar las placas a 35-37 C toda la noche y revisar si hay crecimiento al

otro da. Contar el nmero de colonias en las cajas con LB-antibitico.
10. Cuente el nmero de colonias en las dos cajas con LB. Debera ser el
nmero de colonias en estas dos cajas similar? Podra decir cuantas
clulas vivas haba en los tubos de cultivo al iniciar el paso 5?

Anlisis del procedimiento

Cuntos ml de medio LB se requieren para la prctica? Cuntos ml requieren
agar y de esos cuntos ampicilina?

Resultados
Llene la siguiente tabla.
Control
#
colonias

Factor de
dilucin

Transformadas
Clulas
#
suspendidas
colonias
(cels/ml)

Factor de
dilucin

LB (dilucin
10-4)

[1/(0.1)]*104

1/(0.1)]*104

LB-amplicilina

1-0.1

1-0.1

Clulas
suspendidas
(cels/ml)

Calcular la proporcin del control de clulas transformadas (#clulas no

transformadas / total de clulas = ________
Calcule la proporcin de clulas transformadas (#clulas transformadas / total de
clulas = ________

Medios de cultivo
Caldo TY
Materiales:
Triptona
Extracto de levadura
Matraz erlenmeyer

5g
3g
1L

1M CaCl2 esterilizar en autoclave aparte.

Procedimiento: Adicione 5 g de Triptona y 3 g de extracto de levadura a 1 litro de
agua. Esterilizar en autoclave. En condiciones estriles adicionar 10 ml de CaCl 2
1M.
NOTA: Indicar en la etiqueta que se le adicion calcio.

Si se requiere slido, agregar 15 g/l de agar, esterilizar y adicionar el calcio

despus, llenar las cajas con 30 ml de medio cada una aprox.
LB.
Triptona
Extracto de levadura
NaCl

g/L
10
5
5

Bibliografa.
1. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3
(1989).
2. Jerpseth, J., et al.,"XL1-Blue MRF' E. coli cells: McrA-, McrCB-, McrF-, Mrr-,
HsdR- derivative of XL1-Blue cells" Strategies 6, 81 (1992).
3. 2. Glover, D.M. DNA Cloning Volume I: A Practical Approach. IRL Press,
Oxford, 1985.