Inmunologa 201

3
OBTENCIN DE MACRFAGOS Y ESPLENOCITOS A PARTIR DE Mus
musculus BALB/c
Morn, G., Villarreal, J.1
Universidad de las Fuerzas Armadas-ESPE, Carrera de Ingeniera en
Biotecnologa, Departamento de Ciencias de la Vida, 1Laboratorio Inmunologa.
Sangolqu, Ecuador.

RESUMEN
Mus musculus BALB/c es un ratn de laboratorio que se utiliza para la investigacin cientfica. Su
cariotipo est compuesto por 40 cromosomas y son albinos. Para cada experimento se escogen
ratones de laboratorio que pertenezcan a una misma cepa pura o endogmica. Los individuos de
una misma cepa llevan los mismos genes, por lo cual se facilita la comparacin de los efectos de
los diferentes tratamientos experimentales (frmacos, entorno fsico, etc.), sin que se produzca
confusin debido a las diferencias genticas. El estudio que se llev a cabo con 2 roedores fue el
cambio de peso, la supervivencia durante 17 das, a los 11 das se le inyect una solucin de
tioglicolato para inmunizarlos, a los tres das se sacrific a uno de los dos para ver y hacer el
conteo de los macrfagos, se hizo la diseccin de los rganos y se midi cada uno de ellos.
Finalmente los tres das siguientes se sacrific al otro para realizar un conteo de los esplenocitos
haciendo de esta manera una comparacin con los datos de todo el curso.
Palabras claves: Ratn, albino, laboratorio.

ABSTRACT
Mus musculus BALB / c mouse is a laboratory that is used for scientific research. Its karyotype
consists of 40 chromosomes and is albinos. For each experiment, laboratory mice are chosen
belonging to the same pure or inbred strain. The individuals of the same strain carry the same
genes, so it is easy to compare the effects of different experimental treatments (drugs, physical
environment, etc.), without causing confusion due to genetic differences . The study was carried
out with 2 rodents was weight change , survival for 17 days , at 11 days was injected with
thioglycolate solution for immunization , three days were sacrificed one of the two to see and do
count macrophages became organs dissected and measured for each . Finally three days
sacrificed to another to perform a count of splenocytes thus making a comparison with the data
of the entire course.
Keywords: Mouse, albino, laboratory.

INTRODUCCION
El ratn de laboratorio es una
especie cosmopolita, se adapta a
una gran variedad de condiciones
ambientales, desde zonas muy fras
hasta
regiones
tropicales.
En
general, las especies prefieren

ambientes ms secos que hmedos

(Cellis, 1998).
El ratn es un mamfero de sangre
caliente, de hbitos nocturnos y su
comportamiento est influenciado
por feromonas. Posee un agudo
sentido de la audicin, por lo que se

Inmunologa 201
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alteran rpidamente con los ruidos,
es por ello que hay que tener
cuidado con los equipos que se
utilizan (Guevara, 1999).
Su sentido del olfato est muy
desarrollado, no slo para detectar
comida
y
depredadores,
sino
tambin para percibir un orden
social (Cellis, 1998).
Su visin es muy pobre y no pueden
percibir los colores (AVMA, 1995). En
la rbita del ojo posee unas
glndulas con forma de herradura
llamadas glndulas Harderianas,
cuando el ratn est en estrs,
excreta en la zona periocular una
sustancia de color marrn llamada
porfirina (SENASA, 2004).
El sistema social depende de la
densidad de poblacin, viven en
grandes colonias y el rango social
est bien desarrollado (Guevara,
1999).
Generalmente, son muy dciles a
excepcin
de
algunas
cepas
exocriadas
que
mantienen
su
agresividad, al igual que sus
antecesores salvajes (Wilson, 2005).
Por su pequeo tamao son muy
susceptibles a cambios ambientales,
puesto que una variacin de la
temperatura entre 2 a 3C, puede
afectar su temperatura corporal y
modificar su fisiologa. El tamao
del ratn adulto varia entr 12 a 15

cm desde la punta de la nariz a la

punta de la cola; el largo de la cola
es igual al largo del cuerpo y con un
peso aproximado de 30 gr (AVMA,
1995). Las cras al nacer tienen un
peso aproximado de 1 a 2 g y gana
rpidamente
peso
durante
la
lactancia (Wilson, 2005).
Tienen una vida til de 1 a dos aos
y se obtiene de ocho a diez
camadas (Wilson, 2005).
Las caractersticas que han hecho
del ratn de laboratorio el modelo
biolgico y biomdico ms utilizado
en las investigaciones cientficas
son:
1. Su fcil manejo (Quezada, 2006).
2. Su tamao apropiado para la
crianza y manipulacin (Quezada,
2006).
3.
No requieren demasiados
cuidados.
4.
Tienen un sistema inmune
similar al de los seres humanos
(Quezada, 2006).
5. Tienen un alto nmero de cras
(Quezada, 2006).
6. Poseen un breve perodo de
gestacin (19-21 das), y su destete
es rpido (Quezada, 2006).
7. Las hembras producen un gran
nmero de vulos, los cuales al ser
fecundados son muy resistentes
(Quezada, 2006).
8. Al ser mamferos euterios, poseen
un genoma muy similar al de los
seres humanos (Quezada, 2006).

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El objetivo del experimento ser
obtener macrfagos y esplenocitos
a partir de Mus musculus balb/c
MATERIALES Y MTODOS
Este trabajo se realiz en los
laboratorios de biotecnologa de la
Universidad
de
las
Fuerzas
Armadas-Espe. Se trabaj con 12
ratones, divididos en grupos de 4
personas, de la lnea BALB/c
hembras de 6 a 8 semanas de edad
y un peso promedio de 22 g,
procedentes del bioterio de la
Facultad
de
Medicina
de
la
Universidad Central, mantenidos en
condiciones convencionales a una
temperatura ambiente de 25C y
con iluminacin artificial, en cajas
plsticas con camas de virutas de
madera, alimentados con frutas y
granos y agua.
MANIPULACIN DEL RATN
Se utiliz la tcnica de sujecin que
consisti en tomar al ratn por la
zona media de la cola y se apoy en
una rejilla. Luego se coloc la base
de la cola del ratn entre los dedos
anular y meique, se sujet la parte
superior del cuello, hombros y se
levant.
Se pes el ratn y como parte de
dicha manipulacin se le inyect
200 uL de PBS por la va de
administracin
intraperitoneal y
subcutnea.
TRATAMIENTOS

Con una jeringa y aguja calibre 25

G, de bisel pequeo se inocul a los
11 das una solucin de tioglicolato
al 2 % en PBS a los ratones por va
intraperitoneal.
OBTENCIN DE MACRFAGOS
3 das despus se prepar jeringas
con 5 ml de medio de recuperacin
de macrfagos RPMI fro (200 U/ml,
svf 2% HEPES 2 ml) y se colocaron
en un cooler con hielo. Luego se
sacrific el ratn 1 del grupo 3 as
como de los dems grupos de
trabajo por dislocacin cervical y se
realiz 3 lavados en la cavidad
peritoneal con 3 ml de RPMI para el
cual se presion ligeramente la zona
de inyeccin para la recuperacin
de toda la solucin administrada.
Posteriormente se coloc el lquido
del lavado peritoneal que contena
los macrfagos en un tubo de 50 ml
fro con tapa de rosca.
CULTIVO DE MACRFAGOS
Se realiz dos centrifugaciones a
1000 rpm por 5 minutos a 4 C de
las la cuales se elimin el
sobrenadante y se retom el pellet
en el medio de recuperacin de
macrfagos.
Despus de la ltima centrifugacin
se recuper del pellet en un medio
RPMI (glutamina 1ml, P/S 200 uL.
Hepes 2 ml, svf 10%) y se observ
macrfagos sobre una cmara de
Malassez.
Por ltimo se coloc la muestra en
cajas Petri y se dej que los

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macrfagos se adhieran durante 3
das a 37 C, despus de este
tiempo se los volvi a recuperar por
medio de la tcnica de raspado y
realiz el conteo de macrfagos en
una cmara de Neubauer para
determinar
el
nmero
de
macrfagos por ml, esta cantidad se
dividi entre 4 y se multiplico por
10.000.
TAMPN DE LISIS
Se realiz un tampn de lisis con
41,45 g deNH4Cl, 5g de KHCO3,
0,372 g de EDTA y se ajust el pH a
7,4.
DISECCIN DEL RATN
El material usado const de
guantes, tijeras, bistur, pinzas, etc.
Se coloc al ratn sobre sus espalda
sobre una plancha de espuma flex
cubierta con papel aluminio.
Se esteriliz la parte media del
abdomen, se cort con unas tijeras
y se retir la piel con una pinza.
Despus de realiz una incisin
hasta
encontrar
el
peritoneo
visceral.
Se
extrajo
los
rganos
ms
importantes del ratn como bazo,
intestino delgado, cerebro, corazn,
hgado, rin; y se midi la longitud
de cada uno con una regla.
OBTENCIN DE ESPLENOCITOS
Se sacrific el ratn 2 del grupo 3
as como de los dems grupos de
trabajo por dislocacin cervical.

Se realiz una diseccin del ratn y

se extrajo el bazo. Con la ayuda del
pistn de una jeringa se tritur el
bazo en una caja Petri con medio
RPMI. Debido a que pudo existir una
contaminacin con glbulos rojos,
se procedi a realizar una hemlisis
con un buffer lisis. Se realizaron 2
lavados con dicho medio con 3
aspiraciones
sucesivas
por
3
minutos.
Despus se centrifug por dos
ocasiones durante 10 minutos a
1500 rpm y se recuper el pellet ya
limpio de glbulos rojos que
posteriormente fue resuspendido en
un medio con 5 ml de RPMI para el
conteo de clulas, para lo cual se
realiz una dilucin 1:10 y se coloc
10 uL en la cmara de Neubauer.
Para determinar el nmero de
esplenocitos por ml se utiliz la
relacin:
Concentracin=(#
de
celulas*10000)/(#
de
cuadros*dilucin)
RESULTADOS
Se determin el peso de Mus
musculus BALB/c 1, 2 del grupo 3 y
de cada uno de los grupos de
trabajo antes de la diseccin:

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Grfica 1. Peso de Mus musculus 1

y 2 del grupo 3 a los 0 (inicial) 7, 14
y 17 das.

Grfica 2. Peso de Mus musculus

de todos los grupos de trabajo.
Se
obtuvo
un
100%
de
supervivencia de Mus musculus del
grupo 3 as como de todos los
grupos de trabajo

Grfica 4. Supervivencia de Mus

musculus de los grupos de trabajo.
El tamao
de los principales
rganos del ratn 1 se muestra a
continuacin

Grfica 5. Tamao de los rganos

principales de Mus musculus 1 del
grupo 3.
En las siguientes tablas se observa
el
conteo
de
macrfagos
peritoneales
y
conteo
de
esplenocitos de Mus musculus de
todos los grupos de trabajo
Tabla 1. Conteo de macrfagos en
cmara de Neubauer de todos los
grupos de trabajo.

Grfica 3. Supervivencia de Mus

musculus 1 y 2 del grupo 3.

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Tabla 2. Conteo de esplenocitos en

cmara de Neubauer de todos los
grupos de trabajo.

Grfica 7. Conteo de macrfagos y

esplenocitos de Mus musculus de
todos los grupos de trabajo.
Se determin la media aritmtica y
la desviacin stndard para todos
los ratones de los grupos de trabajo,
obtenindose
los
siguientes
resultados:

Se puede observar en las siguientes

fotos
algunos
esplenocitos
contabilizados del grupo 3

Tabla 3. Media del nmero total de

macrfagos/ml de todos los ratones
de los grupos de trabajo.

Foto 1. Conteo de esplenocitos en

cmara de Neubauer.

Tabla 4. Media del nmero total de

esplenocitos/ml de todos los ratones
de los grupos de trabajo.

DISCUSION

Grfica 6. Conteo de macrfagos y

esplenocitos de Mus musculus del
grupo 3.

SNASA 2004 dice que el alimento es

el
material
primario
en
la
alimentacin de los ratones. Se les
aliment
con
alimento
para
roedores en las noches y fruta en
las maanas a partir del cual se
formaron y renovaron los tejidos y
estructuras corporales, tanto las
nuevas como las ya existentes, que
deban ser reemplazadas debido al
proceso de desgaste.
El consumo de alimento y agua
vara entre las cepas de ratones
(Tur-Mari, 2000). En los ratones se
observ que el acto de comer era

Inmunologa 201
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cclico, con un pico mximo durante
el periodo de oscuridad. El mayor
consumo de agua fue durante las
horas de la noche pero no fue el
consumo diario estndar de 7 mL
por ratn por lo que los ratones
presentaron una deshidratacin lo
cual bajo su peso durante los 17
das.
Segn Montaez, 2008 el ratn es
un animal sociable y se mantiene en
grupos sin ningn inconveniente,
estos
grupos
deben
formarse
rpidamente luego del destete. Se
mantuvo a varios ratones en una
sola jaula y no se observ
inconveniente con las hembras, el
macho
comenz
a
mostrar
agresividad a los 7 das de haberlos
puesto en la jaula.
El
100%
de
los
ratones
sobrevivieron, segn Senz 2005
esto se debe a las condiciones
adecuadas
en
las
que
se
encontraban, temperatura de 20 a
25C, humedad relativa ambiental
entre 40 y 70%, buena aireacin y
ventilacin.
Riera 2006, manifiesta que las
condiciones ambientales en que se
cran y experimentan los animales
influyen decisivamente en las
respuestas
a
los
diferentes
tratamientos.
Se
aplic
el
tratamiento
de
tioglicolato
(sustancia que promueve la captura
de macrfagos) a los 11 das de la

adquisicin del ratn y se observ

que el pelaje de los roedores cambi
volvindose spero y disminuyeron
su peso por lo que si se requiere
respuestas
estandarizadas,
las
condiciones en que se mantienen
los animales deben ser fijas.
Al recibir la dosis de tioglicolato los
ratones empezaron a capturar
rpidamente
neutrfilos
y
monocitos,
aumentando
rpidamente los niveles de F4/80
(una
protena
de
membrana
exclusiva de los macrfagos) afirma
Olfert, 1973.
Los
macrfagos
son
clulas
importantes en el desarrollo de la
inmunidad innata y adaptativa.
Cuando son activados ya sea por
efecto
de
citoquinas
proinflamatorias o infecciones con
microorganismos,
liberan
xido
Ntrico (NO) y otros intermediarios
reactivos del oxgeno, responsables
de
su
actividad
citotxica
y
citosttica contra microorganismos
infecciosos y clulas tumorales
(Tamez et al., 2001; Ignacio et al.,
2001).
Musser 2008, menciona que los
ratones son muy sensibles al ruido y
pueden percibir frecuencias de
sonido que son inaudibles para el
ser humano. Al tercer da de
aplicado el tratamiento los ratones
en el laboratorio mostraban estress,
agresividad. Se sacrific al primer

Inmunologa 201
3
roedor y se analizaron los resultados
haciendo un lavado peritonial,
posteriormente se realiz el conteo
de macrfagos.
La inoculacin de Caldo Tioglicolato
indujo
un
incremento
en
la
poblacin
de
macrfagos
peritoneales, siendo el nmero de
macrfagos 5,47 x 106, esta tcnica
es muy utilizada para la coleccin
de mayor cantidad de estas clulas
(McCarron et al., 1984), el medio
acta como un estmulo inflamatorio
no especfico. Segn Musser 2008,
se
aumenta
tambin
las
concentraciones de nitrito fueron en
un
7,45mM para los extractos
metanicos.
Hudson 1978 afirma que tambin se
observa produccin de xido ntrico
debido al uso de caldo tioglicolato
como
atrayente
que
permite
concentrar una mayor cantidad de
macrfagos (agente inflamatorio
inespecfico).
Finalmente, tres das despus se
sacrific al otro ratn y ser realiz el
conteo de esplenocitos.
Ignacio
2001,
dice
que
la
caracterizacin de los antgenos de
superficie se puede realizar en
clulas
obtenidas
de
diversos
especmenes,
por
ejemplo,
esplenocitos.

Como parte de la gran variedad de

protocolos y debido a su facilidad
relativa en la manipulacin y por su
alta densidad celular representativa
de los dems rganos linfoides y de
sangre perifrica, se encuentra el
bazo; por consiguiente, el anlisis
de
las
subpoblaciones
de
esplenocitos
se
constituye
en
parmetro
fundamental
al
determinar
el
potencial
inmunosupresor de una molcula
segn Holladay 2002.
Los anlisis se realizaron en cada
ratn sacrificado, que de acuerdo
con lo reportado por Pheng et al.
2003, pertenece a los esplenocitos
maduros y viables, en la cmara de
Neubauer
se
cont
9,50x106,
determinando mayor produccin de
stos que de macrfagos.
Segn
Krause
1990,
estos
resultados
sugieren
que
la
Melatonina (MLT) acta en forma
directa en la proliferacin linfocitaria
unindose, posiblemente, a los
receptores de alta afinidad para la
hormona
localizada
en
los
esplenocitos,
que
estimula
la
produccin
de
IL-2
e
IL-1b
originando un incremento de la
inmunidad celular.
CONCLUSIONES
Los ratones de todos los
grupos tuvieron un porcentaje
de supervivencia de 100%
correspondiente a los das
antes de que se sacrificaran.

Inmunologa 201
3

Adems de que sus pesos no

variaron significativamente.
Los rganos del ratn 1del
grupo 3 se encontraron en
buen
estado
sin
deformaciones
o
tumoraciones.
El grupo de trabajo 4 obtuvo
mayor nmero de macrfagos
de Mus musculus BALB/c
siendo este de 7,6x106
clulas/ml en relacin al
grupo de trabajo 3 en el que
se
obtuvo
5,47x106
clulas/ml.
Considerando a todos los
grupos de trabajo, en el
conteo de macrfagos se
obtuvo
una
media
de
5,14x106 clulas/ml y una
desviacin
estndar
de
1966432,8.
El ratn 2 del grupo 3 tuvo
mayor
nmero
de
esplenocitos que fue de
9,50x106
clulas/ml
en
relacin a todos los grupos de
trabajo.
Se obtuvo una media de
2,08x106 clulas/ml y una
desviacin
estndar
de
3706806,81para todos los
grupos
de
trabajo
considerando el nmero de
esplenocitos.
El investigador decide, de
acuerdo con sus necesidades,
dnde ubicar a los animales
empleados,
teniendo
en
cuenta que el lugar brinde las
condiciones ambientales y de
manejo
ptimos
que
aseguren la salud y la
comodidad
de
los
especmenes, de modo que

sus patrones metablicos y

de
comportamiento
se
mantengan
normales
y
estables, dando respuestas
confiables.
RECOMENDACIONES
Se recomienda que para una
prxima
investigacin
se
tenga en cuenta un grupo
control de ratones.
Los
investigadores
que
trabajen y experimenten con
animales estn moralmente
obligados a manifestarles tres
tipos de actitudes: respeto,
afecto y gratitud.
Respeto: por tratarse de seres
vivos y sensibles, que estn
experimentando
sufrimiento
y
podran terminar perdiendo la vida,
tratrseles
con
todas
las
consideraciones
que
el
caso
merece.
Afecto: considerndolos partcipes
con nosotros, del misterio de la
vida.
Gratitud: reconocimiento por la
importante ayuda al constituirse
nuestros
ms
ntimos
colaboradores.
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ANEXOS
Imagen1. Alimentacin.

Imagen2. Manipulacin del ratn.

Imagen3. Primer peso del ratn

Inmunologa 201
3

Imagen4. Segundo peso del ratn.

Imagen7. Decapitacin.

Imagen5.
tioglicolato.

Imagen8. Diseccin.

Inmunizacin

Imagen6. Tercer peso del ratn.

con

Imagen9. Lavado para obtencin

de macrfagos

Inmunologa 201
3

Imagen10. Medicin de los rganos

internos del roedor.