Existen

2
tcnicas
de
microscpica fundamentales:

observacin

*Las basadas en mtodos de montaje

hmedo y gota pendiente
Las que se basan en la observacin de
extensiones fijadas y teidas
*

EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS.

Es la llamada observacin vital

Se utiliza principalmente en la investigacin

de los caracteres de movilidad microbiana,
en estudios de morfologa ( especialmente
bacterias en espiral cuya morfologa se
altera al secarse y teirse).

Los mtodos que se emplean para este tipo

de examen son:
-Preparaciones hmedas
-Mtodo de la gota pendiente
-Examen en fresco con nigrosina
Un inconveniente es su escasa conservacin.
I.

La observacin suele hacerse con el objetivo de

40 aumentos. No debe utilizarse el objetivo

de inmersin, pues al desplazar la preparacin el

cubreobjetos permanece adherido al objetivo y

esto crea turbulencias en el lquido de la

preparacin.
A. PREPARACIONES HMEDAS

Se obtienen colocando una gota de lquido que

contiene los mo sobre un portaobjetos (limpio y seco),
sobre el que se coloca un cubreobjetos
Si se parte de un producto slido, se deposita una
gota de agua estril o suero salino estril sobre el
portaobjetos, para posteriormente con ayuda del asa
(previamente flameada y enfriada) realizar una
suspensin del producto en estudio
Se puede sellar con parafina o una sustancia similar,
para disminuir la evaporacin

B. PREPARACIONES DE GOTA PENDIENTE

Se utilizan portaobjetos excavados
1.
Se coloca una gota de suspensin en el
centro de un cubreobjetos (limpio y seco)
con un asa previamente esterilizada
2. Se coloca el porta sobre el cubre, de forma
que la gota de suspensin coincida con el
centro de la excavacin y, se presiona
ligeramente para que el cubre se adhiera
3. Se da la vuelta a todo el conjunto, de forma
rpida pero sin violencia, para que la gota
quede colgando del cubre sin llegar a tocar
el fondo de la excavacin

C. EXAMEN EN FRESCO CON NIGROSINA

Se obtienen imgenes en las que destacan los mo
incoloros sobre un fondo negro-parduzco
Se utiliza principalmente para el estudio de detalles
estructurales como cpsulas y flagelos
En el centro del porta se coloca, con el asa, 1 o 2
gotas de nigrosina
A continuacin con el asa, se toman unas gotas de
material en estudio y se mezclan lo ms
homogneamente posible
Se seca al aire
Se observa con el objetivo de inmersin

II. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Son las ms frecuentes en microbiologa

II.1. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA TINCIN

*Pureza del colorante
* Concentracin del colorante
* pH de la solucin colorante. La fijacin del
colorante sobre la clula se efecta por
mecanismos FQ (formacin de enlaces,
interacciones de tipo electrosttico)

*T, en general, T superiores a la ambiental

disminuyen el tiempo de tincin
*Sustancias adicionales, en ocasiones, la
tincin se apoya en otras sustancias como
son:
-mordientes
-soluciones cidas o bsicas
- decolorantes
* Tiempo, suele oscilar entre 1-10

II.2. COLORANTES
Son los reactivos necesarios para la coloracin de
las tinciones, que facilitan la observacin de las
mismas al microscopio
Generalmente, actan mediante reacciones de
intercambio inico entre el colorante y los
elementos celulares
Segn su procedencia pueden clasificarse:
*Colorantes naturales: son los que se
extraen de animales o plantas. Por ej,
carmn, hematoxilina
*Colorantes artificiales: se obtienen de forma
sinttica y a su vez se pueden clasificar:

 Bsicos: son los colorantes nucleares. Ej: fucsina

bsica, cristal violeta, verde malaquita, violeta de
genciana, azul de metileno
ClAM
Cl- + AM+

Si el color reside en el in positivo del colorante, se

dice, que es un colorante bsico
cidos: son colorantes citoplasmticos. Ej c.
Pcrico. El color reside en el in cargado
negativamente
Neutros: asocian un colorante cido con uno bsico.
Los ms conocidos son los eosinatos de tiaminas,
que suelen designarse con el nombre del autor que
invent la mezcla: May-Grndwald, Wright,
Giemsa

 Indiferentes: suelen ser insolubles en agua y

solubles en alcohol. Ej. Sudan III..
En

bacteriologa se emplean preferentemente

los colorantes artificiales bsicos , debido a la
gran basofilia del citoplasma bacteriano, rico
en ARN
Los colorantes cidos se utilizan
preferentemente como colorantes de
contraste, los neutros y los indiferentes para
algunas coloraciones particulares

Los pasos a seguir para la realizacin de una

preparacin fijada y coloreada son
generalmente:
CONFECCIN

SECADO
FIJACIN
COLORACIN

DEL FROTIS

Se pretende obtener una pelcula lo

ms homognea posible de la muestra
sobre el portaobjetos
Puede prepararse a partir de
productos lquidos o slidos

A.- PRODUCTO LQUIDO:

Se coloca sobre el porta de vidrio limpio y seco,

una gota del material a estudiar y se extiende
con ayuda de un asa de platino

B.- CULTIVOS EN MEDIO SLIDO:

Se pasa sobre la superficie del portaobj. El hisopo
con el que se ha tomado la muestra. Tambin
puede prepararse una suspensin del material en
una gota de agua o SS colocada previamente en
el porta, extendindola con ayuda del asa de
platino en una superficie aproximada de 1 cm2

Tiene como finalidad eliminar el agua de la

extensin para proceder a la fijacin.

Se dejar secar el frotis a T ambiente. Para

ello se puede agitar varias veces el porta al
aire hasta comprobar, por el cambio de
aspecto de la preparacin, que sta se ha
secado

Consigue dejar la extensin adherida al

portaobj. Para que resista las operaciones
siguientes.
Tiene por objeto la inmovilizacin de las
estructuras del material a estudiar en un
estado lo ms prximo posible al estado vivo.

Consiste en una muerte rpida de los mo,

debida a la coagulacin de las albminas
protoplasmticas.

Las formas ms habituales de fijacin son:

Por calor: se pasar varias veces, la parte

inferior de la preparacin por la llama azul
del mechero Bunsen (sujetando el porta
con unas pinzas), hasta que se note
caliente al colocarlo en el dorso de la
mano, pero sin que queme

 Alcohol en fro, se cubre la preparacin

con etanol o metanol. Se deja actuar
durante varios minutos. Se escurre y se
deja secar.
Exposicin a vapores de un compuesto
fijador.

Es el proceso de tincin de los mo.

Para teirlos, existe un gran n de productos
qumicos con propiedades colorantes
Su eleccin est condicionada al tipo de tincin a
realizar
Todos los tiempos recomendados en las
tinciones son orientativos, debindose ensayar el
tiempo para cada lote y cada tcnica en particular

Eliminacin del exceso de colorante.

Se utilizar el frasco lavador o la goma del

grifo, teniendo la precaucin de no dirigir el
chorro directamente al frotis

Se secar la preparacin al aire o

presionando entre 2 papeles de filtro, pero
nunca se debe frotar el porta.

Se utiliza principalmente el procedimiento

basado en la decantacin de los lquidos
empleados
Una forma cmoda, simple y limpia de
trabajo es la utilizacin de cristalizadores
sobre los que se dispone un puente formado
por 2 varillas de cristal, unidas por sus
extremos, con un separacin entre ellas de
varios cm.

Sobre el puente se colocan las preparaciones

secas y fijadas, y se realiza la tcnica de
tincin segn el protocolo a seguir.
Para procesar un n elevado: automatizarse o
cubetas de tincin ( cambiar frec. Lq baos)

Las prep. Fijadas y coloreadas se clasifican en:

Tinciones simples: Son las que utilizan un solo
colorante y permiten conocer la morfologa y tipo
de agrupacin bacteriana. Ej azul de metileno
Tinciones diferenciales: utilizan ms de un
colorante y sirven para poner de manifiesto las
caractersticas de afinidad por ciertos colorantes
de los mo. Ej. Gram, AAR
Tinciones estructurales: utilizan ms de un
colorante y sirven para poner de manifiesto
estructuras bacterianas. Ej. Flagelos, esporas,
cpsulas.