Laboratorio de ingeniera de reacciones IQUI2301

201510

Medicin de la cintica enzimtica de la glucosa-oxidasa

Laboratorio de ingeniera de reacciones
Prctica III. (Duracin: dos sesiones)

1. Motivacin del problema

La determinacin de la concentracin de glucosa en fluidos corporales es de gran
importancia en el diagnstico clnico de trastornos metablicos. El ms importante de estos
es la diabetes mellitus. Esta enfermedad se caracteriza por la presencia de altos niveles de
glucosa en los fluidos fisiolgicos humanos. Actualmente es la enfermedad metablica ms
comn en el mundo con ms de 150 millones de personas afectadas, y con una proyeccin
poco favorable; pues es posible que este nmero se duplique en las prximas dos dcadas.
Adicionalmente la evaluacin de los niveles de la glucosa tambin es de gran utilidad en el
diagnstico de la hipoglicemia (niveles bajos de glucosa en la sangre).
Las metodologas utilizadas para este fin, combinan principios fsicos, qumicos y
biolgicos, con el objetivo de obtener seales cuantificables, detectables de forma rpida,
exacta y reproducible. Esto, sumado a la necesidad de desarrollar estas pruebas con un
consumo mnimo de reactivos, en los menores tiempos posibles y favoreciendo la
automatizacin de los procesos. Se ha dado inicio a una sinergia entre la bio-sensrica y la
microfludica, asociando las ventajas y desventajas de trabajar los procesos a microescala,
con la especificidad de las reacciones enzimticas y sus consideraciones cinticas.
Desde el punto de vista de la ingeniera de reacciones la medicin de los parmetros
(Km y Vmax)1 de una reaccin enzimtica, es el punto de partida para establecer la capacidad
de prediccin sobre las concentraciones de los sustratos en el tiempo, permitiendo el
desarrollo de sensores basados en este tipo de reacciones bioqumicas. Estos parmetros
son esenciales para la definicin precisa de los rangos de medicin y de las funciones
necesarias para la cuantificacin primaria de la seal. En el caso especfico en el cual las
reacciones ocurren en sistemas a escala micromtrica es necesario adicionar
consideraciones de transporte referentes al rgimen de flujo, a las caractersticas del
mezclado, y a la transferencia de masa.
En esta prctica se pretende integrar diferentes ciencias bsicas de la ingeniera qumica
en el contexto actual de una aplicacin prctica y con un potencial de trabajo importante.
Esto con el fin de evidenciar y aplicar los conceptos de cintica qumica enzimtica,
fenmenos de transporte, diseo de reactores y anlisis qumico.
1

Km: Constante de Michaelis, Vmax: velocidad mxima de la reaccin enzimtica

Laboratorio de ingeniera de reacciones IQUI2301

201510

2. Introduccin
Los procedimientos para la deteccin de glucosa en el cuerpo se pueden clasificar en tres
categoras bsicas: mtodos de xido-reduccin, mtodos de condensacin, y mtodos
enzimticos. Los primeros aprovechan la forma eneidal de la glucosa y su alta reactividad
para oxidarla de forma rpida, usualmente en presencia de soluciones cpricas alcalinas que
se reducen a la forma cuprosa en presencia de la glucosa como agente reductor. Sin
embargo estos procedimientos son poco especficos. Los mtodos de condensacin utilizan
la glucosa y compuestos aromticos con grupos funcionales amina y fenol, en solucin
acida, cuyos productos son coloreados y permiten deteccin colorimtrica (mtodo de la otoluidina). Finalmente los mtodos enzimticos, catalizan la oxidacin de la glucosa por el
oxgeno, formando cido glucnico y perxido de hidrgeno H2O2, acoplado a una reaccin
colorimtrica para su deteccin. La tcnica utilizada en esta prctica para la cuantificacin
de la glucosa es la reaccin de Trinder, la cual se describe a continuacin:

En primera instancia la glucosa es oxidada en presencia de glucosa oxidasa formando el

cido glucnico y perxido de hidrogeno, esta reaccin es la etapa que controla el proceso y
por lo tanto la cintica de inters principal. Tan pronto como el perxido empieza a
formarse y por accin de la enzima peroxidasa, se produce la oxidacin de la o-dianisidina
que tiene una fuerte absorcin en el espectro UV-VIS con una banda principal alrededor de
545 nm. Esto permitira seguir el curso de la reaccin por espectrofotometra.

Laboratorio de ingeniera de reacciones IQUI2301

201510
Muchas de las reacciones enzimticas, incluida la que se utiliza en este laboratorio, pueden
ser planteadas a partir del siguiente mecanismo:
1

+
2

+
3

++
Donde es el sustrato, la enzima libre, el complejo sustrato-enzima, agua y el
producto.
La velocidad de reaccin para el sustrato se puede escribir de la manera:
= 1 2 [1]
Sin embargo, es muy difcil de determinar puesto que no se sabe qu tanto de la enzima
est en forma libre y que tanto en forma de complejo. Por esta razn se debe buscar una
expresin para . Para esto se utiliza la hiptesis de estado pseudo-estacionario, en donde
se puede suponer que el complejo se forma y reacciona tan rpido que su concentracin es
aproximadamente constante y por tanto su velocidad de reaccin es aproximadamente
constante, esto es:
= 1 2 3 0 [2]
De donde se despeja esta concentracin:
=

1
[3]
2 + 3

Reemplazando en la expresin [1]:

= 1 2

1
1 3
=
[4]
2 + 3
2 + 3

Se tiene otro problema y es que la concentracin de enzima libre es muy difcil de

determinar pues tambin se encuentra en su forma compleja. Sin embargo, s se puede saber
que la concentracin total de enzima (Libre y en complejo) es constante:
= + [5]
Reemplazando [3] se obtiene:
= +

1
[6]
2 + 3

Laboratorio de ingeniera de reacciones IQUI2301

201510
De donde:
=

(2 + 3 )
[7]
2 + 3 + 1

1 3
[8]
2 + 3 + 1

Sustituyendo en [4]:

Finalmente, dado que la concentracin de agua es mucho mayor que todas las dems se
puede asumir que es constante. Si definimos:
= 3 [9]
=

2 + 3
[10]
1

Se llega a la expresin cintica de la forma Michaelis-Menten y ser el modelo que debe

ajustarse a la cintica enzimtica de la oxidacin de glucosa en presencia de la enzima
glucosa oxidasa:
=

[11]
+

Una manera de poder cuantificar la concentracin de sustrato en el tiempo es a partir de la

espectrofotometra UV-vis, dado que la oxidacin de la o-dianisidina absorbe fuertemente
en el rango de los 545 nm. Se asume que la cintica de esta segunda reaccin es mucho ms
rpida que la de la primera, por lo que se puede cuantificar directamente la glucosa
consumida a partir de la formacin de la de la o-dianisidina oxidada (CDO). Adems, por
estequiometria se puede ver que la relacin es 1:1 por lo que se puede encontrar una
relacin estequiometria entre ambas concentraciones.
El modelo que se utiliza es el de Beer-Lambert:
() = [13]
Donde () es la absorbancia en el tiempo, es la absorbancia del blanco2 utilizado,
es el coeficiente de extincin de sustancia analizada, L es la longitud de la celda que
normalmente es de 1 cm y es la concentracin del producto rosado. Sin embargo,
debido a la variacin generada por las caractersticas propias de las celdas (tiempo de uso,
calidad, etc.) y la pureza de los reactivos usados se tiende a determinar experimentalmente
2

Blanco: son todas las sustancias que se encuentran en la solucin menos aquella que produce la seal
(cambio de color) a la longitud de onda del anlisis.

Laboratorio de ingeniera de reacciones IQUI2301

201510
la relacin entre la absorbancia y la concentracin de substrato. Esta grfica se determina
curva de calibracin como la mostrada en la grfica 1 y sus datos en la tabla 1.
0,4

Absorbancia (545 nm)

Curva de Calibracin

0,3

0,2

0,1

0,0
0

10

20

30

40

50

Concentracin Glucosa (mg/L)

Figura 1. Curva de calibracin para la glucosa a condiciones ambiente.

Tabla 1. Datos para la curva de calibracin de la glucosa.
Conc. Glucosa (mg/L)
Absorbancia (545 nm)
0
0,0055
5
0,1160
10
0,1880
15
0,2110
20
0,2275
25
0,2460
30
0,2725
35
0,3095
40
0,3355
45
0,3725

Desv. Estndar (545 nm)

0,0021
0,0156
0,0057
0,0099
0,0035
0,0042
0,0035
0,0007
0,0064
0,0205

Hasta el momento se ha realizado un anlisis grueso del aspecto cintico correspondiente a

las reacciones enzimticas a condiciones ideales de operacin para la enzima. Sin embargo,
en presencia de inhibidores la cintica debe ser coherentemente modificada dependiendo
del tipo de inhibicin. Con base en lo anterior, se sugiere revisar el captulo 7 del libro gua
de la clase para profundizar en estos conceptos.
3. Metodologa Experimental
La prctica se va a realizar en 2 sesiones. En la primera se espera determinar la cintica de
la oxidacin de la glucosa a dos diferentes concentraciones, la primera de 50 mg/L y otra

Laboratorio de ingeniera de reacciones IQUI2301

201510
desconocida. Adicionalmente, se deber medir el avance de la reaccin tambin con un pH
cido. En la segunda sesin, medir el avance de la reaccin a dos concentraciones
diferentes del inhibidor azida de sodio.
3.1 Influencia de sustrato y pH en la reaccin (Sesin 1)
Inicialmente, preparar el espectrofotmetro para la medicin de la absorbancia a una
longitud de onda de 545 nm y calibrndolo con la medicin de agua desionizada como
blanco, teniendo cuidado al manipular las celdas (ver video). A continuacin, adicionar en
una cubeta de 5 mL para espectrofotometra 2,7 mL de la solucin de concentracin
desconocida de glucosa y 0,3 mL del reactivo de Trinder (Manejarlo en cabina con cuidado,
es altamente txico). En caso de tener celdas de 3 mL, adicionar 1,8 mL de la solucin de
glucosa y 0,2 mL de Trinder. Inmediatamente agregado, medir la absorbancia cada 30
segundos durante 15 minutos y luego cada minuto hasta completar 30 minutos o hasta que
se estabilice la reaccin. Repetir este mismo procedimiento utilizando una solucin de 50
mg/L de glucosa y otra con la misma cantidad pero agregando 2 gotas de HCl 0,5M.
3.1 Influencia de un inhibidor (sesin 2)
En esta sesin se repetir el procedimiento de la sesin 1 agregando 2,7 mL de la solucin
de 50 mg/L de glucosa con 0,3 mL de Trinder o 1,8 mL de glucosa con 0,2 mL de Trinder,
segn el tamao de la cubeta y 0,5 mL de una solucin de NaN3 (15 ppm). Finalmente,
repetir el procedimiento agregando 1 mL de azida.
A partir de estos datos es posible ajustar una cintica de tipo Michaelis-Menten para la
reaccin enzimtica estudiada (utilizando por ejemplo la ecuacin de Lineweaver-Burke, o
el diagrama de Eadie-Hofstee, o un mtodo de regresin no lineal como el de nlinfit de
Matlab ).
4. Metodologa Bioinformtica
Durante el desarrollo experimental en el laboratorio, se debe llevar al menos 1 computador
por grupo para realizar el siguiente trabajo como apoyo a la prctica. Los resultados deben
ser enviados por correo electrnico al finalizar la segunda sesin del laboratorio y usados
en el informe de la prctica para completar el anlisis.
1) A partir de una consulta bibliogrfica, defina con sus propias palabras los siguientes
trminos:
-Aminocidos
-Protena
-Ligando
-Estructura primaria, secundaria, terciaria y cuaternaria de protenas.
-Cristalografa de Protenas

Laboratorio de ingeniera de reacciones IQUI2301

201510
-Resolucin, Valor R y R Libre en cristalografa.
-Protein Data Bank
-Archivos .pdb, .mol2
-Docking molecular
-Energa de Enlace en Docking
2) Descargar el programa UCSF Chimera
https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html.

para

visualizar

protenas

3) Descargar el archivo .pdb del Protein Data Bank para la glucosa oxidasa. Para ello
busque en la pgina glucose oxidase, de entre las opciones seleccione la que
incluya solamente la cadena A y adems los mejores parmetros de valor R, R libre
y resolucin (Estos se encuentran en la descripcin de la protena). Una vez
seleccionada descargarla (Download files > PDB Files (text)).
4) Abra el programa Chimera y cargue la estructura descargada (file > open). Tome
imgenes de la estructura en la visualizacin que considere ms explicativa
(Presents > Seleccionar algna). Seleccione los residuos no estndar y borre el resto
de la molcula:
1. select > residues > all nonstandart
2. select > invert selected mode
3. actions > atoms/ bonds > delete
4. Tomar pantallazo de la imagen y explicar la estructuras que se observan.
5) Escriba un anlisis de la protena: Nombre, tamao, aminocidos, subunidades,
estructuras (alfa hlice, lminas beta, etc.) usos, microorganismo extrado, tcnica
de anlisis usada, resolucin, valor R y R libre, caractersticas de la celda unitaria,
ligandos en el archivo, etc. Hasta este punto se debe entregar en la ltima sesin
de laboratorio.
6) Realizar el docking molecular.
1) Abrir la pgina http://www.swissdock.ch/docking
2) Cargar la protena glucosa oxidasa escribiendo el nombre en ingls en el espacio
de Target Selection.
3) Cargar el ligando escribiendo glucose y haciendo click en search. Seleccionar
alguno.

Laboratorio de ingeniera de reacciones IQUI2301

201510
7) Darle un nombre al archivo, escribir el correo de la Universidad y click en start
docking. Los resultados llegan al correo aproximadamente 2 das despus. Estar
pendiente de la carpeta de correo no deseado.
8) Realizar el docking con otro azcar y con otra clase de molcula como ligando.
9) Para el informe analizar los resultados (todos los mostrados por swiss), cules
molculas pueden servir de ligandos?, la glucosa oxidasa podra catalizar otro
azcar?
5. Resultados y Discusin
Segn los parmetros medidos en la seccin y lo trabajado en los computadores se
deben realizar los siguientes procedimientos.

Determine el impacto ambiental generado por este tipo de anlisis qumicos

(cuantificacin glucosa) y que controles se pueden generar para mitigarlo (Debe
ir en la introduccin).
Discuta los riegos a los que estaran sometidos los trabajadores responsables de
este tipo de anlisis en las diferentes industrias (Debe ir en la introduccin).
Graficar la concentracin de glucosa con respecto al tiempo utilizando la curva
de calibracin mostrada en la introduccin.
Realizar las grficas para los diagramas de: Lineweaver-Burk, Eadie-Hofstee, y
regresin no lineal (Matlab). Presentar en una tabla los parmetros cinticos
calculados por cada mtodo, comentado el modelo que mejor se ajusta a los
datos experimentales. Para esto se puede realizar una grfica comparando los
tres mtodos y analizar las diferencias encontradas segn la concentracin de
sustrato. Esto se debe realizar para la muestra de 50 mg/L y de concentracin
desconocida.
Ajustar una regresin no lineal de Matlab para determinar la cintica de la
reaccin en presencia de inhibidor, usar un modelo que incluya inhibicin.
Reportar y analizar los parmetros encontrados para los 2 experimentos con
diferente concentracin de azida de sodio.
Analizar cualitativamente el efecto que tiene la adicin de cido clorhdrico a la
reaccin.
Calcular la conversin de glucosa a cido glucnico en el tiempo para un reactor
tipo batch utilizando las mismas concentraciones que las estudiadas y los
parmetros encontrados anteriormente con y sin inhibidor (se recomienda
utilizar MatLab).

Laboratorio de ingeniera de reacciones IQUI2301

201510

A partir de los clculos realizados, determinar el efecto de la concentracin

inicial de sustrato en el tiempo para llegar a una determinada conversin y la
cantidad de producto producido, explicar.
Presentar en una tabla los resultados obtenidos experimentalmente y
compararlos con los simulados del reactor batch.
Analizar los resultados entregados por el docking.

6. Bibliografia
[1] URL: http://www.who.int/inf-fs/en/fact138.html World Health Organization Diabetes
Fact Sheet (Number 138).
[2] E. Verpoorte, Electrophoresis 23 (2002) 677.
[3] R. Kurita, K. Hayashi, X. Fan, K. Yamamoto, T. Kato, O. Niwa, Sens. Actuators B
6370 (2002) 1.
[4] J. Wang, Electrophoresis 23 (2002) 713.
[5] E. Dempsey, D. Diamond, M.R. Smyth, G. Urban, G. Jobst, I. Moser, E. Verpoorte, A.
Manz, H.M. Widmer, K. Rabenstein, R. Freaney, Anal. Chim. Acta 346 (1997) 341.
[6] T. Laurell, J. Drott, Biosens. Bioelectron. 10 (1995) 289.
[7] J. Wang, M.P. Chatrathi, A. Ibanez, Analyst 126 (2001) 1203.
[8] Y. Lv, Z. Zhang, F. Chen, Talanta 59 (2003) 571.
[9] M.G. Pollack, A.D. Shendorov, R.B. Fair, Lab on a Chip 2 (2002) 96.
[10] S-K. Cho, H. Moon, C-J. Kim, Microelectromech. Syst. 12 (2003) 32.
[11] P.Y. Paik, V.K. Pamula, M.G. Pollack, R.B. Fair, Lab on a Chip (2003) 28.
[12] P.Y. Paik, V.K. Pamula, R.B. Fair, Lab on a Chip 3 (2003) 253.
[13] V. Srinivasan, V.K. Pamula, M.G. Pollack, R.B. Fair, Technical Digest IEEE MEMS,
2003, p. 327.
[14] P. Trinder, Ann. Clin. Biochem. 6 (1969) 24.