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DOI: http://dx.doi.org/10.3926/oss.1
ISBN versin on-line: 978-84-694-9599-5
ISBN versin impresa: 978-84-940234-1-5
DL: B-17470-2012
Diseo portada y contraportada: OmniaScience
Fotografa portada: Kts | Dreamstime.com
ndice
PRESENTACIN
CAPTULO 1
FLORA GENITAL NORMAL
1.1
FLORA NORMAL DE LA VAGINA
1.2
FLORA NORMAL DE LA URETRA
CAPTULO 2
INFECCIONES GENITALES Y AGENTES ETIOLGICOS
2.1
ESTADO DE PORTADORA
2.2
PATOLOGAS
2.2.1 Uretritis
2.2.2 Cervicitis
2.2.3 Enfermedad inflamatoria plvica (EIP)
2.2.4 Prostatitis, orquitis, epididimitis
2.2.5 Vaginitis y vaginosis
2.2.6 lceras
2.2.7 Verrugas genitales: Condilomas acuminados
2.2.8 Balanitis
CAPTULO 3
TOMA DE MUESTRAS
CAPTULO 4
DIAGNSTICO MICROBIOLGICO DIRECTO
4.1
VISUALIZACIN DIRECTA
4.1.1 Fresco
4.1.2 Sedimento urinario
4.1.3 Tincin de Gram
4.1.4 Microscopio campo oscuro
4.1.5 Tincin de Giemsa
4.2
CULTIVO
4.2.1 Siembra
4.2.2 Evaluacin del crecimiento
4.2.3 Pruebas complementarias
4.2.4 Antibiogramas
4.2.5 Cultivo de trichomonas
4.2.6 Cultivo mycoplasmas y ureaplasmas
4.3
PRUEBAS DE DETECCIN RPIDA DE ANTGENO
4.3.1 Frascos con orina y torundas de alginato clcico o dacrn sin medio de transporte
con exudados genitales
4.3.2 Torunda de dacrn con medio de transporte especfico
4.4
TCNICAS DE BIOLOGA MOLECULAR
4.4.1 Frascos de cultivo para anaerobios y aerobios con aspirado lquido de rganos
internos
4.4.2 Frascos con orina y torundas de alginato clcico o dacrn sin medio de transporte
con exudados genitales y/o ETS
4.4.3 Torunda de alginato clcico o dracn en tubo affirm VPIII
4.4.4 Torunda de dacrn con medio de transporte especfico
CAPTULO 5
DIAGNSTICO MICROBIOLGICO INDIRECTO: SEROLOGA
5.1
HERPES
5.2
TREPONEMA PALLIDUM
CAPTULO 6
INFORME DE LOS RESULTADOS
CAPTULO 7
BIBLIOGRAFA
SOBRE LOS AUTORES DEL LIBRO
SOBRE EL REVISOR DEL LIBRO
ndice de tablas
Tabla 1. Diagnstico diferencial de Vaginitis y Vaginosis. Test de Amsel
Tabla 2. Resumen de los Procedimientos microbiolgicos de Toma de muestra y Transporte en
infecciones genitales y/o ETS
Tabla 3. Clculo de Nugent Score
Tabla 4. Api 20 A
Tabla 5. Api NH
Tabla 6. Interpretacin de Sensibilidades para N. gonorrheae
Tabla 7. Interpretacin de Sensibilidades para Haemophilus
Tabla 8. Galera de Mycoplasma y Ureaplasma
Tabla 9. Recuento en placa de Mycoplasma y Ureaplasma
Tabla 10. Sensibilidad de las pruebas serolgicas frente al T. pallidum en funcin de las etapas de
evolucin de la sfilis
Tabla 11. Resumen de los procedimientos especficos del Laboratorio de Microbiologa para las
muestras de infecciones genitales y/o ETS
Tabla 12. Interpretacin de Nugent Score
Tabla 13. Interpretacin de los resultados serolgicos de la Sfilis: Diagnstico y seguimiento del
tratamiento
ndice de ilustraciones
Ilustracin 1. Toma de muestras genitales con torunda: A) del fondo del saco vaginal; B) de la
uretra masculina)
Ilustracin 2. Siembra para aislamiento en placa
Ilustracin 3. Siembra semicuantitativa en placa
Ilustracin 4. Fundamento de la tcnica Inmunocromatografa directa
Presentacin
Presentacin
Las enfermedades microbiolgicas que afectan a las reas genitales son de gran importancia por
su implicacin en la transmisin materno-fetal y en las enfermedades infecciosas de transmisin
sexual. Se estima que en Espaa un 3 de los recin nacidos podran infectarse por el
Streptococcus agalactiae si no se adoptaran medidas preventivas y se sabe que las infecciones
de sfilis y gonococia han incrementado su incidencia en los ltimos aos. Es por ello que se ha
incorporado de forma sistemtica en el seguimiento del embarazo el despistaje de la
colonizacin vagino-rectal y ha aumentado notablemente la demanda en el diagnstico de
infecciones de transmisin sexual.
En cuanto al Laboratorio de Microbiologa, el hecho de que la gran mayora de los
procedimientos sean manuales hace que se requieran habilidades tcnicas y estn siempre
sujetos a la interpretacin subjetiva del facultativo. Por otra parte, los mtodos de diagnstico
directo en microbiologa estn experimentando un gran avance hacia una mayor rapidez, y
eficiencia.
El objetivo de este manual es actualizar los conocimientos clnicos, analticos y tcnicos, y
adiestrar en los procedimientos de diagnstico microbiolgico de las enfermedades genitales
infecciosas o relativas a la flora comensal (por colonizacin o alteracin), con el fin ltimo de
ayudar a la prevencin, diagnstico y seguimiento de las enfermedades infecciosas de trasmisin
materno-fetal y sexual, y con ello disminuir la morbilidad y mortalidad asociadas y los costes
derivados de ellas.
Va dirigido al personal en formacin y a profesionales del mbito sanitario, principalmente del
laboratorio (tcnicos y facultativos) pero tambin a los clnicos (mdicos y enfermeros). Recorre
por tanto las reas asistenciales de atencin primaria y especializada (gineclogos, urlogos,
dermatlogos), toma de muestras, y las distintas reas del laboratorio de microbiologa.
Para la elaboracin del manual nuestro grupo de trabajo ha realizado una revisin completa y
actualizada de las enfermedades microbiolgicas genitales sobre la que ha desarrollado unos
Procedimientos de Laboratorio de Microbiologa de forma detallada y esquematizada, de cada
uno de los pasos del proceso analtico: toma de muestras y recepcin, procesamiento e informe
de laboratorio.
Abril de 2012
Captulo 1
Captulo 2
2.2 Patologas
Las vulvovaginitis constituyen las infecciones genitales ms frecuentes, de las cuales el 90% son
de etiologa candidisica, vaginosis bacteriana, tricomoniasis y etiologa mixta (candidiasis y
tricomoniansis o vaginosis bacteriana o ambas). Las causas no infecciosas incluyen vaginitis
Otros agentes de ITS son el poxvirus causante del molluscum contagiosum, y algunos
ectoparsitos (sarna y ladillas). De todas ellas tan slo nos vamos a ocupar en este manual de
aquellas ms frecuentes y que afectan a los rganos genitales.
2.2.1 Uretritis
Concepto
Se define como el sndrome caracterizado por aparicin de corrimiento uretral, en general
mucopurulento, con disuria o prurito en el meato urinario, como respuesta de la uretra a una
inflamacin de cualquier etiologa. Las causas de este sndrome en general son infecciosas y de
transmisin sexual, existiendo, sin embargo, tambin otras: qumicas, microtraumatismos,
hipersecrecin glandular que puede dar lugar a dificultades diagnsticas. En base a su evolucin
se pueden clasificar en aguda, persistente o recurrente. En base a su etiologa en gonoccica,
postgonoccica, no gonoccica (C. trachomatis, U. urealyticum, M. genitalium, Trichomonas
vaginalis, Herpes, etc.) y de etiologa desconocida. La incidencia de las diferentes etiologas
variar en nuestro medio de acuerdo al nivel sociocultural, existiendo predominio en poblacin
de bajos recursos de uretritis gonoccica. Es importante resaltar la frecuente asociacin de N.
gonorrhoeae y C. trachomatis (20%).
Uretritis gonoccica
Es causada por Neisseria gonorrhoeae. Destacamos que es una bacteria extremadamente
exigente, tanto desde el punto de vista nutricional como atmosfrico, y en su labilidad frente al
ambiente, caractersticas fundamentales a tener en cuenta para su diagnstico.
Clnica
Despus un perodo de incubacin de dos a siete das aparece secrecin mucopurulenta con
disuria, que evoluciona a la resolucin en seis meses, pero con elevada incidencia de
complicaciones y de portadores asintomticos prolongados. La prevalencia de estos ltimos es
del orden del 1%, siendo fundamentales en la transmisin de la infeccin. Sus cepas
corresponden generalmente a los auxotipos AXU.
Uretritis no gonoccica
Este sndrome es producto de infecciones por diferentes patgenos como Chlamydia
trachomatis, Ureaplasma urealyticum, M. genitalium, Trichomonas vaginalis, Herpes genital,
Gardnerella vaginalis, Candida albicans, E. coli, Staphylococcus saprophyticus, H. influenzae, H.
parainfluenzae, Pasteurella bettyae, S. agalactiae, raro: N. meningitidis, Adenovirus. Por
frecuencia destacaremos los dos primeros.
Etiologa
Chlamydia trachomatis
Es una bacteria de pequeo tamao de pared similar a las bacterias gramnegativas, que contiene
antgenos tiles para su diagnstico. Son parsitos intracelulares estrictos que necesitan clulas
huspedes para su multiplicacin. Pertenece a la familia Chlamydiaceae, junto con C. psittaci y C.
pneumoniae, dos especies causantes de otras patologas. Se clasifica en diferentes serotipos
antignicos segn sus protenas de membrana. Los que se denominan de la D a la K son los
causantes de uretritis y cervicitis; los L1, L2 y L3 del linfogranuloma venreo (otra rara patologa
de transmisin sexual).
Ureaplasma urealyticum
Es una bacteria pequea sin pared celular, muy exigente nutricionalmente (esteroles, etc.), lo
que dificulta su cultivo. Pertenece al gnero Ureaplasma integrante de la familia
Mycoplasmaceae.
Clnica
La uretritis no gonoccica se caracteriza por la presencia de una secrecin mucopurulenta o
serosa, clara, matinal, en general sin ardor miccional, con un perodo de incubacin de 4 a 15
das. Pueden presentarse infecciones asintomticas, complicaciones como prostatitis,
epididimitis y localizaciones extragenitales, principalmente en el caso de C. trachomatis.
Uretritis postgonoccica
Se denomina uretritis postgonoccica a aquellas que observamos luego del tratamiento con
antibiticos que cubren exclusivamente a N. gonorrhoeae. Es generalmente causada por C.
trachomatis y U. urealyticum, siendo producto de una infeccin originalmente mixta por N.
gonorrhoeae y alguno de estos grmenes. La teraputica es similar a la mencionada
anteriormente.
Uretritis recurrente o persistente
Se observa postratamiento de uretritis no gonoccica, fundamentalmente cuando en un inicio
no se evidenci germen causal alguno (uretritis de origen desconocido), tambin en casos de
uretritis por Ureaplasmas resistentes a tetraciclinas (10%). Se debe plantear la posibilidad de
encontrarnos frente a una prostatitis. El tratamiento se realiza repitiendo el inicial pero durante
15 a 21 das; si el cuadro persiste debe investigarse prostatitis o infeccin por Trichomonas.
2.2.2 Cervicitis
Concepto
Al ser el crvix un rgano que responde a los cambios hormonales, sus caractersticas varan con
la edad, embarazo, toma de anticonceptivos orales (ACO), etc. Estos cambios afectan su
anatoma y su susceptibilidad a la infeccin por patgenos cervicales. La cervicitis
mucopurulenta es el equivalente de la uretritis masculina, y ocupa un lugar importante en las
infecciones de transmisin sexual en la mujer. Su diagnstico y tratamiento no solo importan
para el control de las ITS, sino tambin para prevenir complicaciones frecuentes como
enfermedad inflamatoria plvica (EIP), parto prematuro, infeccin puerperal y neonatal y
neoplasia cervical.
Etiologa
Los grmenes ms frecuentemente involucrados en infecciones del endocrvix son C.
trachomatis, N. gonorrhoeae, plantendose tambin como probable patgeno Mycoplasma
genitalium. Dentro de las etiologas raras se encuentran el Herpes genital y Trichomonas
vaginalis, afectando esta ltima principalmente al exocrvix. An menos frecuentes son las
causadas por Capnocytophaga spp., Pasteurella bettyae, Mycobacterium tuberculosis,
Streptococcus agalactiae. Debemos destacar que gran parte de las cervicitis son de carcter
inflamatorio, no infeccioso, dado por agresin del pH vaginal, displasias, etc.
Clnica
El diagnstico clnico de cervicitis mucopurulenta se establece por la presencia de un exudado
mucopurulento endocervical, acompaado por edema y eritema de la mucosa, la cual sangra
fcilmente al tacto.
2.2.3 Enfermedad inflamatoria plvica (EIP)
Concepto
Este trmino comprende las infecciones que afectan los diferentes rganos pelvianos
(salpingitis, endometritis, peritonitis plvica).
Etiologa
Dentro de los agentes causantes de EIP se encuentran patgenos de transmisin sexual como C.
trachomatis, N. gonorrhoeae, M. genitalium, solos o asociados, y otros integrantes normales de
la flora vaginal como E. coli, Streptococcus spp., anaerobios como Bacteroides spp. y
Peptostreptococcus spp., en general asociados. Otros microrganismos que tambin se han
aislado son Actinomyces spp., Enterococcus spp., H. influenzae, Pasteurella bettyae, Prevotella
bivia, Mycoplasma hominis ,S. aureus, S. epidermidis, y S. agalactiae.
Patogenia
Segn el origen de los microrganismos involucrados se dividen en exgenos (en su mayora de
transmisin sexual) y endgenos (flora vaginal). La va de diseminacin es la ascendente desde el
crvix (complicacin de cervicitis) o la vagina. Existen factores de riesgo para que este sndrome
ocurra: la cervicitis por N. gonorrhoeae o C. trachomatis, mltiples parejas sexuales, uso de DIU y
la edad (los jvenes constituyen el principal grupo de riesgo).
Clnica
El diagnstico clnico muchas veces es dificultoso por presentar sintomatologa inespecfica. Con
el fin de estandarizar el diagnstico se manejan criterios primarios (abdomen inferior doloroso,
movilizacin dolorosa del 9ancro, dolor de anexos) y criterios secundarios (fiebre de 39C),
leucocitosis mayor de 10.000, VES mayor de 15mm/hora, aislamiento de N. gonorrhoeae o C.
trachomatis en el crvix). El diagnstico se realiza con la presencia de los tres primarios ms
alguno de los secundarios.
2.2.4 Prostatitis, orquitis, epididimitis
Etiologa
La prostatitis por lo regular es causada por una infeccin bacteriana de la glndula prosttica. El
agente causal generalmente es cualquiera que pueda producir una infeccin urinaria:
enterococos, E. coli, K. pneumoniae, P. mirabilis, P aeruginosa, S. aureusTambin pueden
producir prostatitis aguda, epididimitis y orquitis la Chlamydia, N. gonorrheae, trichomonas, U.
urealyticum.
Clnica
Lo ms probable es que los sntomas de la prostatitis aguda comiencen rpidamente y que
causen mayor molestia: dolor abdominal, disuria, fiebre, retencin urinaria, lumbago, dolor en la
eyaculacin y perineal. Durante el examen fsico, el mdico puede encontrar los siguientes
signos: secrecin de la uretra, agrandamiento o sensibilidad en los ganglios linfticos inguinales,
inflamacin o sensibilidad en el escroto, y la prstata inflamada, dura, caliente o sensible.
2.2.5 Vaginitis y vaginosis
Dentro de las infecciones vaginales destacamos que la nica que constituye ITS es la vaginitis por
Trichomonas vaginalis.
El flujo vaginal constituye uno de los motivos de consulta ms frecuente de las mujeres en edad
reproductiva. Entendemos por flujo al aumento permanente de los trasudados y exudados de
causa fisiolgica o patolgica, que se objetivan por la paciente o por el examinador. El flujo
9
fisiolgico es producto de los cambios hormonales del ciclo, y contiene escasa cantidad de
leucocitos. La leucorrea puede deberse a infeccin vaginal o cervical.
Vaginitis
Concepto y etiologa
Denominamos vaginitis a la infeccin vaginal con respuesta inflamatoria caracterizada por la
presencia de abundantes polimorfonucleares en el extendido teido con tincin de Gram.
Dentro de los agentes ms frecuentes se encuentra Candida albicans (levadura que integra la
flora vaginal normal). Trichomonas vaginalis (protozoario flagelado), tambin es un agente
causal, pero menos frecuente. Ms raras son las infecciones por Actinomyces spp.,
Capnocytophaga spp., Bacteroides spp., enterobacterias, Eubacterium nodatum, M. tuberculosis,
N. meningitidis, Pasteurella bettyae, Prevotella bivia, P. disiens, Prevotella spp.,
Peptostreptococcus spp., S. aureus, S. pyogenes, VHS, C. diphtheriae. (ver Tabla 1)
La vulvoganitis sin sangrado en la nias, puede ser causada por bacterias implicadas en
infecciones respiratorias (Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Neisseria
meningitidis, Staphyloccus aureus, Branhamella (Moraxella) catharralis, Haemophilus
influenzae) o por enterobacterias (Shigella, Yersinia). En caso de haber sufrido abuso sexual
habra que descartar los patgenos de vulvovaginitis en mujeres.
Clnica
o
El flujo causado por Candida sp. es de color blanquecino, grumoso (leche cortada), no
oloroso, se manifiesta en conjunto con prurito vaginal y tiene pH cido. Puede
presentarse conjuntamente con la flora habitual (lactobacilos).
Vaginosis
Concepto y etiologa
La bacteriana vaginosis constituye una entidad caracterizada por un cambio en la microecologa
de la vagina caracterizada por la disminucin o ausencia de lactobacilos con presencia de
Gardnerella vaginalis (cocobacilo Gram negativo) asociada a bacterias anaerobias como
Mobiluncus sp., Peptococcus sp. , Bacteroides sp. M. hominis, Prevotella spp., Atopium vaginae
Se diferencia de la vaginitis en la ausencia de respuesta inflamatoria, o sea en la ausencia de
polimorfonucleares. (Tabla 1)
Clnica
o
Normal
Flujo vaginal
Test aminas (olor)
3,8 4,2
Blanco, fino,
friable
Ausente
Lactobacillus
Clulas
epiteliales
Observacin
microscpica
Vaginosis
Garnerella
>4.5
Blanco grisceo,
cremoso, fino
Pescado
Clulas gua,
cocobacilos
Gram variable.
No leucocitos
Vaginitis
Trichomonas
4.5
Amarillo, verdoso
espumoso
Pescado
Vulvovaginitis
Cndida
<4.5
Blanco cortado,
requesn
Ausente
Trichomonas.
Levaduras,hifas y
Leucocitos>10/campo pseudohifa.
Leucocitos>4/campo
Animaciones recomendadas:
http://emprocedures.com/obgyn/wetprep/procedure.htm
http://emprocedures.com/obgyn/wetprep/analysis.htm
Sfilis
Etiologa
Es una infeccin sistmica de evolucin crnica producida por Treponema pallidum. Esta
bacteria forma parte del gnero Treponema, familia Spirochaetaceae; es una bacteria larga, de
forma helicoidal, que se visualiza en microscopio con campo oscuro. Esta bacteria se incurva
formando 4 a 14 espirales, y posee un movimiento en sacacorchos. Es anaerobia estricta, y hasta
ahora no ha podido ser cultivada.
Patogenia
Esta enfermedad presenta un perodo de incubacin de 9 a 90 das con una media de 21 das,
seguido de una lesin primaria o chancro con linfadenopata regional y un perodo secundario
bacterimico asociado a lesiones maculopapulares y linfadenopatas generalizadas.
Posteriormente existe un perodo de latencia de varios aos y, finalmente, un 30% a 50% de los
casos no tratados presentan un perodo terciario caracterizado por destruccin mucocutnea,
lesiones parenquimatosas, aortitis y enfermedades del sistema nervioso central. T. pallidum se
une a las clulas en la puerta de entrada dando una lesin primaria y se disemina por la sangre.
La lesin primaria se produce por la enzima mucopolisacaridasa que degrada el espacio
intercelular del endotelio capilar, generando una endarteritis obliterante con necrosis y
ulceracin. El husped responde con un infiltrado linfocitario y de clulas plasmticas. La mayor
parte del dao se debera a inmunocomplejos, que determinaran la respuesta inflamatoria
lesiva.
Inmunidad humoral
Se estimula precozmente y se mantiene con las lesiones del secundarismo.
o
12
Inmunidad celular
Se encuentra deprimida en la primoinfeccin y el perodo secundario, recuperndose
postratamiento.
Clnica
Se puede dividir en dos etapas: la llamada sfilis precoz, hasta los dos aos postinfeccin, y la
sfilis tarda, a partir de los dos aos. La primera se caracteriza por curarse fcilmente, ser
contagiosa por transmisin sexual y por va trasplacentaria. La sfilis tarda presenta lesiones
crnicas, difciles de curar y, en general, no se transmite por contagio sexual.
Sfilis precoz
o
Sfilis tarda
Corresponde al periodo terciario o final. Se caracteriza por la aparicin de lesiones
cutaneomucosas, llamadas gomas (ndulos de piel que se ulceran), lesiones seas (periostetis),
lesiones cardiovasculares (aortitis) y lesiones neurolgicas como tabes dorsal y meningitis
meningovascular (ms frecuentes en VIH (+).
13
Herpes genital
Etiologa
Es una de las ITS de etiologa viral ms frecuente, con aumento de su incidencia en los ltimos
tiempos. La imposibilidad de su erradicacin por tratarse de una infeccin persistente con
frecuentes recidivas y el riesgo de contagio fetal en el canal de parto, justifican su importancia y
la preocupacin por su control.
El agente Herpes Virus simplex tipo II y tipo I (agente del herpes labial) pertenece a la familia
Herpesviridae y a la subfamilia Alphaherpesvirinae; es un virus que contiene ADN.
Patogenia
Presenta cinco fases: infeccin primaria mucocutnea, infeccin ganglionar aguda, latencia,
reactivacin e infeccin recurrente.
La infeccin se inicia con la exposicin al virus, la inoculacin con participacin de clulas
epiteliales, la replicacin viral con lisis celular, la rpida respuesta inflamatoria y la posterior
diseminacin del virus por nervios sensitivos o autnomos hasta los ganglios regionales (sacros).
Tambin se puede diseminar por contigidad, extendindose las lesiones cutneas. En los
ganglios se produce una etapa de latencia que persiste toda la vida, con reactivaciones por
estmulos de piel (sol, traumatismos, qumicos) y centrales (coito, menstruacin, estrs,
infecciones).
Clnica
Se plantean dos situaciones:
o
Primoinfeccin herptica con lesiones de piel, sin antecedentes del mismo tipo y
sin anticuerpos contra el virus.
14
Los tipos de alto riesgo seran 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68 y 70.
Dentro de los de alto riesgo existen algunos tipos que se asocian ms frecuentemente
con lesiones precursoras (lesiones intraepiteliales escamosas) que con cncer,
algunos autores se refieren a ellos como de riesgo intermedio. Se asocia a una
variedad de condiciones clnicas, que van desde lesiones inocuas cutneas como
pueden ser las verrugas, hasta el cncer.
La relacin entre HPV y cncer de cuello uterino fue puesta de manifiesto a principio de los aos
80 por Harold zur Hausen, sabiendo desde entonces que su asociacin era ms fuerte an que la
del tabaco con el cncer de pulmn. Actualmente se sabe que 99% de los cnceres escamosos
de cuello uterino vienen determinados por HPV, est presente en un 89% de las pacientes
menores de 40 aos con adenocarcima de cuello uterino y en un 43% de las mujeres mayores de
60 aos con igual diagnstico.
15
Clnica
Infeccin asintomtica: piel y mucosas sanas.
Lesin: aparecen masas carnosas y vegetantes en forma de crestas localizadas en zonas
hmedas genitales, pudiendo aparecer como papilas ssiles. Aumenta su tamao con el
embarazo y la disminucin de la inmunidad celular (VIH +).
Infeccin subclnica: no existe lesin macroscpica, el diagnstico se plantea por colposcopia con
cido actico al 3% y penescopia con el mismo mtodo y posterior biopsia de los sectores
afectados.
2.2.8 Balanitis
Concepto
La balanitis es definida como una inflamacin del pene, que involucra al prepucio
(balanopostitis). Hay una amplia variedad de causas, pero la infeccin es la etiologa ms comn.
Etiologa
Cndida albicans y otras levaduras son las responsables de cerca del 35% de todos los casos de
balanitis infecciosa, la mayora de las veces adquirida por va sexual. Los factores predisponentes
a la candidiosis genital masculina incluyen a la diabetes mellitus, inmunosupresin y la no
circuncisin. El ltimo factor parece ser uno de los factores predisponentes mayores para
balanopostitis.
Las bacterias representan la segunda causa ms frecuente de balanitis infecciosa: Streptococcus
agalactiae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas, Gardnerella vaginalis, anaerobios, Treponema
pallidum, Chlamydia tracomatis y Micoplasma han sido causas de balanitis. Causas menos
comunes de balanitis son las virales y parasitarias.
Clnica
El diagnstico de balanitis se establece en base a la presencia de eritema en parches o
generalizado con o sin erosiones en el pene o debajo del prepucio, con o sin exudado
subprepucial.
16
Toma de muestras
Captulo 3
Toma de muestras
Respecto a la transmisin materno fetal, para detectar las madres portadoras del EGB debe
efectuarse un cultivo tomando un escobilln vaginal y otro ano-rectal (o un escobilln vaginorectal).
En las ITS se deben siempre tener presentes los principios generales de la recogida de muestras
y especficamente los que se aplican a las muestras genitales:
o
En las infecciones por anaerobios en cavidades cerradas las muestras se deben tomar,
si es posible, por puncin percutnea-aspiracin, empleando las medidas de
17
Ante la sospecha de una ITS, se deben examinar todas las posibles vas de contagio
(genital, oral y anal) y en el caso de que existan zonas afectadas o posibilidad, tomar
muestras de dichas zonas. Adems, dependiendo de la enfermedad de la que se
sospeche, rastrear otros rganos a los que pueda afectar la enfermedad; as, en el
caso de neurosfilis, tomar muestra del lquido cefalorraqudeo.
Ilustracin 1. Toma de muestras genitales con torunda: A) del fondo del saco vaginal; B) de la
uretra masculina
Animacin recomendada:
http://emprocedures.com/obgyn/wetprep/procedure.htm
Toma de muestras
Origen de
muestra
Uretra:
exudado
Mtodo
Recipiente
2C-8C
1 torunda
en 10B o SP-4
para Ureaplasma
Mycoplasma
2C-8C
2C-8C
Vial en anaerobiosis
2 torundas con Stuart-Amies:
porta/cultivo Gonococo
Quirrgico
35 C
Frascos de anaerobio/aerobio
EPI: lquido o
exudado
Epiddimo y
testculo
Temperatura
37C
T ambiente
35C
2C-8C
2C-8C
Vagino-rectal:
exudado
2C-8C
2C-8C
35C
19
Origen de
muestra
Vagina:
exudado
Vulva
(labios y
glndulas De
Bartolino y
Skene)
Rectal: exudado
Faringeo:
exudado,
lceras.
Mtodo
Recipiente
Temperatura
35C
37C
T ambiente
2C-8C
T ambiente
35 C
2C-8C
37C
2C-8C
35C
2-8C
35C
T ambiente
2C-8C
T ambiente
2C-8C
2C-8C
Captulo 4
leucocito y con presencia de flagelos, con forma de pera, y con el caracterstico movimiento
rotatorio sobre su eje, vacilante, y a veces en espasmos.
Video recomendado:
http://www.microbiologybytes.com/video/Trichomonas.html
Centrifugacin: 5 minutos, a 450 fuerza centrfuga relativa FCR, que viene a equivaler
a unos 1500 r.p.m., dependiendo del radio de cada centrfuga.
Examinar primero con el objetivo de 10x para los elementos formes grandes, vg:
cilindros y clulas renales.
Con el objetivo de 40x se observan los elementos formes pequeos, que es donde se
ha de hacer el recuento: leucocitos, hemates, clulas descamativas y cristales. Bajo
este aumento es donde se ha de valorar tambin la bacteruria y parsitos.
Para el estudio de rutina utilizar luz central, amortiguada, lo que se logra con facilidad
descendiendo el condensador de la mayora de los microscopios. La iluminacin
oblicua, producida al hacer oscilar ligeramente el espejo fuera del eje ptico, se
puede utilizar para la identificacin de elementos delicados, por ejemplo, cilindros
hialinos. (La iluminacin adecuada es crucial para obtener resultados exactos).
Valoracin
En caso de Uretritis y Prostatitis la presencia de ms 10 PMN por campo, (x40), en el sedimento
de la orina, ser indicativo de probable infeccin bacteriana.
22
La presencia de Trichomonas se determina por centrifugado del primer chorro de orina matinal,
observando su movilidad en el sedimento. Esta tcnica es poco sensible, con muchos falsos
negativos.
4.1.3 Tincin de Gram
Tcnica
Primero se ha de hacer una impronta sobre un portaobjetos, utilizando: si es para anerobios,
una gota del aspirado o una de las torundas con medio de anaerobios; y si es para aerobios, una
de las dos torundas de alginato clcico o dacrn con el medio de transporte Amies, que se haya
enviado al laboratorio, con el exudado correspondiente. Dejar secar.
A posteriori se proceder a la tincin, con la siguiente secuencia:
1.
El frotis fijado con calor se tie un minuto con cristal violeta, se lava con agua.
2.
Se cubre con solucin yodada durante un minuto y se lava de nuevo con agua .
3.
4.
Cubrir con safranina (color de contraste) durante veinte segundos. Lavar y secar.
23
El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento con yodo. El yodo
por s solo tiene poca afinidad con las clulas.
2.
La decoloracin debe realizarse con poca agua para evitar que pierdan la tincin
las clulas grampositivas. El proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial
un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios.
3.
4.
Valoracin
Se debe observar con el objetivo de x100 con aceite de inmersin, durante al menos 2 minutos.
o
Exudado vaginal:
-
25
Lactobacilli,
Bacilo
grampositivo
30
5-30
1-4
<1
0
SCORE
Gardnerella,
Bacteroides
cocobacilo Gram variable
SCORE
0
1
2
3
4
0
<1
1-4
5-30
30
0
1
2
3
4
Mobiluncus sp
Bacilos
gramnegativos
curvados
0
<1
1-4
5-30
30
SCORE
SUMA
SCORE
0
1
1
2
2
0
3
5
8
10
Valoracin
Una buena tincin permitir observar las clulas de los siguientes colores: Citoplasma-rosa;
Ncleos-azul; Eritrocitos-rosa-naranja; Grnulos de PMN: prpura; Bacterias y Parsitos-azul.
Buscaremos la presencia de los Cuerpos de Donovan, que son inclusiones de la Klebsiella
granulomatis con localizacin intracitoplasmtica en las grandes clulas mononucleares e
histiocitos. Las clulas mononucleares tienen un dimetro entre 25-90 m, mientras que las
dimensiones de los cuerpos de Donovan son de 0,5-0,7 por 1-1,5 m y pueden estar
encapsulados o carecer de cpsula.
Ilustraciones recomendadas:
http://www.infocompu.com/adolfo_arthur/granuloma_venereo.htm
4.2 Cultivo
En la seccin de siembra del Laboratorio de Microbiologa se procede al cultivo de las muestras
en funcin del contenedor y origen de la muestra.
Cultivos convencionales
4.2.1 Siembra
A) Vial en atmsfera anaerobia o torunda con medio transporte de anaerobios, con aspirado
de glndulas genitales y/o ETS
Mtodo de siembra
La muestra se procesa antes de 15 minutos desde su recepcin y si es posible, en una cmara de
anaerobiosis.
o
Aspirado: El material purulento se mezcla bien con la ayuda del agitador Vortex.
27
Una vez homogeneizada la muestra, depositar 1 gota del pus, o 2-3 gotas si es lquido, en cada
uno de los medios de cultivo (para extender con estras por agotamiento), una gota en un
portaobjetos para la tincin de Gram y el resto en el medio de enriquecimiento.
Medios de cultivo
La mayora de estas bacterias requieren para su crecimiento vitamina K1 y hemina. Para su
aislamiento e identificacin presuntiva se aconseja utilizar una combinacin:
Medios enriquecidos: agar Brucella o agar Schaedler, y caldo de tioglicolato.
Medios selectivos: Agar con alcohol fenil-etlico (PEA), agar Brucella o agar Schaedler con
antibiticos.
Medios selectivos y diferenciales: Agar Bacteroides bilis esculina con amicacina (BBE).
Las placas se han de incubar en atmsfera anaerobia, a 35-37 C, hasta las 24h (cmaras) o 48h
(jarras o bolsas), mientras que el medio lquido de enriquecimiento entre 7 y 10 das.
B) Frascos de cultivo para anaerobios y aerobios con aspirado lquido de rganos internos
Los lquidos corporales habitualmente estriles, como asctico, amnitico, etc. se inoculan en
frascos de hemocultivo para aerobios y anaerobios, reservando un pequeo volumen para hacer
una tincin de Gram. A diferencia de otros lquidos, el amnitico y los lquidos obtenidos por
culdocentesis no necesitan centrifugarse antes de realizar esta tincin.
Se recomienda incubar los frascos durante un perodo de 5 a 7 das. La temperatura ptima de
incubacin es de 35 a 37C.
C) Torunda alginato clcico o dacrn en medio Stuart-Amies con exudados genitales y/o de ETS
Mtodo de siembra
Con estras por agotamiento, para aislamiento (ilustracin 2):
o
Paso 1: Hacer rotar la torunda varias veces en uno de los cuadrantes de la placa, cerca
del borde de la placa.
Paso 2, 3, 4: Con un asa estril realizar estras desde la zona de la descarga por el
resto de los cuadrantes de las placas, cada vez cogiendo una porcin del inoculo
menos denso.
Paso 5: Algunos laboratorios recomiendan pinchar el agar sangre con el asa despus
de haber rayado la placa, para favorecer la produccin de hemlisis.
28
Agar Sangre: es un medio general enriquecido con 5% sangre, para el crecimiento y aislamiento
de la mayora de las bacterias patgenas y de algunos hongos. Sirve de ayuda para definir las
propiedades hemolticas de los Streptococos. Se ha de incubar a 35C 2C hasta las 24h.
Agar Chocolate: como el agar sangre pero enriquecido con sustancias nutritivas y calentado
hasta liberar el grupo hemo. Promueve el crecimiento de algunas bacterias de desarrollo difcil,
vg: Neisseria o Haemophilus. Incubar a 35C 2C en atmsfera enriquecida al 5% de CO 2, y
examinar cada 24h hasta las 48 horas.
Agar Thayer Martin, Martin Lewis o New York City: medios selectivos por la adicin de
antibiticos, para el crecimiento y aislamiento del gonococo. Se ha de incubar en ambiente
hmedo y con 5% de CO2 a 35C 2C. Ha de examinarse cada 24h hasta las 72 horas.
Agar Sabouraud: medio selectivo por su mnima cantidad en nutrientes y pH bajo, adecuado
para el crecimiento y aislamiento de levaduras y hongos superiores. Incubar a 30C 2C
examinarse cada 24h, hasta las 48h.
Agar CNA: medio selectivo por la adicin de antibiticos para el crecimiento de los grampositivos
y al igual que el agar sangre sirve para definir las propiedades hemolticas de los estreptococos.
A 35C 2C durante 24h.
29
Una vez tomada la muestra se lleva en todo su volumen a la superficie del agar CLED
haciendo una estra a travs del centro.
su baja concentracin de electrolitos inhibe el swarming del Proteus spp. Ha de ser incubado a
35-37C en atmsfera aerbica y leerse a las 18-24 horas.
Agar Sangre: ya hemos descrito sus caractersticas en la siembra de los hisopos. En las orinas se
siembra en estras por agotamiento, para aislar las colonias.
4.2.2 Evaluacin del crecimiento
A) Placas de agar en anaerobiosis de aspirado de glndulas genitales y/o de ETS
Los medios con crecimiento deben observarse cuidadosamente para detectar todas las colonias
diferentes, independientemente de su tamao, y proceder a su subcultivo, cada una de ellas se
ha de reaislar en: agar Brucella (anaerobiosis), agar chocolate y agar sangre (ambas en
aerobiosis con 10% de CO2). Las colonias subcultivadas que no crezcan en agar chocolate ni agar
sangre se consideraran en principio anaerobios estrictos y se procede a su estudio. Igualmente
del tioglicolato se deben realizar subcultivos si se aprecia turbidez u otro signo de crecimiento.
B) Frascos de cultivo para anaerobios y aerobios con aspirado lquido de rganos internos
La lectura se realiza diariamente durante 7 das. En el caso de que haya crecimiento, se extrae
una muestra del frasco aerobio mediante jeringa y aguja para realizar tincin de Gram y
subcultivos en medios slidos para aerobios y facultativos (agar sangre, agar chocolate, agar CNA
y agar MacConkey, por ejemplo). Del frasco anaerobio se hacen subcultivos en agar sangre, agar
chocolate y agar sangre para anaerobios.
C) Placas de agar en aerobiosis con exudados genitales y/o de ETS
Neisseria: N. gonorrhoeae es nutricionalmente mucho ms exigente que N. meningitidis, de
manera tal que puede crecer nicamente en medios enriquecidos como agar chocolate, pero no
puede crecer en agar sangre, mientras que N. meningitidis puede crecer tanto en agar sangre
como en agar chocolate. Forman colonias pequeas, bordes lisos e irregulares, grisceasblanquecinas, traslcidas y brillantes.
Haemophilus: En Agar sange no crece a no ser que sea a modo de satlite alrededor de
Staphylococcus aureus que hemoliza la sangre. Crece en Agar chocolate formando colonias
pequeas, convexas de borde regular, grisceas-transparentes y aspecto brillante. H. ducreyi es
de difcil crecimiento y por tanto este no es su mtodo de diagnstico (PCR). Cuando se observen
colonias sospechosas se reaislan en Agar sangre y chocolate simultneamente, para observar el
no crecimiento en Agar sangre caracterstico de este grupo de cocos Gram-negativos.
Levaduras: Puede crecer en Agar sangre y chocolate como colonias pequeas blanquecinas
secas, con bordes estrellados (C. albicans). Donde mejor crecen es en Sabouraud, con aspecto
blanco cremoso volvindose ms pastosas a medida que envejecen, superficie lisa o rugosa,
generalmente elevadas, tamao pequeo y olor dulzn agradable.
Estreptococos: crecen en Agar sangre, CNA y Chocolate como colonias pequeas y diminutas,
grisceas a blanquecinas. En Agar sangre y CNA se distingue la capacidad hemoltica. El
31
32
B) Prueba de la catalasa
La catalasa es una enzima bacteriana que desdobla el agua oxigenada en oxigeno y agua.
Constituye un sistema de defensa bacteriano frente a agentes hiperoxidantes como el perxido
de hidrgeno (agua oxigenada).
Consiste en aadir sobre las colonias problema unas gotas de H2O2 10 vol. Si aparecen burbujas
de O2 gas el microrganismo es catalasa positiva, y si no aparecen las burbujas seria catalasa
negativo. Nunca debe realizarse esta prueba en colonias sobre medios con sangre porque los
eritrocitos tambin poseen esta actividad enzimtica y podran producirse resultados falsamente
positivos. Vg: (+) Sthaylococus aureus, (-) Streptococus spp.
Ilustracin recomendada:
http://www.mesacc.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/cat.html
C) Prueba de la coagulasa
Objetivo
Permite separar S. aureus, que posee coagulasa, de las otras especies de estafilococos que
genricamente se las denomina estafilococos coagulasa negativos.
Fundamento
S. aureus posee dos tipos de coagulasa:
o
Una endocoagulasa o coagulasa ligada o clumping factor, que est unida a la pared
celular. Esta acta directamen te sobre el fibringeno provocando la formacin de
cogulos o grumos cuando se mezcla una suspensin bacteriana con plasma citratado
(test en lmina).
Mientras el test en tubo es definitivo, el test en lmina nos sirve como una rpida y econmica
tcnica de tamizaje (screening). Entre un 10 a 15% de las cepas de S. aureus se mostrarn
negativas en el test en lmina, por lo cual en esos casos se hace necesario realizar un test en
tubo.
Test en lmina
Procedimiento
Se emulsionan sobre un portaobjetos una o ms colonias en una gota de suero fisiolgico hasta
formar una suspensin lechosa. Luego se agrega, al lado, una gota de plasma citratado de conejo
y se mezclan.
33
Interpretacin de resultados
Debe realizarse dentro de los primeros diez segundos. Un test positivo se evidencia por la
formacin de grumos. Los test negativos deben ser confirmados por test en tubo.
Test en tubo
Procedimiento
Se emulsionan varias colonias en un tubo con 0,5 ml de plasma citratado de conejo. Se incuba a
35C y se chequea la formacin del cogulo a las 4 horas. Si es negativo se reincuba toda la
noche y se procede a su lectura a las 18 horas. La lectura a las 4 horas es fundamental porque en
alguna oportunidad puede suceder que las fibrinolisinas de S. aureus lisen el cogulo luego de 18
horas de incubacin y de esta manera se produzcan un test falso negativo.
Interpretacin de resultados
Se observa la formacin de un cogulo total o parcial si el test es positivo.
Ilustracin recomendada:
http://www.mesacc.edu/~johnson/labtools/Dbiochem/coag.html
34
Interpretacin de resultados
La formacin de grumos indica un test positivo.
D) Aglutinacin estreptococos
Muchos Streptococcus aislados de infecciones humanas poseen antgenos especficos de
naturaleza polisacrida (polisacrido C o cidos teicoicos) que se encuentran en la pared celular.
La extraccin del polisacrido C por diferentes tcnicas y su posterior enfrentamiento con
antisueros especficos definen una serie de grupos que se denominan con letras maysculas a
partir de la A. La utilidad de la extraccin antignica depender del tipo de hemlisis:
o
35
Lectura
Debe realizarse dentro de un minuto.
o
Resultado Negativo: la ausencia de reaccin con cualquiera de los reactivos indica que
la bacteria ensayada no pertenece a los microorganismos ensayados.
Ilustracin recomendada:
http://medinfo.ufl.edu/year2/mmid/labimage/phadeb.jpg
E) Test de filamentacin
Se realiza en aquellas colonias que han crecido en Agar Sabouraud, para identificar si se trata de
Candida albicans, que tienen la facultad de producir tubos germinativos.
Procedimiento
o
Lectura
La prueba es positiva si se visualizan tubos germinales. Se trata de una extensin filamentosa de
la levadura, sin estrechamiento en su origen, cuyo ancho suele ser la mitad de la clula
progenitora y su longitud tres o cuatro veces mayor que la clula madre.
Ilustracin recomendada:
http://www.telmeds.org/wp-content/uploads/2009/09/candida_merckmedicus.jpg
Falsos negativos:
o
F) Api 20 A
Esta prueba nos permite la identificacin definitiva de las colonias que slo han crecido en los
medios de cultivo anaerobios.
La prueba est compuesta por 20 microtubos que contienen sustratos deshidratados. Estos se
inoculan con una suspensin bacteriana que reconstituye los sustratos. Las reacciones que se
producen durante la incubacin se traducen en cambios de color, espontneos o provocados
mediante la adicin de reactivos.
36
IND
URE
ESC
GEL
Azcares
CAT
Procedimiento
o
Inocular las colonias puras obtenidas en el Agar Brucella, con una torunda, en la
ampolla de Api 20A Medium. Alcanzar una turbidez 3 McFarland.
Con una pipeta Pasterur estril, inocular la galera con la suspensin obtenida
(evitando la formacin de burbujas al inclinar ligeramente la galera).
Para la prueba IND, terminar de llenar la cpula en aceite mineral para evitar la
evaporacin. Incubar en anaerobiosis a 36C, hasta 48.
+
-
El prpura bromocresol (BCP) de cada una de las cpulas puede resultar asimilado por
la bacteria en algunos pocos casos. Si es as agregue una gota de BCP a los tubos que
contengan carbohidratos y estn incoloros.
Prueba de IND. Agregar gota de xilol. Mezclar y esperar 3 minutos. Luego agregar una
gota de reactivo de EHR. Leer 5 minutos despus.
URE
Rojo
Amarillo
AZUCARES
Amarillo
Rojo
GEL
Difusin
No
Difusin
ESC
Marrn
Amarillo
AZUCARES
Amarillo
Rojo
CAT
Burbujas
No
Burbujas
Tabla 4. Api 20 A
G) Api NH
Esta prueba nos permite la identificacin definitiva de las colonias que han crecido en Agar
Chocolate, Thayer Martin o similares y que en la tincin de Gram presentan aspecto de
diplococo o cocobacilo gramnegativo.
37
El Api NH banda consta de 10 microtubos que contienen sustratos deshidratados que permiten
el desempeo de las 12 pruebas de identificacin (reacciones enzimticas o de fermentacin de
azcar), as como la deteccin de una penicilinasa (especial inters en Haemophilus influenzae,
Haemophilus parainfluenzae, Branhamella catarrhalis (Moraxella catarrhalis) y Neisseria
gonorrhoeae). Las reacciones se producen durante la incubacin dando lugar a cambios de color
espontneos o bien tras la adicin de reactivos. Despus de un perodo de incubacin de 2 horas
a una temperatura de 35-37C, la lectura de las reacciones ese realiza visualmente y la
identificacin se obtiene mediante la consulta de la lista de perfiles.
PEN
ODC
URE
LIP
PAL
-GAL
ProA
GGT
IND
Azcares
Procedimiento
o
Abrir una ampolla de Medio NaCl 0,85% (2 ml) con el protector de ampolla.
Con el uso de un hisopo, recoger algunas colonias bien aisladas y preparar una
suspensin con una turbidez equivalente a 4 McFarland, asegurndose de que est
bien mezclado.
Llene el tubo y la cpula de los ltimos 3 microtubos LIP / Proa, PAL / GGT, GAL
/ IND: cerca de 150 l, evitando la formacin de un menisco convexo.
Cubra las primeros 7 pruebas (PEN a URE) con aceite mineral (pruebas subrayadas). La
calidad de la obturacin es muy importante: los tubos que no estn suficientemente o
excesivamente llenos pueden causar que los resultados sean falsos positivos o falsos
negativos. Cierre la caja de incubacin.
38
Aada 1 gota de reactivo B ZYM para microtubos 8 y 9: LIP / Proa y PAL / GGT.
(-)
incoloro
amarillo
incoloro
(+)
amarillo
azul pp.
incoloro
IND
incoloro
rosa
amarillo
GGT
amarillo
azul
amarillo
Proa
incoloro
amarillo
GAL
rojo
PAL
amarillo
LIP
rojo
URE
amarillo
ODC
rojo
SAC
amarillo
MAL
rojo
(-)
FRU
azul
(+)
GLU
amarillo
PEN
Tabla 5. Api NH
H) API C AUX
39
Se rene fondo y tapa de la galera y humedecer el fondo con 5ml de agua destilada para crear
una atmosfera hmeda se introduce la galera en la cmara de incubacin y procedemos a
preparar el inoculo. Se abre una ampolla de api NaCl 0.85% mdium, y se prepara una
suspensin de levaduras con una turbidez 2 de Mcfarland (esta suspensin debe ser preparada
justo despus de su preparacin), a continuacin se llenan las cpulas evitando la formacin de
burbujas, volver a cerrar la cmara de incubacin e incubar de 48 a 72 a 30C.
Lectura
Pasado el tiempo de incubacin, observar el crecimiento, de forma que con una mayor turbidez
que la del control nos indicara una reaccin positiva que se anota en la hoja de resultados. La
identificacin se obtiene a partir de un perfil numrico.
4.2.4 Antibiogramas
A) Antibiograma: anaerobios
No se recomienda realizar, de una forma rutinaria, ensayos de sensibilidad a todos los
aislamientos de bacterias anaerobias.
Mtodo
El de dilucin en agar es el de referencia para bacterias anaerobias.
Inoculacin
A partir de un cultivo en placas de agar Brucella enriquecido para anaerobios, se suspenden de 3
a 5 colonias en un caldo de tioglicolato, que se incuba entre 6 y 24 horas o hasta que alcance una
turbidez adecuada. La turbidez se ajusta a 0,5 McFarland mediante la adicin de caldo Brucella.
La inoculacin en la superficie del agar se hace con la ayuda de un replicador de Steers. El
5
inculo final debe ser, aproximadamente, de 10 UFC por punto de inoculacin. Se recomienda,
tanto al principio como al final de cada serie, inocular dos placas control sin antibitico, una se
incuba en una atmsfera con un 5% de CO2 y la otra en anaerobiosis, durante 42-48 h, con el fin
de comprobar la viabilidad y pureza del inculo. Se debe empezar a inocular siempre por la
concentracin ms pequea de cada antibitico. Incubar 42-48 h en anaerobiosis a 35-37C.
Lectura
La Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) se considera como aquella concentracin de
antibitico en la que se observa una reduccin marcada en el crecimiento de la bacteria al
compararlo con el crecimiento de la placa control, como es el cambio a una fina pelcula, o a
numerosas colonias pequeas, o bien a una o varias colonias de tamao normal.
La interpretacin de los valores de CMI obtenidos para cada antibitico se realiza segn los
criterios del documento del NCCLS.
40
B) Antibiograma: gonococo
Mtodo
De difusin con discos en agar.
Inoculacin
Se prepara una suspensin 0.5 Mc farland con un escobilln estril mojamos el escobilln y se
procede a sembrar el inoculo en masivo en placa de agar chocolate, al que se le colocan los
antibiticos seleccionados en cada laboratorio de Microbiologa, no ms de 5 por placa. Se
incuban las placas en atmosfera CO2 de 16- 20h.
Lectura (ver tabla 6)
Medir los halos de inhibicin del crecimiento alrededor de los discos de antibiticos en
milmetros, y compararlos con las sensibilidades establecidas en las Normas CLSI - NCCLS.
ANTIBIOTICO
Penicilina G
Ceftriaxona
Tetraciclina
Ciprofloxacino
CARGA
10 U
30
microgr
30
microgr
5 microgr
RESISTENTE
mm
26
13
INTERMEDIO
mm
27-46
14-34
SENSIBLE
mm
47
35
30
31-37
38
27
28-40
41
41
ANTIBIOTICO
Ampicilina
Amox+Clav
Cefuroxima
Cefpodoxime
Claritromicina
Aztreonam
Cloranfenicol
Ciprofloxacino
CARGA
microgramos
10
20/10
30
10
15
30
30
5
RESISTENTE
mm
18
19
16
17
10
15
25
15
INTERMEDIO
mm
19-21
17-19
18-20
11-12
16-21
26-28
16-20
SENSIBLE
mm
22
20
20
21
13
22
29
21
Usando una torunda esterilizada o asa bacteriolgica, tocar superficie de colonias 4-5
grandes 5-10 pequeas, morfolgicamente similares, bien aisladas y procedente de
una placa de agar no selectivo de 18-24 horas.
Mezclar con 3ml de agua para inoculo debe de ser esterilizada y destilada, la turbidez
debe ser equivalente a 0.5 Mc Farland. Agitar la suspensin.
Con la ayuda de una pipeta se transfiere 0.1 ml de esta suspensin en 25ml de agua
para inoculo con PLURONIC y mezclar.
Antes de incubar el panel cubrir los pocillos que estn subrayados con 3 gotas de aceite mineral.
Incubar el panel de 16-20 horas a 35C sin CO2.
Revelado panel despus de la incubacin
o
Se aade una gota pocillo NIT (REACTIVO NIT 1 Y NIT 2), la reduccin de Nitrato a
Nitrito se detecta por la formacin de un color rojo, de forma de los estreptococos
son nitrato negativos mientras que la mayora de los estafilococos son nitrato
positivos.
Igualmente se aade 1 gota en el pocillo VP (REATIVO VP1 Y VP2) VOGESPROSKAUER, la reaccin dara como resultado color rojo. Las especies que llevan a
cabo la fermentacin butanodilica de la glucosa aumentan la acetona en el medio.
Cuando se aade alfanaftol en medio alcalino (KOH), la acetona se convierte en
diacetilo que reacciona formndose un color rojo.
Se aade al pocillo IND 1 gota. Existen bacterias que producen triptofanasa que
convierte el triptfano en indol. La presencia de indol se ensaya aadiendo
dimetilaminobenzaldehdo.
Lectura
Se realiza de forma automtica en el equipo autoSCAN-4 System.
E) Panel de Grampositivos
Los paneles positivos microScan estn diseados para determinar la sensibilidad a agentes
antimicrobianos y/o la identificacin a nivel de especie de aerobios facultativos de crecimiento
rpido y de cocos Gram positivos, algunos cocos aerobios exigentes Gram positivos y Listeria
monocytogenes.
Mtodo, preparacin del inoculo e inoculacin del panel
Igual que para los Gramnegativos. nicamente, en la inoculacin del panel, la prueba de pureza
se ha de hacer en placa de agar sangre.
Revelado panel despus de la incubacin
o
Se aade una gota pocillo NIT (REACTIVO NIT 1 Y NIT 2), la reduccin de Nitrato a
Nitrito se detecta por la formacin de un color rojo.
43
VOGES-
Se aade una gota de reactivo PYR la reaccin de la peptidasa dara lugar a una
reaccin de color rojo. S.pyogenes y Enterococcus poseen la capacidad de hidrolizar el
substrato PYR (pirridonil -naftilamida) debido a que poseen la enzima l-piroglutamil
aminopeptidasa.
Lectura
Se realiza de forma automtica en el equipo.
Cultivos especiales
4.2.5 Cultivo de trichomonas
Actualmente, el cultivo en los caldos de Roiron y de Diamond se considera el mtodo de
referencia para el diagnstico de la tricomoniasis. Es fcil de realizar, de bajo coste y requiere un
inculo de tan solo 300 a 500 tricomonas/ml. Su principal inconveniente es el tiempo de
incubacin ya que se requieren de dos a siete das para identificar el parsito.
Los cultivos, incubados a 37C, se deben observar al microscopio un mnimo de 1 minuto en los
das 2 y 5 tras la inoculacin.
Frasco con Orina o Secrecin prosttica
o
Torunda alginato clcico o dacrn en Caldo de Roiron o de Diamond con exudades genitales
Los exudados de la uretra y de la vagina recogidos con la torunda, se inoculan directamente
sobre el caldo. Si esto no se ha realizado en la consulta y solicitan expresamente bsqueda de
Trichomonas, se proceder a la inoculacin en el laboratorio de forma inmediata.
4.2.6 Cultivo mycoplasmas y ureaplasmas
Torunda alginato clcico o dacrn en caldo 10B o SP-4 para Mycoplasmas y Ureaplasmas con
exudados genitales y/o ETS.
A) El sistema Mycoplasma IST 2 contiene unos viales R1 con el caldo de transporte (tipo 10B o
SP-4), otros viales R2 con un caldo selectivo de urea-arginina y una galera con medio especfico
y distintas concentraciones de antibitico. Permite determinar la presencia de Ureaplasma
urealyticum y de Mycoplasma hominis, aproximar su concentracin, y estudiar la sensibilidad
frente a nueve antibiticos. La distribucin de las 22 cpulas de la galera es la siguiente (ver
tabla 8).
44
Procedimiento
1.
2.
Homogeneizar
3.
4.
5.
Dispensar 55 l del caldo R2 en las cpulas de la galera (R3). En el vial R2 quedar caldo
urea-arginina sobrante que se incuba .
6.
7.
8.
Incubar el resto del caldo urea-arginina y la galera durante 48 horas a 36C 2C.
Controles
o
- Galera:
-
N
Lectura
1
48 h
0
(-)
(+)
Naranja
Rojo
3
48 h
Micoplasma
hominis
Naranja
Rojo
4
24h / 48h
U.urealyticum
104ucc/ml
Naranja
Rojo
5
48 h
M.hominis
104ucc/ml
Naranja
Rojo
(-)
(+)
6-22
48 h
[Atb] baja
Naranja
Rojo
[Atb] alta
Naranja
Rojo
1. Indicador de crecimiento
2. Contiene lincomicina. Selectiva para U. urealyticum
3. Contiene eritromicina. Selectiva para M. hominis
4
4 y 5. Efecto dilucin. Permiten el recuento (>10 ucc/ml)
6 a 22. Ensayan la sensibilidad a 9 antibiticos: doxiciclina, josamicina, ofloxacino, eritromicina, tetraciclina,
ciprofloxacino, azitromicina, claritromicina y pristinamicina
Este problema se evita en parte con el uso de diluciones seriadas. Los subcultivos aumentan las
posibilidades de aislamiento, ya que algunas cepas no crecen en el agar inoculado inicialmente.
Dispensar en cada placa 3 gotas (1 gota=10 l) del caldo, sin estriar y sin que confluyan las gotas.
Dejar secar las placas 5 minutos a temperatura ambiente. Deben incubarse en 5-10% CO2 a 37C,
hasta 3-4 das.
La lectura de las placas se puede hacer con microscopio invertido orientando la superficie del
agar hacia arriba, o con microscopio estereoscpico de epiiluminacin orientando la superficie
hacia abajo, con el objetivo de 10x, un mnimo de tres campos de cada gota depositada.
o
El ttulo de la muestra se estima a partir del nmero de colonias presentes por campo,
teniendo en cuenta si se ha realizado una dilucin y el volumen inicial de la muestra.
(Ver tabla 9)
Colonias por campo
(objetivo 10x)
UFC en el inculo
<1
1-5
5-15
>15
103 UFC
4
10 UFC
105 UFC
106 UFC
47
48
Muestras endocervicales
o
Con una pipeta, tomar 0,6 ml del reactivo de extraccin en el tubo de centrifugacin.
Mezclar en "vortex" durante un tiempo mnimo de 30 segundos. Transferir el
sedimento resuspendido a un tubo de extraccin limpio. Colocar en la fuente de calor
y calentar a 80C durante 10-12 minutos.
49
Controles
El sistema Clearview Chlamydia MF proporciona un sistema de control integral. La aparicin de
una lnea en la ventana de control nos indica que la prueba se ha desarrollado correctamente y
por tanto se pueden interpretar los resultados obtenidos.
4.3.2 Torunda de dacrn con medio de transporte especfico
A) Herpes
En la actualidad, el abordaje diagnstico de la infeccin genital por VHS se basa principalmente
en las tcnicas de cultivo (generalmente shell-vial) y en el diagnstico molecular por PCR a
tiempo real o captura de hbridos, quedando la serologa para situaciones especiales y para
estudios epidemiolgicos.
o
51
53
B) Herpes
La PCR incrementa el porcentaje de deteccin de VHS de muestras mucocutneas obtenidas con
torunda en un 11-41% comparado con el cultivo. Actualmente las nuevas tcnicas de PCR a
tiempo real totalmente automatizadas permiten la deteccin del VHS en un sistema cerrado con
bajos tiempos de respuesta y bajo riesgo de contaminacin. Adems, permiten simultneamente
la deteccin y el tipado del VHS-1 y 2 en un slo paso en base al anlisis de las diferentes
temperaturas de fusin de los amplicones especficos de VHS -1 y 2. Las tcnicas de captura de
hbridos se han utilizado para el diagnstico de la infeccin por VHS en muestras cervicales. En
ellas el ADN hibrida con sondas de ARN y los hbridos son inmovilizados mediante un sistema de
captura en placas de microtiter.
C) Treponema pallidum
PCR: deteccin por tcnicas de amplificacin gentica del genoma treponmico, aunque son
generalmente ensayos no comercializados sino preparados y desarrollados en centros de
referencia.
54
Captulo 5
55
Las principales pruebas no treponmicas son el VDRL (requiere pretratamiento del suero y
un microscopio para su lectura) y el RPR (emplea partculas de carbn para visualizar la
reaccin sin microscopa).
Todas las pruebas no treponmicas tienen la misma sensibilidad y especificidad, pero el nivel
de reactividad entre ellas puede ser diferente: el RPR suele ser positivo a una dilucin mayor
que el VDRL. Se recomienda que el seguimiento serolgico secuencial de los pacientes se
realice siempre con la misma prueba, y preferiblemente, en el mismo laboratorio.
Al contrario que las pruebas no treponmicas, las pruebas treponmicas no sirven para
monitorizar el tratamiento, ya que en el 85% de los pacientes correctamente tratados, estas
pruebas permanecen positivas, incluso de por vida. Solamente un 15-25% de los pacientes
tratados correctamente durante los primeros estados de la enfermedad, negativizan las
pruebas treponmicas pasados 2-3 aos. Se han descrito falsos positivos, aunque son muy
poco frecuentes.
56
Cada vez se utilizan ms las tcnicas de EIA, ya que sus formatos automatizados permiten
ensayos sobre gran nmero de muestras, por lo que se estn convirtiendo en la prueba de
cribado de muchos laboratorios. Su sensibilidad y especificidad es similar a la de otras
pruebas treponmicas. Si se utilizan como cribado, el resultado positivo debe al menos
ensayarse con una prueba no treponmica, y si el resultado es negativo, debe ensayarse una
segunda prueba treponmica para descartar un falso positivo. Se debe tener presente que
las pruebas treponmicas utilizadas como cribado pueden detectar tanto casos antiguos bien
tratados como casos activos no tratados. Los EIA que slo detectan IgM tienen su principal
inters en el diagnstico de la sfilis congnita. El inmunoensayo en lnea es una tcnica que
emplea una tira de nylon sobre la que se fijan protenas recombinantes y un pptido
sinttico de T. pallidum en forma de bandas independientes. Permite determinar la
reactividad de anticuerpos frente a cada antgeno. La lectura es visual, y el resultado en
funcin del nmero de antgenos que son reactivos puede ser negativo (ausencia de bandas),
positivo (presencia de dos a ms bandas) o indeterminado (una banda positiva).
Fase
Precoz
Inicial
Primaria
Secundaria
Latencia
temprana
Latencia tarda
o Terciaria
Duracin
3 semanas
1-5 semanas
2-6 semanas
1 ao
>1 ao
71
94
96
Tabla 10. Sensibilidad de las pruebas serolgicas frente al T. pallidum en funcin de las etapas
de evolucin de la sfilis
En la tabla 11, se resumen los procedimientos especficos del Laboratorio de Microbiologa para las
muestras de infecciones genitales y/o ETS.
57
Contenedor-muestra
Porta-cubre o Tubo con
secrecin de lcera de ETS
Vial con aspirado o torunda
con exudado en medio
anaerobio
Frascos de cultivo con
aspirado lquido interno
Microrganismo buscado
Klebsiella granulomatis
Treponema pallidum
Anaerobios
Anaerobios y aerobios
Procedimiento
Giemsa
Campo oscuro, IFD
MICROSCOPIO: Gram
CULTIVO
Agar Brucela, BBE, Tioglicolato
CULTIVO
MALDIT-TOF
MICROSCOPIO
T. vaginalis, Cndida
Gardnerella + Mobilluncus
Neisseria gonorrhoeae
Fresco
Gram
CULTIVO
N. gonorrhoeae, Haemophilus Chocolate, Tayer-Martin
Cndida
Sabouraud
Streptococcus, Staphylococcus Agar sangre
Enterobacterias
Mc Conkey o Levine
Streptococcus agalactiae
Agar CNA o Granada
MICROSCOPIO: Sedimento
Enterobacterias
CULTIVO:
Staphylococcus, Streptococcus
Agar sangre
Cndida
Frasco con Orina o Secrecin
Cled
prosttica
1) Centrifugacin
2) CULTIVO: Caldo de Roiron y
Trichomonas vaginalis
de Diamond
3) MICROSCOPIO: fresco
Torunda alginato clcico o
1) CULTIVO: Caldo de Roiron y
dacrn en Caldo de Roiron o
Trichomonas vaginalis
de Diamond
de Diamond con exudades
2) MICROSCOPIO: fresco
genitales
Torunda dacrn o polister
CULTIVO:
Mycoplasma hominis
en 10B o SP-4 con exudados
1) Caldo urea-arginina
Ureaplasma urealyticum
ETS
2) Agar A7, A7B o A8
Orina
Torunda alginato o dacrn
ICT-Directa
sin medio con exudados
Chlamydia trachomatis
IFD, EIA
genitales y/o de ETS o
NAAT
secreciones de lceras de
ETS
Tubo Affirm VP III con
exudades genitales
Gardnerella, Cndida y
Trichomonas
Sonda de ADN
Tabla 11. Resumen de los procedimientos especficos del Laboratorio de Microbiologa para las
muestras de infecciones genitales y/o ETS
58
Contenedor-muestra
Torunda alginato clcico (no
para virus) o dacrn en
medio especfico con
secreciones de lceras de
ETS
Microrganismo buscado
Virus Papiloma Humano
Haemophilus ducrey
Virus Herpes Simple 2
Treponema pallidum
Procedimiento
PCR
CULTIVO (1):
Cl Hep-2, Vero.
IFD, EIA (2)
PCR
gG1, gG2
Western bolt, Inmunoblot
Mtodos indirectos:
IgG e IgM
Mtodos no treponmicos:
RPR, VD
Mtodos treponmicos:
TPHA, FTA-abs, EIA,
Inmunoblot, Western blot
59
Captulo 6
Interpretacin
Microbiota habitual
Clulas Clue
No
Si
-
Microbiota alterada
Vaginosis bacteriana
60
Interpretacin
Microbiota habitual
Microbiota alterada
Vaginosis bacteriana
Tincin de Gram del exudado: se debe notificar la presencia del nmero de leucocitos
PMNs por campo de inmersin y si hay o no diplococos gramnegativos intracelulares.
En los urocultivos se siguen los criterios clsicos de interpretacin descritos por Kass, en los que
se consideran significativos recuentos de >105 ufc/mL pueden ser aplicados a la mayora de las
4
muestras en las que se solicita el cultivo; un recuento <10 ufc/ml se considera como no
significativo. Sin embargo, en determinadas circunstancias se admite la existencia de infeccin
3
urinaria con recuentos muy inferiores (10 ufc/ml): puncin suprapbica (cualquier recuento),
mujeres con sndrome miccional y leucocituria o bien con el sndrome uretral femenino,
hombres, orinas obtenidas por sondaje y pacientes con tratamiento antibitico.
Cuando se trata de orinas recogidas antes y despus del masaje prosttico, se ha de valorar
adems si el recuento bacteriano es mayor en la orina postmasaje, lo cual sera indicativo de
prostatitis.
El aislamiento de micoplasmas genitales tambin es significativo en lquidos estriles y en uretra
para U. urealyticum y en muestras vaginales asociado a vaginosis para M. hominis. Los recuentos
son valorables a partir de 104 UCC/ml (unidades cambiadoras de color / ml utilizando mtodos
comerciales lquidos) o UFC/ml (unidades formadoras de colonias / ml, para placas de agar).
Para valorar los resultados de las pruebas diagnsticas de un herpes genital se deben tener en
cuenta las siguientes situaciones:
o
Cultivo. Siempre debe realizarse el tipado, los resultados positivos deben ser tipoespecficos. Si el cultivo es positivo el paciente probablemente tiene un herpes
genital, son raros los falsos positivos. Si el cultivo es negativo no indica
necesariamente que el paciente no est infectado por el VHS, puede ser un virus no
detectable en la muestra; los falsos negativos son muy comunes.
61
En los falsos positivos, ante la sospecha de sfilis inicial (primaria muy precoz), se ha
recomendar repetir la serologa en 4 semanas para evaluar seroconversin.
En el caso de neurosfilis, adems de los controles serolgicos, el estudio del LCR debe
repetirse cada 6 meses. Continuar los controles hasta que todos los parmetros
alterados se normalicen. Si el nmero de clulas no decreci en 6 meses o el lquido
no se normaliz en 2 aos, hay que considerar el retratamiento.
62
Negativa
SFILIS
Seroconversin
4 semanas
6
meses
DESPUES DEL
TRATAMIENTO
12
meses
24
meses
+
Falso +
o inicial
+
Inicial
+
+
+
1 o
latente
Falso +
o inicial
+
+
2 o 1
+
Inicial
RPR/4
Eficaz
1:RPR/8
LtP:RPR/4
Eficaz
LtT:RPR/4
Eficaz
Falso +
o inicial
+
3 o
tratada
+
Inicial
RPR/4
Eficaz
RPR/8
LCR
Eficaz
Tabla 13. Interpretacin de los resultados serolgicos de la Sfilis: Diagnstico y seguimiento del
tratamiento
Por ltimo, las enfermedades que se transmiten por va sexual son de tal gravedad que hacen
que su seguimiento sea semanal y su declaracin obligatoria a la Red Nacional de Vigilancia
Epidemiolgica, segn el RD 2210/1995. El microbilogo o el responsable de Prevencin del
centro han de enviar por escrito una encuesta epidemiolgica de la infeccin a declarar.
63
Captulo 7
Bibliografa
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Sobre el revisor
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