Los medios de cultivo en microbiologa

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el
Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han
preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial

debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y
presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o
alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de
crecimiento

necesarios

debe

estar

exento

de

todo

microorganismo

contaminante.

La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes complejos similares en

composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de
muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la
que se aadirn otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios

de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se
solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre
el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que

bastantes bacterias provocan su licuacin.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de

enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los
hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para
incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin
de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa
se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos
resistentes.

Tambin se aaden colorantes que actan como indicadores para detectar, por
ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores del crecimiento de unas
bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH
bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya
que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve

afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos,
son ajenos por completo al propio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener,

como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos
casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del
crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para
ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que
tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de

carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparacin de
estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo provocaban la prdida
de los factores nutritivos lbiles.

Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es

utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de
nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen
utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los
aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la
peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a

muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente
pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio,
magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento,
generalmente de naturaleza vitamnica.

Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como

indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de
ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo

productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en
estado semislido o slido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al
punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y

comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est
ampliamente extendido en el laboratorio.

3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de

oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados
sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn
adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio,
los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas

parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los

anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de
las citadas condiciones.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es

imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en
los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las
estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as
que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en

presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los
microorganismos fotosintticos.

6- pH

La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los

microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH
neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe
olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el

crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos
metablicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y

43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a
temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos
humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C,
y los saproftos tienen rangos ms amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la
aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos
medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave
(que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante)

La evolucin de los medios de cultivo

Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo como

ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y comienza la
observacin de los primeros microorganismos, pero es indudable que la puesta a

punto de los medios de cultivo y la utilizacin del agar como solidificante, marcan
dos importantes puntos de inflexin en su evolucin.

La primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo

Brefeld, que consigui aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos
realizados a base de gelatina.

Sin embargo este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor
tamao) y no fue hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un mtodo enfocado
al cultivo puro basado en diluciones seriadas en un medio lquido.

Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de

patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al caldo de carne
lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio
slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las
colonias microbianas.

En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la microbiologa en

relacin con los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce el
agar-agar (polisacrido extrado de algas rojas) como solidificante.

En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal

planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas
bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces.

Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus investigaciones sobre

las bacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre sobre todo)
tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de
enriquecimiento. Disearon este tipo de medios de tal forma que su especial
composicin qumica favoreca el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos
que, en funcin de sus procesos metablicos, eran los nicos capaces de utilizar
para su desarrollo ciertos nutrientes del medio.

En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando

indicadores de pH a la composicin de ciertos medios con lo cual se poda
observar la produccin de cidos en la fermentacin en ciertos microorganismos.

Tipos bsicos de medios de cultivo

atendiendo a su estado fsico:

lquidos

semislidos

slidos

atendiendo a su utilidad prctica:

Medios para aislamientos primarios:

Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de

organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con materiales
como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios
para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc)

selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se aaden sustancias

que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el
crecimiento de otras. Variando las sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de
selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina)

enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal

potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que

satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su
identificacin (Lowenstein).

Medios para identificacin:

diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades

fisiolgicas (nutricin y respiracin sobre todo) especficas de las bacterias.
Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificacin de casi
cualquier bacteria (Oxidacin-Fermentacin)

SEGN SU ESTADO FSICO (CONSISTENCIA).

1) Medios lquidos: Son los que se presentan en este estado, denominndose
por esta razn caldos. El medio lquido ms utilizado es el llamado caldo nutritivo,
compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza
fundamentalmente cuando se pretende la obtencin de una suspensin bacteriana
de una determinada concentracin.
2) Medios slidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregndoles un
agente gelificante. Los ms utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una
protena animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es
hidrolizada por muchas bacterias, y adems su uso est muy limitado porque su
punto de fusin es bajo (lica a temperatura ambiente) razn por la que no puede
utilizarse para cultivos a 37C, que es la tempera ptima de crecimiento para
muchos microorganismos. Agar-agar:Es un polmero de azcares obtenido de
algas marinas. Se trata de una molcula insoluble enagua pero soluble en agua
caliente; una solucin al 1,5% p/v forma un gel firme entre 32 y 39C y nose funde
por debajo de 85C. Funde a 90C y solidifica una vez fundido alrededor de los
45C. Tiene el inconveniente de que introduce compuestos orgnicos indefinidos
que pueden falsear los resultados de las necesidades nutritivas de un
microorganismo. Aunque el agar es una mezcla de polisacridos, Araki, en 1937,
los dividi en dos grupos:- agarosa, con poco sulfato, libre de cido pirvico, yagaropectina, con mucho sulfato y gran cantidad de cenizas. La proporcin de
agarosa a agaropectina en el agar vara segn el alga de origen. El agar puede
utilizarse para diferentes fines, aunque los ms importantes son: agar comercial
para la industria alimenticia, agar bacteriolgico, agares purificados y agarosa,
utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la mitad de todo el agar que
se produce, se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo que es importante la
ausencia de metales txicos.

3) Medios semislidos: Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a

stos un agente solidificante en una proporcin menor que para preparar medios
slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la movilidad de las bacterias

SEGN SU UTILIZACIN.
1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mnimos para
que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos
especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar
comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros representantes
de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc.
2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, adems de las sustancias
nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el
crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por
adicin de sangre u otros productos biolgicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis,
etc.) que aportan dichos factores. En ocasiones es posible aadir suplementos
artificiales a los medios para producir un enriquecimiento del mismo (p. ej.
Polivitex, Isovitalex, etc)El gonococo, por ejemplo, necesita cistina y cistena para
su crecimiento. Estas sustancias son aportadas por la sangre calentada
adicionada al medio de cultivo (agar chocolate).
3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de
ciertas bacterias contenidas en una poblacin polimicrobiana. El fundamento de
estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una poblacin
microbiana especfica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se
utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de
enterobacterias.
4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo
impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina

inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse como una variante ms

restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen
habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que
inhiba completamente el desarrollo de una poblacin determinada. Un medio
inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los grmenes Gram
negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos.
5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia caractersticas
bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un azcar
fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio
MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los grmenes que
fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el C.L.E.D.
(lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS (que es doblemente
diferencial), etc.
6) Medios de identificacin: Son los destinados a comprobar alguna cualidad
especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo.
Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el
crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser
metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio
de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento
diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificacin.
Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios
especficos de identificacin para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue
simultneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificacin. Son
ejemplos de esto ltimo los medios CPS ID3 o Uriline ID(Biomerieux), utilizados
para identificar los grmenes urinarios ms importantes a partir de la placa de
cultivo gracias a la utilizacin de sustratos cromognicos especficos.
7) Medios de multiplicacin: Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a
partir de un microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtencin de vacunas,
en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la

multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es un

ejemplo tpico de estos medios.
8) Medios de conservacin: Se utilizan para conservar una cepa que, por
diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como
controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en el Laboratorio de
Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:
a) haciendo pases peridicos de placa a placa,
b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y
c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%.
9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clnicas que no
pueden sembrarse inmediatamente. Su utilizacin debe hacerse introduciendo la
torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior del medio (generalmente en
un tubo). Son ejemplos tpicos de este grupo los medios de Stuart-Amies, CaryBlair, etc.
ATENDIENDO A SU COMPOSICIN.
Segn las sustancias que entren a formar parte en su composicin, los medios de
cultivo pueden ser clasificados en:
1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se
preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su
composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente
constante.

Esto

puede

tener

ciertos

inconvenientes

en

condiciones

experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica

corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados.
2) Medios sintticos: Son aquellos que contienen en su composicin
exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en

proporciones determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente

definida.
3) Medios semisintticos: El gran nmero de factores de crecimiento exigidos
para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos
grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores
de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo (extracto de
levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio
por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas
con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los
virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.

Segn su origen:

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen

animal o vegetal como serextractos de tejidos o infusiones y cuya composicin
qumica no se conoce exactamente.

b) SINTTICOS: son los medios que contienen una composicin qumica definida
cual y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.

c) SEMISINTTICOS son los sintticos a los que se les aaden factores de

crecimiento bajo una forma de un extracto orgnico complejo, como por ejemplo
extracto de levadura.

DESCRIPCIN Y UTILIZACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

MEDIOS DE CULTIVO COMUNES.
Son los ms corrientemente utilizados, y aunque no vamos a enumerarlos todos,
s son los ms conocidos en un laboratorio de Microbiologa.
Agar nutritivo: Este medio es bastante bueno para el cultivo de grmenes que no
presentan exigencias particulares. No es diferencial.