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D-glucosa (utilizado en 33,3 mM) y D-ribosa (50 mM) fueron adquiridos de Invitrogen
(Invitrogen Corporation, Gran Island, Nueva York) y Sigma-Aldrich (St Louis, MO),
respectivamente.
Concentraciones similares de L-glucosa o L-ribosa se utilizaron como hiperosmolaridad
controles (datos no mostrados) [6]. Tapsigargina (utilizado en 5 mM) se adquiri de
Calbiochem (Darmstadt, Alemania) e IL-1Ra (utilizado en 5 mg / mL) se obtuvo de
Amgen (Thousand Oaks, CA). El perxido de hidrgeno (H2O2, Sigma- Aldrich) se utiliz
a 0-40 mM, rotenona (Sigma-Aldrich) a 100 nm y lipopolisacrido (LPS, Sigma-Aldrich
L2630, a partir de Escherichia coli 0111: B4) a 100 nM. Estos reactivos se ensayaron a
travs de una gama de concentraciones en los islotes de tipo salvaje para determinar
la concentracin ptima a usar para experimentos adicionales. El control de
condiciones contena la misma concentracin de diluyente (DMSO para rotenona y
etanol para thapsigargin) en medio completo. Palmitato (Sigma-Aldrich) se utiliz a 1
mM acoplados a cido graso libre 1% de BSA (Roche, Mannheim, Alemania) y se aadi
a 10% de suero que contiene medio para el tratamiento de los islotes.
Aislamiento de islotes, cultivo y ensayo de fragmentacin de ADN.
Se aislaron islotes de Langerhans tal como se describe anteriormente. Los islotes se
lavaron, recogidos a mano, y durante la noche se cultiv a 37uC en 5% de CO2 en
CMRL medio-1066 (Invitrogen) suplementado con 100 unidades/ml de penicilina, 100
mg/ml de estreptomicina, 2 mmol/L glutamina, y 10% de FCS (JRH Biosciences, Lenexa,
KS) (denominado a continuacin completa CMRL). Medio CMRL contiene Glucosa 5,5
mM que es similar a los islotes concentraciones de glucosa estn expuestos a in vivo.
Tras la incubacin con diferentes reactivos, 100 islotes por muestra se tripsinizaron y
DNAla fragmentacin se analiz por tincin con yoduro de propidio y anlisis de
citometra de flujo como se ha descrito previamente. Las clulas NIT-1 se derivan de
ratones NOD transgnicos que expresan el SV40 antgeno T grande en las clulas beta
pancreticas bajo el control del promotor de insulina de la rata. Las clulas se
mantuvieron en 10% de CO2 a 37uC en DMEM (Invitrogen) suplementado con
aminocidos no esencial, antibiticos y 10% de FCS.
PCR genotipo
El ADN se prepar a partir de islotes purificados, y se someti a PCR con los siguientes
cebadores:
Nlrp3A350VF:
CCCTGCATTTTGTTGTTGTTG,
Nlrp3A350VR:
CCTGCTTCTCACATGTCGTC,
NeoF:
GAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTA
y
NeoR:
CGGGAGCGGCGATACCGTAAAGC.
ELISA
Despus del aislamiento, los islotes se cultivaron durante la noche a 37 C en medio
CMRL. Al da siguiente 400 islotes/muestra fueron extradas y se cultivaron en 1 ml de
medio completo CMRL durante 2,5 das. Alternativamente, los macrfagos fueron
preparados por cultivo de mdula sea de ratn en la M-CSF durante 7 das, replateado en 105 por pocillo en placas de 96 pocillos, seguido de la estimulacin con
palmitato conjugado con BSA durante la noche. A la conclusin del cultivo, se elimin el
exceso y se almacen a 280C para su uso posterior. ELISA para la IL-1b se realiz
segn las instrucciones del fabricante (R & D Systems, Minneapolis, MN).
Western Blot
Cuatrocientos islotes/muestra se cultivaron en 1 ml de 1% de BSA medio completo que
contiene CMRL y se trat con una combinacin de LPS (100 nM), glucosa (33,3 mM) y
palmitato (1 mM) durante 2,5 das. Islotes de control se cultivaron en el mismo medio
que contena 100 nM LPS. Islotes lisados se prepararon a continuacin en tampn RIPA
como se describe anteriormente. Los macrfagos tambin fueron tratados con la
misma concentracin de LPS, glucosa y palmitato durante 24 h y despus se lisaron
directamente en tampn de muestra reductor (muestra de buffer reductor). El Western
Resultados
Estrs oxidativo y el estrs ER no causan muerte celular de islotes mediada por
el NLRP3 inflamasoma.
Muerte celular causada por estrs oxidativo no es mediado por inflamosomas.
El estrs oxidativo se ha demostrado que causa la activacin de la
inflamasoma NLRP3. En particular, existen pruebas de que ROS mitocondrial es
un potente activador del complejo NLRP3 en clulas no islotes. Se estudi el
papel de la activacin inflamasoma mitocondrial en la muerte celular mediada
por ROS en ambas lneas celulares, beta e islotes primarios. NIT-1 clulas beta
sensibles al estrs oxidativo fueron tratadas con 100 nM rotenona para inducir
la produccin de ROS mitocondrial. Aunque la rotenona es capaz de
proporcionar tanto la seal 1 y 2, las clulas nunca fueron pre-tratadas con 100
ng / ml de LPS para aumentar al mximo el almacenaje celular de la pro-IL-1b.
La muerte celular se cuantific por la fragmentacin del ADN, que es comn a
todas las formas conocidas de muerte celular programada. La inhibicin de la
actividad de IL-1b con el antagonista del receptor de IL-1b (IL-1Ra, 5 mg / ml)
no proporcion ninguna proteccin contra la fragmentacin del ADN inducida
por rotenona. Esto demuestra que ROS mitocondrial no causa la muerte
dependiente de IL-1R en las clulas beta (Figura 1A). Sigue siendo posible que
la activacin inflamasoma podra ocurrir en los macrfagos residentes de los
islotes u otras clulas no beta, dando como resultado la secrecin de IL-1b y
toxicidad para las clulas beta. Por lo tanto, islotes aislados de tipo salvaje,
Nlrp32 / 2 y la caspasa 12/2 fueron expuestos a rotenona durante 2 das. La
fragmentacin del ADN fue similar en tipo salvaje y NLRP3 o islotes deficientes
en caspasa-1 lo que sugiere que el estrs oxidativo Mitocondrial causa la
muerte de clulas de islote travs de vas independientes de inflamosomas
(Figura 1B y C). Para investigar ms a fondo la posible contribucin del estrs
oxidativo, islotes de ambos, Nlrp32 / 2 y ratones caspasa-12/2, fueron expuesto
a ROS sistlicos cultivndolas con perxido de hidrgeno. La fragmentacin de
ADN inducida por perxido de hidrgeno fue similar en islotes de tipo salvaje y
Figura 4. mutacin en la activacin de NLRP3 no induce la escisin de caspasa1 en los islotes. (A) Cuatrocientos islotes aislados de tipo salvaje o Cre / +
Ratones NLRP3A350V / A350V fueron cultivadas en 1 ml de medio que contena
glucosa 33,3 mM o 50 mM ribosa durante 2,5 das y la concentracin de IL-1b
en el sobrenadante se cuantific por ELISA. Islotes de control se incubaron en
un medio que contiene glucosa 5,5 mM. Macrfagos tratados durante la noche
con 1 mM de palmitato fueron utilizados como control positivo. Los resultados
son la media SEM de n = 3-4 experimentos independientes. (B)
Cuatrocientos islotes / muestra fueron cultivados en medio de control que
contiene 1% de BSA y 100 LPS nm o un medio que contiene 1% de BSA, 100
nm LPS, glucosa 33,3 mM y palmitato de 1 mM durante 2,5 das. Los lisados se
prepararon en tampn RIPA y Western blot para la caspasa-1 (entero, FL o
troceados, p20) se realiz. Los genotipos 1:
+ / + NLRP3 + / +, 2: Cre / + NLRP3 + / +, 3: + / + NLRP3A350V / A350V y 4:
Cre / + NLRP3A350V / A350V. Como control positivo, los macrfagos de tipo
salvaje (A) y caspasa-12/2 (B) fueron tratados con LPS + BSA + glucosa +
Palmitato de 24 h o LPS + nigericina para 1 h.
Una alta concentracin de glucosa no causa muerte celular mediada por NLRP3
inflamasoma en islotes.
La posibilidad de que la muerte inducida por la glucosa fuera por la activacin
inflamasoma en los islotes fue estudiada. Adems de glucosa, hemos probado
la toxicidad de los islotes a la ribosa azcar reductor, similar a la glucosa,
induce la muerte de clulas de islote a travs glicacin y la formacin de ROS
[35]. Islotes que carecen de NLRP3 o caspasa-1 funcional no fueron protegidos
de la toxicidad de la ribosa (Figura 2 A, B y C). Para descartar cualquier
posibilidad de una dbil seal-1, islotes tambin se cultivaron en la presencia
de LPS para aumentar la concentracin de la pro-IL-1b. Sin embargo, la adicin
de LPS no hizo aumentar la muerte celular de los islotes inducida por la ribosa
en comparacin con los de tipo salvaje; no vimos ningn tipo de proteccin en
islotes CASPASE12 / 2 tratados con LPS + ribosa (Figura 2D). Islotes enteros
tambin fueron tratados con palmitato de 1 mM (conjugado a 1% de BSA en
medio que contiene 10% de suero) en presencia o ausencia de glucosa 33,3
mM para estudiar si la presencia combinada de glucosa y palmitato
(glucolipotoxicity) se requiere para causar la secrecin de IL-1b significativo. No
vimos la muerte celular sustancial en islotes enteros despus de la exposicin
a palmitato solo, sin embargo, la exposicin de islotes de palmitato y glucosa
juntos caus mayor muerte celular. Supresin de la caspasa-1 a partir de
islotes no le hizo proporcionar ninguna proteccin contra glucolipotoxicity
(Figura 2E). Estos resultados, junto con nuestros resultados anteriores de que la
deficiencia de receptores IL-1 no protegan islotes de la toxicidad de la glucosa
[6], muestran que ni la activacin del complejo-NLRP3 inflamasoma, ni ILProduccin 1b median la muerte de clulas de islote en respuesta a la alta las
concentraciones de la glucosa.
Mutacin en la activacin de NLRP3 especfico de clulas beta no resulta en la
produccin de IL-1b o amplifica toxicidad de la glucosa
Para determinar si la activacin constitutiva de NLRP3 en beta clulas
exacerbaran toxicidad de la glucosa, aislamos islotes de ratones con una
mutacin activadora de NLRP3 humana golpeado en locus NLRP3 del
raton(NLRP3A350V / A350V) [30]. Esta mutacin es controlada por la enzima
Cre, por lo que mediante el cruce de la NLRP3A350V / A350V ratones mutantes,
que expresan Cre bajo el control de la rata promotor de insulina (RIP-Cre),
hemos generado ratones mutantes de NLRP3 en niveles endgenos pero slo
en las clulas beta del pncreas. La expresin con xito de NLRP3 mutante en
las clulas beta del ratn fue confirmado por PCR usando ADN de islotes
purificados (Figura 3A). Esta mutacin es claramente activa, ya que los ratones
cruzados a LysM-Cre no sobrevivieronn ms all de 14 das, sin embargo los
ratones NLRP3A350V / A350V / RIP cre no tienen cualquier fenotipo manifiesto
(datos no mostrados). Si las clulas beta son capaces de producir IL-1b
significativa en respuesta a la glucosa o la exposicin ribosa, a continuacin,
islotes con NLRP3 constitutiva deberan producir incluso mayores cantidades de
IL-1b que resulta en la amplificacin de la glucosa o la toxicidad de la ribosa.
Contrariamente a esta expectativa, se observ que los islotes con NLRP3
mutante no lo hicieron, no mostraron aumento en la toxicidad de la ribosa en
comparacin con los controles (Figura 3B). Se midi la IL-1b producido
mediante el cultivo de 400 islotes en 1 ml medio de cultivo con 50 mM ribosa o
glucosa 33,3 mM durante 2,5 das. Se ha demostrado previamente que las