Inoculación de Tricho en Cebolla

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BITICOS
CAMBIOS BIOQUMICOS INDUCIDOS EN CEBOLLA POR LA INOCULACIN CON

Trichoderma harzianum Y SU RELACIN CON EL CONTROL DE
Sclerotium rolfsii
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRIA EN CIENCIAS
EN
MANEJO AGROECOLGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES
PRESENTA
JAIME ALBERTO APARICIO BELLO
Yautepec, Morelos; Diciembre 2010
El presente trabajo se realiz en el laboratorio de cultivo de clulas vegetales del

Departamento de Biotecnologa y en el laboratorio de fitopatologa del Departamento de
Interacciones Planta-Insecto del Centro de Desarrollo de Productos Biticos del Instituto
Politcnico Nacional bajo la direccin de los Drs. Gabriela Seplveda Jimnez y Roberto
Montes Belmont. Para la realizacin de los estudios se conto con el apoyo econmico de
CONACyT (becario No. 220003) y del Programa Institucional de Formacin de
Investigadores de la Secretara de investigacin y Posgrado (SIP) del IPN. La investigacin
fue realizada con el financiamiento otorgado a los proyectos de la SIP (No. 20090293 y
20100781).
AGRADECIMIENTOS
A la Doctora Gabriela Seplveda Jimnez, por darme la oportunidad de integrarme en su
grupo de trabajo, ser director de Tesis y apoyarme en cada paso dentro de la Maestra.
Al Doctor Roberto Montes Belmont Belmont, por todas las correcciones y paciencia que le
aplic a este trabajo.
Al Doctor ngel Ren Arzuffi Barrera, por las valiosas observaciones enfocadas a generar
una investigacin ms seria.
A la Maestra en Ciencias Leticia Bravo Luna, por la confianza y motivacin que imprimi
en esta investigacin.
A la Doctora Emma Zavaleta Mejia, por el esfuerzo e inters que mostr en la realizacin
de la investigacin y mi formacin.
A la Maestra Hilda Elizabet Flores Moctezuma, por la confianza que puso en mi persona,
pero sobre todo por su disponibilidad incansable para esta investigacin.
A las Licenciadas Elvia Sosa, Vanessa Yaez y Sara Bahena por la infinidad de apoyos y
consejos que me dieron dentro del Posgrado .
Al Concejo Nacional de Ciencia y Tecnologa, al Programa Institucional de Formacin de
Investigadores y a la Secretaria de investigacin y Posgrado por las becas otorgadas para la
realizacin de mis estudios.
A la Secretaria del Medio Ambiente y Recursos Naturales, por haber confiado en mis
capacidades y proyecto, en especial a los Ingenieros. Noel Cruz, Ral Molina, Armando
Snchez, al Prof. Daniel Vega y a los licenciados Jerusaln Lpez y Oscar Bernab
A mi familia, pilar principal de mi formacin, amigos, compaeros y mi pareja por todos
los apoyos en momentos crticos de mi formacin.
Gracias, a ese ser tan grande y indescriptible que me dio la posibilidad de ser, conocer y
aprender de la vida.
A mis padres y hermanos por estar presentes en cada logro y tropiezo de mi existencia,
gracias por no perder la fe en m.
A mis abuelos, tos y primos por ser tan grandes y cariosos con mi persona. En espacial
para ti Bogart Ignacio+, si empre fuiste una inspiracin para m.
A todos mis amigos que fui cosechando dentro del Posgrado: Humberto, Ral, Jorge, Jan,
Meli, Nadia, Lili, Memo, Layo, Blancas, Edith, por todos los momentos chidos que
pasamos. Ya casi la hacemos compadrito!!
A mi pareja, que en todo momento me demostr su cario y apoyo incondicional, gracias
por estar junto a m, infinitamente gracias Eva.
Contenido
Pgina
ndice
ndice de cuadros
III
ndice de figuras
IV
Resumen
Abstract
V
VII
1. INTRODUCCIN
2. REVISIN DE LITERATURA
2.1 Generalidades de la cebolla
2.2 Diferencias qumicas entre las variedades de cebolla
2.3 Enfermedades en cebolla causadas por hongos de suelo
2.4 Generalidades de Trichoderma
2.5 Efecto de Trichoderma en las plantas
2.6 Efecto de Trichoderma en otros hongos
12
2.7 Generalidades de Sclerotium rolfsii
14
2.8 Sclerotium rolfsii en las plantas
15
2.9 Mtodos de control de Sclerotium rolfsii
17
3. JUSTIFICACIN
19
4. OBJETIVOS
20
5. MATERIALES Y MTODOS
21
5.1 Variedades de cebolla
21
5.2 Cepas de hongos utilizadas
21
5.3 Tratamiento con T. harzianum de las semillas de cebolla y
22
evaluacin de la germinacin
5.4 Evaluacin del efecto de T. harzianum en el desarrollo de las
23
plantas
5.5 Determinacin del contenido total de compuestos fenlicos
24
5.6 Determinacin del contenido total de flavonoides
26
5.7 Evaluacin de la actividad de peroxidasa
27
5.8 Obtencin de extractos acuosos de bulbos de cebolla
28
5.9 Efecto de extractos acuosos de bulbos sobre el crecimiento
28
micelial y produccin de esclerocios de Sclerotium rolfsii.

5.10 Efecto de la inoculacin de T. harzianum en el desarrollo de la
29
severidad de Sclerotium rolfsii

6. RESULTADOS
6.1 Efecto del tratamiento con T. harzianum en la germinacin de
32
32
las semillas
6.2 Desarrollo de la planta en presencia de T. harzianum.
35
6.3 Contenido de compuestos fenlicos en plntulas y bulbos
37
6.4 Contenido de flavonoides totales en plntulas y bulbos.
40
6.5 Actividad de la enzima peroxidasa en bulbos de 8 semanas.
42
6.6 Efecto de extractos acuosos de bulbos sobre el crecimiento
43
micelial y el nmero de esclerocios de Sclerotium rolfsii.

6.7 Efecto de la inoculacin con Sclerotium rolfsii en bulbos de
45
plantas de cebolla de 8 semanas

7. DISCUSIN
47
8. CONCLUSIONES
53
9. LITERATURA CITADA
55
II
NDICE DE CUADROS
Cuadro
1. Principales enfermedades de la cebolla en el estado de Morelos.
2. Germinacin de las semillas de las tres variedades de cebolla tratadas
Pgina
6
33
con T. harzianum.
3. Peso total, de bulbos, hojas y raz de plantas de 8 semanas tratadas con
37
T. harzianum.
4. Crecimiento micelial de S. rolfsii en presencia de extractos acuosos de
44
bulbos.
5. Efecto de extractos acuosos de bulbos en el nmero de esclerocios.
45
6. Efecto de S. rolfsii en el ndice de severidad y nmero de esclerocios
46
presentes en bulbos tratados con T. harzianum.
III
NDICE DE FIGURAS
Figura
1. Situacin nacional de la produccin de cebolla.
2. Germinacin de semillas de la variedad blanca, morada y roja tratadas
Pgina
4
34
con T. harzianum.
3. Aspecto de las plantas a las 8 semanas de tratamiento con T. harzianum
36
y su control
4. Contenido de compuestos fenlicos en plntulas de 8 das.
38
5. Contenido de compuestos fenlicos en bulbos de 8 semanas.
39
6. Contenido de flavonoides totales en plntulas de 8 das.
40
7. Contenido de flavonoides totales en bulbos de 8 semanas.
41
8. Actividad de peroxidasa en bulbos de 8 semanas.
42
IV
Resumen
Este trabajo tuvo como objetivo evaluar el crecimiento, el contenido de compuestos

fenlicos, flavonoides totales y la actividad de peroxidasa en tres variedades de cebolla con
diferentes grados de pigmentacin inoculadas con Trichoderma harzianum y la relacin
con el control a Sclerotium rolfsii. Las variedades de cebolla utilizadas fueron: Cristal
White (blanca), Red Satan (roja) y Mata Hari (morada). Las semillas de cada variedad
fueron germinadas con sustrato inoculado con T. harzianum cepa Tc74. T. harzianum tuvo
un efecto diferencial en la germinacin de las semillas que dependi de la variedad.
nicamente en la variedad blanca, T. harzianum estimul la germinacin. Las plantas de 8
semanas inoculadas con T. harzianum, aumentaron 3 veces su peso total, el de los bulbos
de 2 a 3 veces, el de las hojas hasta 3 veces y el de races de 7 a 11 veces. Las variedades
roja y blanca fueron las ms beneficiadas por el tratamiento con T. harzianum.
En plntulas, el contenido de compuestos fenlicos se increment con respecto a su control,
en un 43.5, 48 y 13 % en las variedades blanca, morada y roja; mientras que el de
flavonoides fue 43.5, 51.6 y 16 % ms alto en las tratadas que en las control de las
variedades blanca, morada y roja. En el caso de los bulbos, el tratamiento con T. harzianum
increment el contenido de compuestos fenlicos con respecto a su control, en un 20, 70 y
30 % en las variedades blanca, morada y roja. nicamente en los bulbos de la variedad
blanca se encontraron diferencias en el contenido de flavonoides entre las muestras tratadas
y el control.
Solamente, en los bulbos de las variedades blanca y morada de las plantas inoculadas con
T. harzianum, la actividad de peroxidasa se increment de 2 a 5 veces.
El crecimiento del micelio solamente disminuy en presencia de los extractos acuosos de

los bulbos de la variedad roja tratada y el nmero de esclerocios de S. rolfsii no se afect
con los extractos acuosos de bulbos de cebollas sin tratar o tratadas con T. harzianum. Sin
embargo, las tres variedades tratadas con T. harzianum tuvieron una menor severidad de la
enfermedad por S. rolfsii. Las variedades pigmentadas tratadas con T. harzianum tuvieron
una disminucin en sus valores de severidad ms evidentes que la variedad blanca.
Todos los resultados muestran que el efecto de T. harzianum en la respuesta bioqumica y
la resistencia a S rolfsii estn relacionadas con el grado de pigmentacin de la variedad de
cebolla.
VI
Abstract
The objective of this work was to evaluate the development, total content of phenolic
compounds and flavonoids, and peroxidase activity from three onion varieties with
different pigmentation and inoculated with Trichoderma harzianum and their relationship
with the control of Sclerotium rolfsii. The onion varieties used were: Cristal White (white),
Red Satan (red) y Mata Hari (purple). Seeds of each variety were germinated with substrate
inoculated with T. harzianum strain Tc74. T. harzianum had a differential effect in the
seeds germination that it was depended of the variety. Only, T. harzianum stimulated the
seed germination of the white variety. In plants of 8 weeks inoculated with T. harzianum
had an increase of the total weight (3 times), of the weight of bulbs (2 to 3 times), of leaves
(3 times), and roots (7 to 11 times). The red and white varieties were the most favored by
the treatment with T. harzianum.
In the seedling, the content of phenolic compounds increased with respect to its control, in
a 43.5, 48 y 13 % in the varieties white, purple and red; while the flavonoid content were
43.5, 51.6 y 16 % higher in the treated samples than in the control of the varieties white,
purple and red, respectively. In the case of bulbs, the treatment with T. harzianum increased
the content of phenolic compounds with respect to its control, in a 20, 70 and 30 % in the
varieties white, purple and red. Only, it was found difference in the flavonoid content of
bulbs of the white variety.
Only, bulbs of the white and purple varieties inoculated with T. harzianum showed a
increase from 2 to 5 times in the peroxidase activity.
VII
The mycelium growth decreased in the presence of the aqueous extracts of bulbs from the
treated red variety and the esclerotia number of S. rolfsii was not affected by the aqueous
extracts of onions bulbs without treatment and treated with T. harzianum. However, the
three varieties treated with T. harzianum had a lower disease severity by S. rolfsii. The
pigmented varieties treated with T. harzianum had a decrease in their severity values more
evident than the white variety.
All the results showed that the effect of T. harzianum in the biochemical response and the
resistance to S. rolfsii are related with the degree of pigmentation of the onion variety.
VIII
1. INTRODUCCIN
Las variedades de cebolla no pigmentadas son menos resistentes a las enfermedades que las
variedades pigmentadas, debido probablemente a diferencias en el contenido de
compuestos antimicrobianos. Walker et al. (1929) mostraron que cebollas moradas
presentaron una mayor resistencia al carbn causado por Colletotrichum circinans
presentaron un mayor contenido de los compuestos fenlicos, cido protocatquico y
catecol; en tanto, las cebollas blancas fueron susceptibles y no se encontraron estos
compuestos.
En el caso especfico del tizn sureo de la cebolla causado por el hongo Sclerotium
rolfsii, una evaluacin de resistencia en variedades utilizadas en el estado de Morelos
mostr que las variedades Blanca Morelos, Early supreme y Mata Hari fueron las menos
susceptibles; por lo que puede existir una relacin entre la resistencia a este patgeno y los
compuestos qumicos presentes en estas variedades (Hernndez-Jimnez et al., 2004).
Los mtodos de control qumico de Sclerotium spp. causan contaminacin del ambiente,
por lo que se propone emplear tcnicas de control. En diversos cultivos, hongos del gnero
Trichoderma son empleados como control biolgico, con la ventaja de inhibir el desarrollo
del patgeno e inducir respuestas de defensa en la planta, tales como la produccin de
compuestos antimicrobianos y la actividad de enzimas como quitinasas, glucanasas y
peroxidasas. En particular, en ensayos in vitro se conoce que Trichoderma harzianum, cepa
Tc74 por parasitismo y antagonismo inhibe el desarrollo y propagacin de Sclerotium
rolfsii. Sin embargo, son escasos los estudios de las respuestas bioqumicas de defensa que
se inducen en la cebolla por el tratamiento con T. harzianum Tc74 y tampoco se conoce si

esto es dependiente de la variedad.
2. REVISIN DE LITERATURA.
2.1 Generalidades de la cebolla

La cebolla (Allium cepa L) es una planta ampliamente cultivada en el mundo que se origin
en Asia Central; muy cerca de Persia donde su cultivo se difundi por todas las regiones del
mundo (SIIT, 2009).
La cebolla forma parte de la familia de las Liliceas. Es una planta bianual, de tallo
subterrneo y reducido. El bulbo es un engrosamiento subterrneo del tallo de la planta. La
raz est formada por los filamentos que nacen en la parte inferior del bulbo. La cebolla
presenta un sistema radicular formado por numerosas raicillas fasciculadas, de color
blanquecino, poco profundas, que salen a partir de un tallo a modo de disco o "disco
caulinar". Las hojas son generalmente suaves de forma tubular, tienen una parte basal,
formada por las "vainas foliares" engrosadas como consecuencia de la acumulacin de
sustancias de reserva, y otra terminal, que es la parte verde y fotosintticamente activa de
la planta. Se reproducen por semillas o por pequeos bulbos plantados (SIIT, 2009).
La cebolla contiene, lecitina, pectina, vitaminas B1, B2, B6, C, E y aminocidos (Corzo et
al., 2007). Es rica en compuestos fenlicos, y flavonoides, que funcionan como
antioxidantes (captacin de radicales libres). En particular, la quercetina es el flavonoide
antioxidante que representa ms del 95% de los flavonoides totales (Rodrguez et al.,
2008).
Debido a la actividad antimicrobiana que la cebolla posee se recomienda su uso para el

control del crecimiento microbiano (Pszczola, 2002).
Varios compuestos activos de la cebolla como la alicina, trisulfuro de dialilo, el ajoene y el
fistulosin (octadecyl 3-hidroxiindol) destruyen las clulas de hongos patgenos (Corzo et
al., 2007).
A nivel mundial, Mxico es el primer productor de cebolla en fresco con ms de un milln
de toneladas por ao. Los principales estados productores son Chihuahua, Baja California,
Tamaulipas, Michoacn, Guanajuato y Morelos. En el estado de Morelos, la produccin
total anual reportada en el 2009 fue de 49 170 000 toneladas, ubicndose en el sptimo
lugar de la produccin nacional (Figura 1). Entre los principales municipios productores
de cebolla se encuentran Axochiapan, Ayala, Tepalcingo, Cuautla y Jonacatepec.
(OEIDRUS, 2009 SAGARPA, 2009).
Figura 1. Situacin nacional de la produccin de cebolla. (SAGARPA, 2009).
2.2 Diferencias qumicas entre las variedades de cebolla

Las cebollas son ricas en flavonoides y en compuestos azufrados (sulfxido alkyl cistena),
responsables de su aroma. Entre los flavonoides, las antocianinas son los responsables del
color rosado o violceo de determinadas variedades de cebolla.
Cokuntuna y zer (2008) reportan que los compuestos antifngicos como los fenoles
solubles en agua y flavonas, podran ser parte de la resistencia en la cebolla a la
germinacin de esporas y la penetracin de hongos patgenos.
Por otro lado, las variedades de cebolla tambin difieren en su contenido de compuestos
fenlicos que pueden estar relacionados con la resistencia ante el ataque de ciertos
patgenos (Walker et al., 1929). Abundando en esta investigacin en estudios posteriores
se encontr que las cebollas pigmentadas contienen cido protocatquico y catecol en
mayor proporcin que las cebollas no pigmentadas. Probablemente las diferencias en el
contenido de estos compuestos estn relacionadas con la resistencia al hongo
Colletotrichum circinans. Las pruebas in vitro mostraron que el catecol es el doble de
efectivo que el cido protocatquico en el control del desarrollo del patgeno
Colletotrichum circinans (Link y Walker 1933).
Las variedades pigmentadas de la cebolla presentan una mayor cantidad de compuestos
fenlicos y de la actividad antioxidante que las variedades no pigmentadas. Al respecto,
Prakash et al., (2007) reportan que las capas externas de los bulbos en la variedad roja
contiene un mayor contenido de compuestos fenlicos que la variedad blanca. Esto se
correlacion con una mayor capacidad antioxidante en la variedad roja que en la variedad
blanca.
2.3 Enfermedades en cebolla causadas por hongos de suelo

Como varias plantas hortcolas, la cebolla es atacada por varios microorganismos que
reducen su productividad y calidad. Los patgenos ms comunes que atacan las races y
bulbos de la cebolla son del gnero Pythium, Fusarium, Rhizoctonia y Sclerotium ((Lara y
Garca, 1995; Entwistle, 1990). Para el estado de Morelos, Montes et al. (2003) reportan
que en los almcigos de los principales municipios productores de cebolla, se encontr
principalmente la incidencia de patgenos de los
gneros
Fusarium, Rhizoctonia,
Curvularia, Phoma, Alternaria, Sclerotium, Bipolaris, Rhizopus y Penicillium. De todos

estos, Fusarium, Sclerotium y Colletotrichum fueron los que ms daos causaron a la
cebolla con una incidencia de 82, 89 y 39 % respectivamente (Cuadro 1).
Cuadro 1. Principales enfermedades de la cebolla en el estado de Morelos.
Enfermedad
Pudricin de bulbo y raz
Tizn sureo
Ahumado de la cebolla
Agente causal
Presencia
Fusarium oxysporum
Campo y almacn (82%)
Sclerotium rolfsii
Campo y almacn
(89%)
Colletotrichum circinans
Campo
(39 %)
Montes et al., 2003.
2.4 Generalidades de Trichoderma

En laboratorio, los cultivos de Trichoderma en un inicio tienen color blanco
posteriormente toman un
color verde brillante con esporulacin densa, debido a los
conglomerados de conidios que se forman en las puntas de las hifas. El micelio es en su

mayora ralo y fino. Los conidiforos son ramificados, parecen un rbol pequeo y
presentan como penachos compactados que forman anillos con un sistema de ramas
irregular de manera piramidal. Terminan en filides donde se forman las esporas asexuales
o conidios haploides y su pared est compuesta por quitina y glucanos. Adems de los
conidiforos, las espora se pueden producir sobre filides que emergen directamente del
micelio (Harman, 2000).
Los hongos del gnero Trichoderma, se encuentran en ecosistemas terrestres (suelos
agrcolas, pastizales, bosques y desiertos) y acuticos. Algunas especies son de vida libre en
el suelo, oportunistas, simbiontes de plantas, y otras son micoparsitas. Los requerimientos
nutrimentales de estos hongos filamentosos son pocos, aunque su crecimiento es favorecido
por la materia orgnica, y la humedad. Trichoderma se pueden encontrar en la rizsfera,
donde es capaz de competir por nutrimentos y espacio con otros microorganismos. Adems,
este grupo fngico es importante para las plantas, al contribuir en el control de hongos
fitopatgenos ya que poseen propiedades micoparasticas y antibiticas, por lo que algunas
especies son catalogadas como excelentes agentes de control biolgico de hongos causantes
de enfermedades para diferentes plantas hortcolas (Druzhinina y Kubicek 2005).
La poblacin de Trichoderma decrece especialmente cuando la humedad del ambiente
desciende por largos perodos de tiempo. Otros estudios indican que el pH, la concentracin
de C02, H2C03, otras sales y el contenido de materia orgnica son factores fsicos y
qumicos determinantes de la variacin poblacional de Trichoderma, adems de la
presencia o ausencia de otros microorganismos en el ambiente (Fonseca, 1998).
El intervalo de temperatura para el crecimiento de Trichoderma se encuentra entre los 10 y
los 40 C, con una ptima de 25 C (Alexopoulos et al., 1996). El contenido de humedad
que favorece el crecimiento de Trichoderma se encuentra alrededor del 70 y el 80%
(Wakelin et al., 1999).
Para su crecimiento Trichoderma tiene un intervalo de pH relativamente amplio,
comprendidos entre 2.0 y 9.0, con un pH ptimo entre 4.0 y 7.0 (Domsch et al., 1980).
Trichoderma es un hongo, hetertrofo, aerobio, con una pared celular compuesta de quitina,
de rpido crecimiento que puede utilizar como fuente de carbono a una gran variedad de
sustratos complejos como celulosa, quitina, pectina y almidn, aunque puede emplear
tambin cidos orgnicos y monosacridos como fuente de carbono. Asimismo,
Trichoderma asimila como fuente de nitrgeno compuestos tales como aminocidos, urea,
nitritos, amoniaco y sulfato de amonio. Muchas cepas crecen eficientemente en medios
slidos o lquidos y en un amplio intervalo de temperaturas, adems son relativamente
tolerantes a humedades bajas y tienden a crecer en suelos cidos (Moore, 1996; Harman et
al., 1981).
2.5 Efecto de Trichoderma en las plantas

En plantas la resistencia inducida localizada y sistmica, se produce en respuesta al ataque
de microorganismos patgenos, al dao fsico por insectos, factores ambientales, al
tratamiento con diversos inductores qumicos y a la presencia de rizobacterias no
patgenas. Trichoderma spp. tiene la capacidad de inducir en las plantas cambios en la
resistencia contra patgenos. En muchos casos, stas respuestas son resultado de efectos
directos sobre las plantas, como disminucin de la actividad de la microflora nociva en la
raz, la generacin de compuestos txicos en la zona radicular, aumenta la absorcin y
traslocacin de los minerales menos disponibles en la plantas y adems puede contribuir a
solubilizar nutrientes en el suelo (Harman et al., 2004b; Yedidia et al. 2001).
La colonizacin de races por Trichoderma spp. induce cambios significativos en la planta,
especficamente en la maquinaria metablica. Harman et al. (2004a) obtuvieron los
proteomas de plntulas de maz procedentes de semillas tratadas con Trichoderma cepa T22. Aproximadamente el 40% de las protenas que se vean en las muestras tratadas con la
cepa T-22 no se encontraron en las plntulas no tratadas. Estos autores concluyeron que
Trichoderma puede modificar fuertemente el metabolismo vegetal.
En algodn, la cepa T. virens indujo la produccin de fitoalexinas y resistencia localizada;
mientras que en pepino, la colonizacin de la raz por Trichoderma cepa T-203 caus un
aumento en los niveles de fenlicos glucosilados en las hojas, los cuales estn fuertemente
asociados a la inhibicin del crecimiento de una serie de bacterias y hongos (Harman et al.,
2004b).
Trichoderma se puede localizar tanto fuera como dentro de la rizsfera; pero es en la

rizsfera donde principalmente coloniza y protege las races de las plantas (Lorito, 1998).
Al respecto Sid et al. (2000) reportan que semillas de chile tratadas con Trichoderma
harzianum reduce el progreso de la necrosis causada por Phytophthora capsici en los tallos
de plantas de chile. T. harzianum persiste en la semilla tratada y prolifera en las races,
ejerciendo una proteccin sobre la parte area.
Adems de micoparasitismo y antibiosis, otros mecanismos de proteccin con el que acta
Trichoderma incluye la competencia por nutrientes o espacio, el control de microflora
deletrea de la raz, tolerancia al estrs a travs de un incremento en el desarrollo de la raz
y de la planta, induccin de resistencia, solubilizacin de nutrientes inorgnicos e
inactivacin de las enzimas de los patgenos (Harman, 2000; Alatonare et al., 1999;
Kleifeld y Chet. 1992).
Diferentes especies de Trichoderma incrementan el crecimiento radical, el desarrollo y peso
de las plantas mediante una serie de mecanismos (Lorito, 1998).
En plantas de chile, la presencia de Trichoderma increment la emergencia de plntulas,
tamao, rea foliar y peso seco (Kleifeld y Chet 1992). Cruz y Cisterna (1998) indican que
T. harzianum en chile, increment la longitud y el peso seco de races, la altura de planta, el
nmero y peso seco de hojas, el rea foliar, el dimetro de tallos y nmero de flores. En
este mismo sentido, Gravel et al. (2007) reportaron que la produccin in vitro del cido
indolactico (AIA) en raz de tomate se increment con la presencia de T. atroviride en
comparacin con el control as como tambin se acumul fosforo en hoja. Conjuntamente
se increment la longitud y el peso fresco del tallo, y de las races en plntulas inoculadas.
10
La solubilizacin de fosforo en la raz se asocia a menudo con la promocin del

crecimiento vegetal. El equilibrio entre el crecimiento vegetativo y reproductivo es
controlado por hormonas de sealizacin dentro de la planta y pueden por lo tanto influir en
ste. En concentraciones relativamente altas, las auxinas naturales, como AIA, estimulan la
elongacin de ramas, mientras que la reduccin de este, genera la elongacin de la raz.
Yedidia et al., (2000) reportaron que la respuesta general de defensa de las plantas incluye
la induccin de protenas como respuesta a patognesis, la acumulacin de fitoalexinas, y la
deposicin de polmeros estructurales, como la calosa y lignina. Se hace especial hincapi
en la acumulacin de hidrolasas en la planta, tales como quitinasas y -1,3-glucanasas, con
potencial antimicrobiano. Otro grupo de enzimas incluye las peroxidasas, las cuales juegan
un papel clave en los mecanismos de resistencia de la planta, ya que estn involucradas en
la formacin de barreras estructurales.
Las isoenzimas de peroxidasa contribuyen a la produccin de un entorno fungitxico para
hongos patgenos, generalmente asociado a la aparicin de lesiones o la penetracin de
stos. La generacin de dichos compuestos parece jugar un papel en la tolerancia de la raz
de la planta a la colonizacin por patgenos (Yedidia et al., 2000).
En particular, para el caso de cebolla, Cokuntuna y zer (2008) germinaron semillas de
cebolla con esporas de Trichoderma y despus de ponerlas en contacto con el hongo F.
oxysporum, encontraron que la interaccin Trichoderma-semilla redujo en un 73 % el
crecimiento del hongo patgeno. Este mismo efecto se obtuvo en campo, con lo que
concluyeron que T. harzianum tiene la capacidad de estimular la produccin de compuestos
qumicos asociado con una mayor proteccin contra la pudricin basal causada por F.
oxysporum
11
2.6 Efecto de Trichoderma en otros hongos

El gnero Trichoderma est compuesto por un gran nmero de especies que actan como
agentes de control biolgico debido a sus propiedades antagonistas. Las cepas de
Trichoderma ejercen un biocontrol contra hongos fitopatgenos de manera indirecta a
travs de la competencia por nutrientes y espacio, modificando las condiciones
medioambientales, promoviendo el crecimiento, los mecanismos de defensa y la antibiosis
en las plantas; o directamente por mecanismos como el micoparasitismo.
Los mecanismos directos e indirectos actan coordinadamente y su importancia en el
proceso de biocontrol depende de la cepa de Trichoderma empleada, el hongo contra el
cual ejercer control como antagonista, el tipo de planta o cultivo, adems de las
condiciones ambientales como pH, disponibilidad de nutrientes, temperatura y
concentracin de hierro, principalmente (Bentez et al, 2000).
La lisis es el mecanismo en el cual intervienen las enzimas hidrolticas producidas por los
microorganismos antagonistas como factores biocontroladores. Trichoderma causa la lisis
de la pared celular de hongos patgenos y esta actividad se correlaciona con el grado de
control biolgico que se puede obtener por parte de Trichoderma (El-Katatny et al., 2001).
Trichoderma spp. produce celulasas que degradan in vitro la celulosa de las paredes
celulares de microorganismos Oomicetos; adems de glucanasas y quitinasas que catalizan
la hidrlisis de la quitina y de los -1,3 glucanos de las paredes celulares de
microorganismos Deuteromicetos (Cotes, 1993).
12
Los principales mecanismos por los cuales Trichoderma spp. lleva a cabo su antagonismo
contra los patgenos de las plantas incluyen la degradacin y posterior asimilacin de los
hongos (De la Cruz et al,.1995). Esta actividad antifngica involucra la produccin de
antibiticos, incluyendo compuestos que afectan la integridad de las membranas fungosas,
competencia por nutrientes clave y la produccin de enzimas que degradan la pared celular
de los hongos (Ait-Lahsen et al., 2001). A nivel celular causan vacuolacin, granulacin,
coagulacin, desintegracin y lisis (Bell et al.. 1982; Chet y Baker, 1981).
En el caso de Oomycetes sp. cuya pared celular contiene - 1,3-glucano y celulosa, se
sugiere que la -1,3-glucanasa es la enzima principal en la lisis de la pared celular durante
la accin micoparastica (De la Cruz et al.1995); mientras que en Botrytis cinerea.
(Deuteromycete)
las enzimas quitinoltica y glucanolticas de T. harzianum P1
interactuaron sinrgicamente en la inhibicin de la germinacin de las esporas y la

elongacin de las hifas de Sclerotium rolfsii (El-Katatny et al., 2001).
Harman (2000), describe el proceso de micoparasitismo como un proceso complejo, que
involucra el crecimiento trfico del agente de biocontrol hacia el hongo objetivo, el
enrollamiento mediado por lectina y la adherencia de las hifas en torno al patgeno.
Finalmente el ataque y disolucin de la pared celular ocurre por la actividad de las enzimas
que puede asociarse con una penetracin fsica de la pared celular.
Diversas especies de Trichoderma se asocian con un antagonismo de la fase vegetativa de
Phytophthora. En este caso, Trichoderma crece sobre Phytophthora y parasita sus hifas, el
proceso se lleva a cabo gracias a metabolitos voltiles o solubles, los cuales reducen el
13
crecimiento del patgeno, seguido por una vacuolacin del contenido celular que
eventualmente resulta en lisis de las hifas del patgeno (Harman, 2000).
2.7 Generalidades de Sclerotium rolfsii

Sclerotium rolfsii es un hongo que en condiciones favorables produce abundante micelio en
los tejidos infectados. Las hifas son relativamente grandes, de 5 a 9 micrones de dimetro.
Son hialinas de paredes delgadas en forma de gancho a nivel de las septas. El micelio al
crecer tiende a formar rizomorfos que ya crecidos se expanden en forma de abanico,
teniendo una coloracin blanca. Una vez infectados los tejidos, la masa de micelio puede
aparecer de 2 a 10 das. La penetracin ocurre cuando el patgeno produce una enzima que
destruye las paredes de las clulas externas del hospedero, resultando una destruccin de
los tejidos y en la formacin de micelio y esclerocios. Aproximadamente despus de 7 das
de la infeccin, aparecen los esclerocios, que se forman a partir del micelio cuando los
rizomorfos se entrecruzan y empiezan a formar cuerpos esfricos inicialmente blancos y
despus toman una coloracin caf claro u obscura. Estos esclerocios miden en promedio
de 0.5 a 2.0 mm de dimetro, pero algunos pueden llegar a 8 10 mm de dimetro (Singh y
Dwivedi 1991).
El hongo sobrevive en forma de segmentos de hifas o esclerocios en plantas infectadas o
residuos de plantas en el suelo, no produce ningn tipo de espora asexual (Punja, 1985).
14
Es un patgeno esencialmente de suelo, que causa enfermedad en un amplio intervalo de

hospederos, ms de 500 plantas en el mundo, como son frutales, malezas, hortalizas y
plantas forestales (El-Katatny et al.,2001).
S. rolfsii es capaz de sobrevivir en un amplio intervalo de condiciones ambientales, el pH
ptimo de crecimiento del micelio es de 3.0 a 5.0 y la germinacin de los esclerocios ocurre
entre pH de 2.0 y 5.0.
La germinacin se inhibe a pH mayor de 7.0 y el mximo
crecimiento del micelio ocurre entre 25 y 35 C con muy poco desarrollo o ninguno a 10 o
40 C. El micelio muere a 0 C, y los esclerocios sobreviven a temperaturas de -10 C. El
crecimiento del micelio y la germinacin de los esclerocios ocurren rpidamente con luz
continua, pero tambin puede desarrollarse en obscuridad completa si las condiciones son
favorables (Punja, 1985).
2.8 Sclerotium rolfsii en las plantas

Al ser un patgeno de suelo, S. rolfsii se desarrolla en la naturaleza cerca o sobre la
superficie del mismo y usualmente ataca el cuello de la raz de la planta. Como primer
sntoma, se presenta una lesin acuosa en la base de los tallos a nivel de la superficie del
suelo, despus se extiende rpidamente y estrangula al tallo; en las plantas herbceas y
plntulas las plantas se marchitan y se caen. En las plantas maduras de tomate y chile la
corteza del tallo se pudre, pero el cilindro central permanece sano; conforme avanza la
pudricin, las plantas se marchitan pero permanecen erectas. En muchos hospederos las
hojas marchitas gradualmente se vuelven cafs y quedan colgando (Aycock, 1966).
15
Cuando los tallos de las plantas herbceas se deterioran aparecen masas de micelio blanco
en el sitio de la lesin, la cual puede extenderse en el suelo circundante al tallo. Poco
despus que aparece la masa de micelio se empiezan a formar cuerpos redondeados de
color blanco que posteriormente s tornan lisos y de color caf claro, caf obscuro o negro
llamados esclerocios, estos son las estructuras de resistencia que le sirven para sobrevivir
en condiciones adversas (Punja, 1985).
Los esclerocios se forman en los tejidos enfermos cerca de la superficie del suelo. En
bulbos y los tubrculos los tejidos se vuelven blandos y se colapsan, formndose micelio en
las reas podridas (Aycock, 1966).
Los esclerocios pueden persistir en los suelos por varios aos. Cuando los bulbos o races
carnosas son infectados, es frecuente que se desarrolle una pudricin de las escamas
externas o los tejidos internos de la raz. Todo el bulbo o la raz puede pudrirse,
desintegrarse y ser sustituido por los restos de la planta entretejidos con el micelio del
hongo (Aycock, 1966). En la cebolla, Sclerotium rolfsii genera amarillamiento y marchitez
empezando por las partes ms bajas, los bulbos se vuelven blandos y se colapsan (Jenkins y
Averre 1986).
16
2.9 Mtodos de control de Sclerotium rolfsii

Para el control de Sclerotium rolfsii se usan mtodos qumicos, culturales y
alternativamente el control biolgico, el cual tiene un efecto a largo plazo y un menor
impacto ambiental (Montes-Belmont et al., 2003). S. rolfsii es diseminado a travs de
prcticas culturales como el barbecho o el arado del suelo contaminado, trasplante de
plntulas contaminadas, el agua, el viento y por propagaciones vegetativas y semillas.
Dentro de las prcticas culturales que se recomiendan para el control de Sclerotium est el
arado profundo y superficial (Jenkins y Averre, 1986). Tambin estn las prcticas de
exclusin, remocin de plantas y suelo, tratamiento de suelo, tratamiento de plantas,
rotacin de cultivos, uso de variedades resistentes o una combinacin de todas estas
prcticas. La siembra en reas con climas fros es una condicin en donde el hongo no se
desarrolla; la remocin de plantas enfermas cuando empiezan a parecer sntomas de la
enfermedad puede ayudar a reducir las fuentes de inculo primario. En algunos casos la
remocin del suelo de reas localizadas de infeccin puede evitar la diseminacin. El
tratamiento del suelo con solarizacin, la aplicacin de fungicidas o fumigantes de suelo,
los abonos orgnicos, los fertilizantes o los tratamientos biolgicos pueden ayudar a
controlar a S. rolfsii (Singh y Dwivedi, 1991).
La aplicacin de fertilizantes como amonio, urea, nitrato de amonio y bicarbonato de
amonio, que liberan amoniaco inhibe la germinacin de esclerocios y retarda el desarrollo
del micelio y adems aumenta la microflora antifngica del hongo. Los fertilizantes de
calcio incrementan los niveles de calcio en los tejidos de las plantas y esto protege de la
17
accin del cido oxlico y enzimas degradadoras de la pared celular producidas por el
hongo (Punja, 1985).
Otro mtodo que se recomienda es la adicin de cal al suelo para subir el pH a 6.5 y as
evitar el rpido desarrollo del hongo. Las densidades de siembra deben ser ms espaciadas
para prevenir el contagio entre plantas (Jenkins y Averre 1986).
En el control qumico se utilizan comnmente fungicidas como el pentacloro-nitrobenceno
(PCNB). La aplicacin de ste y otros productos en grandes superficies no es prctico, por
los grandes volmenes de producto que se requieren. Adems de que el efecto del PCNB
vara ao con ao y se han encontrado cepas del hongo patgenos resistentes al PCNB
(Shim et al., 1998).
El control biolgico se efecta con los hongos Trichoderma, Penicillium spp. y
Gliocladium virens o con la bacteria Bacillus subtilis (Cokuntuna y zer,, 2008).
Penicillium notatum tambin mostr en pruebas de laboratorio e invernadero una accin
antagnica. Inhibe la germinacin de esclerocios, invasin y maceracin de stos, supresin
del crecimiento saprfito y de la produccin de esclerocios del patgeno (Daz y Castro,
1977).
18
3. JUSTIFICACIN
Mxico es el primer productor mundial de cebolla, esta es la tercera hortaliza ms
consumida en el pas. Como otras hortalizas, las enfermedades causadas por hongos
reducen la produccin y calidad del producto final. Diversos estudios proponen que las
variedades blancas son menos resistentes a las enfermedades que las pigmentadas,
diferencia que puede estar relacionada con el contenido de compuestos antimicrobianos.
Entre los hongos que infectan a la cebolla destacan especies del gnero Sclerotium. Para su
control se usan mtodos qumicos a la par de los culturales y una alternativa puede ser el
control biolgico. Este ltimo tiene un efecto a largo plazo, un menor impacto ambiental y
econmico en agricultores. En tal sentido, se propone el uso de Trichoderma harzianum,
que es un hongo que inhibe el desarrollo y propagacin de Sclerotium. Se ha reportado que
T. harzianum induce cambios en el crecimiento y en la resistencia de varias plantas. Sin
embargo, no se conoce si el tratamiento con T. harzianum en variedades de cebolla induce
respuestas bioqumicas que las protejan contra S. rolfsii. Por lo cual, es importante evaluar
los cambios bioqumicos inducidos en tres variedades de cebollas (blanca, morada y roja)
tras la inoculacin con T. harzianum y su relacin con el control de Sclerotium rolfsii.
19
4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Evaluar el efecto de Trichoderma harzianum Tc74 sobre la germinacin, desarrollo, el
contenido de compuestos fenlicos, flavonoides y actividad de peroxidasa de tres
variedades de cebolla con diferentes grados de pigmentacin y su relacin con el control
de Sclerotium rolfsii.
4.2 Objetivos especficos
Evaluar el efecto de la inoculacin con Trichoderma harzianum sobre la germinacin y el
desarrollo de tres variedades de cebolla.
Determinar en plantas inoculadas con Trichoderma harzianum: el contenido de compuestos
fenlicos y flavonoides totales, la actividad de peroxidasas y la incidencia de Sclerotium
rolfsii.
20
5. MATERIALES Y MTODOS
5.1 Variedades de cebolla

Para este trabajo se usaron 3 variedades de cebolla: (1) Crystal White (blanca)
de
produccin mexicana, (2) Red Satn (roja) producida por la empresa Nunhems (USA) y
(3) Mata Hari (morada) producida por la empresa Service Plus (Francia) dentro de la lnea
comercial Pour le Got. Las semillas de las variedades blanca y roja se adquirieron del
distribuidor Rancho los Molinos S. A. de C. V..
5.2 Cepas de hongos utilizadas

De la coleccin de cepas del Laboratorio de Fitopatologa del CeProBi, se utiliz la cepa 12
de Sclerotium rolfsii, que proviene de plantas de frijol, colectada en Yautepec, Morelos.
Esta cepa fue seleccionada por su capacidad de produccin de esclerocios y su mayor
severidad (Ruiz, 2010).
La cepa Tc74 de Trichoderma harzianum, fue proporcionada por el M. en C. Csar
Guign-Lpez del Centro de Investigacin para los Recursos Naturales, Chihuahua. Esta
cepa mostr diferencias altamente significativas en su crecimiento y actividad
micoparsitica in vitro contra el patgeno Phytophthora capsici (Guign-Lpez y
Gonzlez-Gonzlez, 2003).
21
5.3 Tratamiento con T. harzianum de las semillas de cebolla y evaluacin de la

germinacin
De cada una de las tres variedades, se pusieron 100 semillas en una caja Petri
acondicionada con crculos de papel (servitoalla).
El inoculo de T. harzianum, se prepar colocando en un vaso de precipitado y con agitacin
suave, 15 ml de agua destilada con 0.170 g de granos de trigo inoculados con T. harzianum,
conteniendo 4.08 x 107 esporas/ ml. Posteriormente esta mezcla se adicion a cada una de
las cajas Petri con las semillas. En el caso de los controles, a cada caja se le adicion 15 ml
de agua destilada. Cada 24 horas se cuantific el nmero de semillas germinadas.
El valor de n fue de 5. Se obtuvieron los promedios y la desviacin estndar de cada
determinacin. Se aplic un anlisis de varianza de una sola va (p<0.05) y se aplic la
prueba de Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.
La viabilidad de las semillas se expres como el porcentaje de germinacin calculado con
la siguiente frmula:
Donde:
Ng = nmero de semillas germinadas al ltimo da de la medicin
Nt= nmero total de semillas que se pusieron a germinar (en este caso, 100 semillas)
22
Para calcular la velocidad de germinacin, se consideraron los valores de la fase lineal de la

curva de germinacin de cada repeticin (en todos los casos fueron del da 3 al da 6) con
los que se obtuvieron las ecuaciones de regresin, donde la pendiente represent la
velocidad de germinacin expresada como el nmero de semillas germinadas por da.
Para la velocidad de germinacin el valor de n fue igual a 5. Con todos los resultados se
obtuvieron los promedios y la desviacin estndar de cada determinacin. Se aplic un
anlisis de varianza de una sola va (p<0.05) y se aplic la prueba de Tukey para obtener
las diferencias entre los tratamientos.
5.4 Evaluacin del efecto de T. harzianum en el desarrollo de las plantas

Las semillas de las tres variedades se pusieron a germinar en condiciones ambientales en
almacigo (29 3 C) con una mezcla de sustrato: Metromix y Peat Moss en una proporcin
de 3:1 (p:p). Las plntulas se dejaron en almacigo por 30 das y posteriormente se
trasplantaron a macetas de 1 kilogramo y medio.
El sustrato que se utiliz para las plantas se mezcl con granos de trigo inoculado con T.
harzianum a una concentracin de 4.08 x107 esporas/ kg de sustrato (Bravo y Ruz 2008).
Los controles fueron plantas crecidas sin la inoculacin de T. harzianum. Las plantas de
cebolla se regaron cada tercer da con 400 ml de agua por maceta. Cada 20 das se fertiliz
con triple 17 (Nitrgeno-Fsforo-Potasio) en una proporcin de 2 g/ L. Para mantener el
23
nmero de esporas en el sustrato, mensualmente, a cada maceta se le adicion 0.170 g de

trigo inoculado con Trichoderma, equivalente a 4.08 x107 esporas/ kg de sustrato.
Despus de 8 semanas, las plantas se extrajeron de sus macetas, se les retir el exceso de
sustrato en races y bulbos, y se midi el peso total, el peso de las hojas, del bulbo y de las
races.
El valor de n fue igual a 4. Con todos los resultados se obtuvieron los promedios y la
desviacin estndar. Se aplic un anlisis de varianza de una sola va (p<0.05) y se aplic
la prueba de Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.
5.5 Determinacin del contenido total de compuestos fenlicos

Para obtener el extracto con metanol, en el caso de las plntulas de 8 das se tom todo el
tejido y para el caso de las plantas de 8 semanas se utiliz slo tejido de los bulbos. En
ambos casos, el tejido se sec a temperatura ambiente y se macer en un mortero hasta
obtener un polvo fino. De donde se tomaron 0.20 g que se colocaron en un tubo Eppendorf,
se le adicion 2 ml de metanol al 100 %, se homogeniz con un macerador manual y se
centrifug a 3000 rpm. El sobrenadante se separ y se us para realizar las diferentes
evaluaciones.
Para la determinacin de compuestos fenlicos se sigui el mtodo reportado por Shohael
et al. (2006). Para esto, se tomaron 100 l del sobrenadante y se deposit en un tubo de
ensaye para despus adicionarle 2.5 ml de agua destilada ms 100 l del reactivo de Foln-
24
Ciocalteu. Se mezcl en un vortex y se dej reposar por 6 minutos. Posteriormente se

aadieron 500 l de carbonato de sodio al 20%, se mezcl y se puso a incubar por 30
minutos.
La absorbancia se ley a 760 nm en un espectrofotmetro (Thermo Spectronic, modelo
Genesys 2).
Para calcular el contenido total de compuestos fenlicos en las muestras se utiliz como un
estndar al compuesto fenlico, cido glico. Con ste compuesto fenlico a diferentes
concentraciones se construy una curva estndar. La ecuacin de regresin que se obtuv
de la curva estndar fue:
y = 0.08x 0.0098
en donde x es la concentracin expresada en g de Ac. glico/mL y y es la absorbancia
a 760 nm.
Los resultados fueron expresados como mg equivalentes de cido glico (mg EAG) por
gramo de peso seco (g PS).
25
5.6 Determinacin del contenido total de flavonoides

Para determinar el contenido total de flavonoides, se parti del mismo extracto metanlico
utilizado en la determinacin de compuestos fenlicos y siguiendo el mtodo reportado por
Shohael et al, (2006). De este extracto se tomaron 250 l, a los que se les agreg 1.25 ml de
agua desionizada ms 75 l de nitrito de sodio al 5 %. Se mezclaron en vortex y se dej
reposar por 6 minutos.
A esta mezcla, se le adicion 150 l de cloruro de aluminio al 10 % y nuevamente se pus
a reposar por 5 minutos. Posteriormente se aadieron 500 l de hidrxido de sodio 1M ms
2.5 ml de agua desionizada y se dej reposar por 30 minutos. Despus de ste tiempo, se
ley la absorbancia a una longitud de onda de 510 nm.
Para cuantificar el contenido total de flavonoides en las muestras, se utiliz como un
estndar al flavonoide, catequina. Con el que se construy una curva estndar con
diferentes concentraciones de catequina.
La ecuacin de regresin de la curva estndar fue:
y = 0.0069x + 0.0004
donde x es la concentracin expresada en g de catequina/mL y y es la absorbancia a
510 nm.
Los resultados fueron expresados como mg equivalentes de catequina (mg EC) por gramo
de peso seco (g PS).
26
5.7 Evaluacin de la actividad de peroxidasa

Para efectuar la evaluacin de la actividad de la enzima peroxidasa se sigui el mtodo
descrit por Stasolla y Yeung (2007). El buffer de extraccin contena fosfato de sodio 100
mM, EDTA 1mM, DTT 1mM, a pH 7. Se tomaron 200 mg de tejido vegetal fresco de cada
bulbo que se homogeneiz con un macerador manual con 1.5 ml de buffer de extraccin.
El extracto se centrifug a 3000 rpm y el sobrenadante se separ y se us como el extracto
enzimtico.
Para realizar el ensayo de la enzima se prepar una mezcla que contena: 798 l de buffer
de fosfato de sodio 50 mM (pH 6), 100l del extracto enzimtico, 100 l de H2O2 al 0.3% y
1 l de guayacol 3M. Toda la mezcla se agit vigorosamente y se ley la absorbancia en el
espectrofotmetro a una longitud de onda de 470 nm. La actividad de la enzima se expres
como moles de tetraguayacol/ min/ g de peso fresco.
El valor de n fue igual a 5. Con los resultados se obtuvieron los promedios y la desviacin
estndar. Se aplic un anlisis de varianza de una sola va (p<0.05) y se aplic la prueba de
Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.
27
5.8 Obtencin de extractos acuosos de bulbos de cebolla

Los bulbos frescos de cebolla tratada y control, se sumergieron en hipoclorito de sodio al 3
% por tres minutos, se enjuagaron con agua destilada estril y se secaron. En un mortero se
maceraron 40 g de tejido hasta llegar a una pasta suave y homognea, se le adicionaron 100
ml de agua destilada y sta mezcla se centrifug a 10 000 rpm por 10 minutos a 4 C. El
sobrenadante (extracto) se filtr al vacio con papel filtro Whatman No. 1 y se esteriliz por
filtracin a travs de una membrana de nitrocelulosa de 0.22 m (Millipore). Con el
extracto esterilizado se prepar medio de cultivo conteniendo extracto al 20%. Para esto, 16
ml del extracto esterilizado se adicionaron y homogeneizaron con 64 ml de medio Papa
Dextrosa Agar (PDA) estril a una temperatura entre los 30 a 35 C. El medio de cultivo se
vaci en cajas Petri y se dej solidificar. Todo se realiz bajo condiciones de asepsia.
5.9 Efecto de extractos acuosos de bulbos sobre el crecimiento micelial y produccin

de esclerocios de Sclerotium rolfsii
Cada una de las cajas Petri que contena extracto de cebolla tratada con T. harzianum,
extracto de cebolla sin tratar y PDA (sin extracto) se inocularon con S. rolfsii, Para esto, se
coloc un disco de micelio de 5 mm en el centro de cada caja Petri y se incubaron a 27 C.
Para cada uno de los tratamientos se realizaron 5 repeticiones y su control. Las variables de
respuesta fueron: el crecimiento micelial y la produccin de esclerocios.
28
El rea de crecimiento micelial (mm2) de S. rolfsii se evalu al tercer da de incubacin en

ausencia y/o presencia del extracto acuoso. S tomaron fotografas digitales diariamente de
los tratamientos y con ayuda del software ImageJ (versin 1.4) se calcul el rea de
crecimiento. Despus de evaluar el crecimiento micelial todas las cajas Petri se
mantuvieron a temperatura de laboratorio (28 3 C) por 30 das. Al final de ste periodo
se cuantific en cada caja Petri el nmero total de esclerocios.
El valor de n fue igual a 5. Con todos stos resultados se obtuvieron los promedios y la
5.10 Efecto de la inoculacin de T. harzianum en la severidad de dao de Sclerotium

rolfsii
Para obtener el inoculo de S. rolfsii, a bulbos de cebolla comercial se les realiz un corte
de 3 cm2, donde se colocaron discos con micelio del hongo y se mantuvieron a temperatura
de laboratorio por tres das en una cmara hmeda.
Los bulbos de cebolla de 8 semanas tratadas y sin tratar con T. harzianum se inocularon
colocando en cada uno, cuatro discos de 5 mm de dimetro con micelio de S. rolfsii
proveniente de los bulbos de cebolla comercial infectados. La humedad del sustrato se
mantuvo constante para favorecer el crecimiento micelial del hongo. Cada dos das, se
monitorearon las plantas para ver el avance del patgeno. Despus de 15 das de
29
observacin se procedi a extraer las plantas del sustrato para evaluar la severidad del
patgeno en los bulbos de cada una de las variedades y su control.
El ndice de severidad se evalu en 15 plantas por tratamiento utilizando la ecuacin
reportada por Hernndez et al. (2004).
La frmula utilizada para estimar el ndice de severidad fue
Donde: IS = ndice de severidad; XKi = Nivel del dao en el momento i

Nki = Nmero de plantas con dao en el momento i
Nj= Nmero total de plantas evaluadas
La escala nominal que se utiliz fue:
1: plantas sanas
2: plantas sin sntomas, con esclerocios en el suelo
3: plantas amarillentas con presencia de micelio y esclerocios a su alrededor
4: plantas con sntomas de marchitez y pudricin adems de micelio y esclerocios
Para cada tratamiento tambin se evalu el nmero esclerocios por planta y se obtuvo el
promedio y la desviacin estndar. El valor de n fue igual a 15. Los datos fueron analizados
30
con un anlisis de varianza de una sola va (p<0.05) y se aplic la prueba de Tukey para
obtener las diferencias entre los tratamientos.
31
6. RESULTADOS
6.1 Efecto del tratamiento con T. harzianum en la germinacin de las semillas

La viabilidad de las semillas de las tres variedades de cebolla oscilo entre 76 y 93 %
(Cuadro 2). A los 7 das, en la variedad blanca tratada con T. harzianum se encontr un
mayor nmero de semillas germinadas por da y una mayor velocidad de germinacin que
su control (Figura 2a y Cuadro 2). Por el contrario, en las otras dos variedades, a los 7 das
de germinacin se encontr en el control un mayor nmero de semillas germinadas por da
que en las tratadas con T. harzianum (Figuras 2b y c). Sin embargo, el anlisis estadstico
indico que en la variedad morada la velocidad de germinacin fue similar; mientras que en
la variedad roja la velocidad de germinacin fue mayor en el control que en las semillas
tratadas con T. harzianum (Cuadro 2).
32
Cuadro 2. Germinacin de las semillas de las tres variedades de cebolla tratadas con T.
harzianum.
Velocidad de germinacin
Tratamiento
Germinacin (%)
(semillas germinadas/da)
Blanca control
85
11.53 1.34 a
Blanca tratada
92
17.73 0.82c
Morada control
93
18.40 0.39c
Morada tratada
82
17.98 1.12c
Roja control
88
14.68 0.27b
Roja tratada
76
12.98 0.57 a
Los resultados son el promedio desviacin estndar, n = 5. Se aplic un anlisis de

varianza de una sola va, letras diferentes indican diferencia estadstica significativa
(p<0.05, prueba de Tukey).
33
Figura 2. Germinacin de semillas de la variedad blanca (a), morada (b) y roja (c) tratadas
con T. harzianum. Los resultados son el promedio desviacin estndar, n=5. Se aplic
una prueba de t. Letras diferentes indican diferencia estadstica significativa (p<0.05).
34
6.2 Desarrollo de la planta en presencia de T. harzianum

Las plantas de 8 semanas inoculadas con T. harzianum, mostraron un aumento en su
desarrollo al compararlas con sus controles (Figura 3). En las tres variedades, con el
tratamiento con T. harzianum, el peso total aumento hasta tres veces ms que su control. La
variedad roja y la blanca tratadas con T. harzianum fueron las que presentaron el mayor
peso total (Cuadro 3).
El peso de los bulbos tratados con T. harzianum fue de 2 a 3 veces mayor que el peso de los
bulbos sin tratamiento. Los bulbos de la variedad blanca tratada fueron los que presentaron
el mayor desarrollo. El peso de las hojas de las tres variedades tratadas con T. harzianum
aument hasta 3.4 veces con respecto a su control. Para el caso de las races, se encontr
que despus del tratamiento el peso se increment en un intervalo de 7.4 a 11 veces ms
con respecto a sus respectivos controles (Cuadro 3).
35
Figura 3. Aspecto de las plantas a las 8 semanas de tratamiento con T. harzianum (T) y su
control (C).
36
Cuadro 3. Peso total, de bulbos, hojas y raz de plantas de 8 semanas tratadas con
T. harzianum.
Variedad
Peso total (g)
Blanca control
2.92 1.01
(3)*
Blanca tratada
9.38 3.78
Morada control
1.97 0.72
ab
a
Morada tratada
5.96 2.51
Roja control
3.09 0.87
(3)*
Roja tratada
0.64 0.18
ab
(3)*
b
(3)*
Peso bulbo(g)
10.18 2.13
2.01 1.36
0.60 0.39
1.24 0.32
0.79 0.13
ab
1.47 0.40
ab
Peso raz(g)
0.10 0.05
(9)*
6.77 2.61
bc
0.88 0.40
1.28 0.35
0.07 0.07
(3)*
ab
(2)*
b
2.42 0.89
(3)*
(2)*
Peso hojas(g)
(7.4)*
3.68 1.16
ab
0.52 0.12
ab
2.22 0.78
0.08 0.01
(3.4)
c
7.72* 1.29
(11)
b
0.89* 0.51

varianza de una sola va, letras diferentes por columna indican diferencia estadstica
significativa (p<0.05, prueba de Tukey). * Nmero de veces que se aumento despus del
tratamiento.
6.3 Contenido de compuestos fenlicos en plntulas y bulbos

Antes del tratamiento con T. harzianum, las plntulas de la variedad roja fueron las que
presentaron el mayor contenido de compuestos fenlicos. Sin embargo, con el tratamiento
con T. harzianum, en las plntulas de las tres variedades se gener un aumento en el
contenido de compuestos fenlicos con respecto a los encontrados en sus controles. En el
37
caso de las plntulas de las variedades blanca y morada ste aumento fue del 43.5 y 48 %
respectivamente; mientras que para las plntulas de la variedad roja aumento en un 13 %
(Figura 4).Las diferencias estadsticas permiten afirmar que el tratamiento tuvo un efecto en
el contenido de los compuestos fenlicos.
Figura 4 .Contenido de compuestos fenlicos en plntulas de 8 das. Los resultados son el

promedio desviacin estndar, n = 5. Se aplic un anlisis de varianza de una sola va,
letras diferentes entre variedades indican diferencias estadsticas significativas (p<0.05,
prueba de Tukey). * mg EAG/g PS: mg equivalentes de cido glico/g de peso seco.
El contenido de compuestos fenlicos de los bulbos tratados con T. harzianum se
increment con respecto a su control. Los incrementos fueron del 20 % ms para la
variedad blanca tratada, 70 % para la variedad morada y 30 % para la variedad roja (Figura
38
5). Estos resultados indican diferencias de respuesta entre variedades a la inoculacin por
Trichoderma. La variedad morada es en la que muestra el mayor cambio en el contenido de
compuestos fenlicos, seguida de la variedad roja y la blanca.
Por otra parte, los bulbos de la variedad roja fueron los que presentaron el mayor contenido
de compuestos fenlicos, seguidos de los bulbos de la variedad morada y la blanca.
Figura 5. Contenido de compuestos fenlicos en bulbos de 8 semanas. Los resultados son

el promedio desviacin, n = 5. Se aplic un anlisis de varianza de una sola va, letras
diferentes entre variedades indican diferencias estadsticas significativas (p<0.05, prueba de
Tukey). * mg EAG/g PS: mg equivalentes de cido glico/g de peso seco.
39
6.4 Contenido de flavonoides totales en plntulas y bulbos

En las plntulas tratadas de las variedades, blanca, morada y roja, el contenido de
flavonoides totales se aumento en 43.5, 51.6 y 16 % respectivamente comparadas con sus
controles. Por otra parte, antes del tratamiento con T. harzianum, las plntulas de la
variedad roja fueron las que presentaron el mayor contenido de flavonoides totales, pero
despus del tratamiento con T. harzianum, las plntulas de las variedades roja y morada
fueron las que presentaron el mayor contenido de flavonoides totales (Figura 6).
Figura 6. Contenido de flavonoides totales en plntulas de 8 das. Los resultados son el

prueba de Tukey).
40
En los bulbos de las variedades morada y roja tratados y sin tratar con T. harzianum se
encontr que el contenido de flavonoides totales fue similar. Solamente en los bulbos de la
variedad blanca se encontraron diferencias entre las muestras control y las tratadas en el
contenido de flavonoides totales (Figura 7). Los resultados tambin muestran que la
variedad roja antes y despus del tratamiento es la que presenta el mayor contenido de
flavonoides, seguida de las variedades morada y blanca.
Figura 7. Contenido de flavonoides totales en bulbos de 8 semanas. Los resultados son el

prueba de Tukey).
41
6.5 Actividad de la enzima peroxidasa en bulbos de 8 semanas

En los bulbos de las plantas blanca y morada que fueron tratadas con T. harzianum, la
actividad de la enzima peroxidasa fue mayor que la encontrada en los controles (2.5 y 4.6
veces, respectivamente), por otro lado, aunque en la variedad roja se observ un incremento
entre las plantas tratada y las control, este no fue significativo (Figura 8). De las tres
variedades tratadas con T. harzianum, los bulbos de la variedad morada y la blanca fueron
los que presentaron la mayor actividad de la enzima.
Figura 8. Actividad de peroxidasa en bulbos de 8 semanas. Los resultados son el promedio

desviacin estndar, n = 5. Se aplic un anlisis de varianza de una sola va, letras
diferentes entre variedades indican diferencias estadsticas significativas (p<0.05, prueba de
Tukey).
42
6.6 Efecto de extractos acuosos de bulbos sobre el crecimiento micelial y el nmero de

esclerocios de Sclerotium rolfsii
En el cuadro 6 se muestra la evaluacin del efecto de los extractos acuosos de bulbos sobre
el crecimiento micelial de S. rolfsii. Con los extractos de bulbos provenientes de la variedad
blanca tratada con Trichoderma se observ un mayor crecimiento micelial que con el
extracto de bulbos sin tratar y con el medio de cultivo sin extracto. En el caso de los
extractos de bulbos de la variedad morada tratada se observ un crecimiento del micelio
similar al encontrado con el extracto de bulbos sin tratar, pero ambos fueron menores en
crecimiento al del medio de cultivo sin extracto. Por el contrario con extractos de bulbos de
plantas tratadas de la variedad roja se encontr un menor crecimiento micelial que con el
extracto de bulbos de plantas sin tratar y en el medio de cultivo sin extracto (Cuadro 4).
43
Cuadro 4. Crecimiento micelial de S. rolfsii en presencia de extractos acuosos de bulbos.
Extracto de bulbo
rea de crecimiento micelial (mm2)
Sin extracto
33.30 3.23de
Blanca control
28.10 2.59cd
Blanca tratada
34.99 2.52e
Morada control
26.51 1.40abc
Morada tratada
27.81 1.72bcd
Roja control
26.99 4.25abc
Roja tratada
21.31 0.30a

La evaluacin del nmero de esclerocios mostr que con los diferentes extractos no se
afect la produccin de esclerocios (Cuadro 5).
44
Cuadro 5. Efecto de extractos acuosos de bulbos en el nmero de esclerocios.
Tratamiento
Nmero de esclerocios
Sin extracto
302.50 20.50a
Blanca control
294.75 120.52a
Blanca tratada
262.50 102.52a
Morada control
236.75 27.62a
Morada tratada
235.25 108.15a
Roja control
340.25 91.96a
Roja tratada
254.00 50.89a

varianza de una sola va, las letras iguales indican que no hubo diferencia estadstica
significativa (p<0.05, prueba de Tukey).
6.7 Efecto de la inoculacin con Sclerotium rolfsii en bulbos de plantas de cebolla de 8

semanas
En los bulbos inoculados con T. harzianum se observ que el ndice de severidad fue de 1.9
a 2.1; mientras que en los bulbos no inoculados fue entre 2.5 y 2.9, lo que indica que la
severidad de la enfermedad fue menor en los bulbos tratados con T. harzianum (Cuadros 6).
Al comparar entre variedades, se destaca que las variedades pigmentadas tratadas con T.
45
harzianum tuvieron una disminucin en sus valores
de severidad ms evidentes con
respecto a sus controles (entre 0.8 y 0.9).

Cuadro 6. Efecto de S. rolfsii en el ndice de severidad y nmero de esclerocios presentes
en bulbos tratados con T. harzianum.
Tratamiento
ndice de
severidad
Nmero de esclerocios por

planta
Blanca control
2.5
9.067 4.284c
Blanca tratada
2.1
2.933 1.580a
Morada control
2.7
5.133 4.373ab
Morada tratada
1.9
2.267 1.944a
Roja control
2.9
7.267 4.301b
Roja tratada
2.0
4.133 2.748ab

Sin embargo, la evaluacin del nmero promedio de esclerocios por planta mostr que
solamente para la variedad blanca hay diferencias entre los bulbos tratados y los controles.
Al comparar entre variedades sin tratamiento se observ que la variedad blanca tuvo el
mayor nmero de esclerocios (Cuadro 6).
46
7. DISCUSIN
El tratamiento con T. harzianum tuvo un efecto diferencial en la germinacin de las
semillas que dependi de la variedad de cebolla. En la variedad blanca, T. harzianum
estimul la germinacin; mientras que, en las variedades morada y roja, el tratamiento
inhibi la germinacin (Figuras 2). En particular, los resultados encontrados con la variedad
blanca concuerdan con los estudios realizados por Kleifeld y Chet (1992) quienes
encontraron que las semillas de chile tratadas con T. harzianum mostraron un aument en la
emergencia de plntulas. Estos autores tambin indican que ste efecto probablemente es
causado por la interaccin benfica que existe entre el hongo Trichoderma y la rizosfera de
las plntulas.
A las 8 semanas, las plantas de las tres variedades de cebolla tratadas con T. harzianum
mostraron una ganancia de biomasa, tanto de las hojas, como de los bulbos y las races
(Figura 3 y Cuadro 3). Este aumento en el desarrollo causado por Trichoderma puede ser
debido a varias causas. Harman et al., (2004b) sugieren que la presencia de Trichoderma en
el medio de cultivo donde se desarrolla la planta, induce las hormonas de crecimiento y
cambios en el metabolismo vegetal. Gravel et al. (2007) reportaron que la produccin del
cido indolactico en la raz de tomate se increment con la presencia de T. atroviride,
dando como consecuencia una mayor ganancia de biomasa.
Por otra parte, se conoce que tanto el fosforo como el nitrgeno son nutrimentos esenciales
para el desarrollo y la fisiologa de las plantas. El tratamiento con Trichoderma podra
ayudar a solubilizar, absorber y translocar varios nutrientes que se encuentran en el suelo,
47
tales como fosforo y nitrgeno y de esta forma ponerlos a una mayor disposicin de la
planta. La disponibilidad de fosforo en la raz se asocia con una promocin del crecimiento
vegetal (Yedidia et al., 2001).
Trichoderma tambin como parte de la rizsfera puede colonizar y proteger las races de las
plantas y de esta forma inducir un incremento en el peso de las plantas (Lorito, 1998).
Los resultados de ste trabajo mostraron diferencias entre variedades en el contenido de
compuestos fenlicos y flavonoides. Antes del tratamiento con Trichoderma, tanto
plntulas como bulbos de la variedad roja fueron los que presentaron el mayor contenido de
compuestos fenlicos y de flavonoides totales, seguida de las variedades morada y blanca.
El tratamiento con T. harzianum, como una respuesta bioqumica, caus principalmente un
aumento en el contenido de compuestos fenlicos y algunos cambios en el contenido de
flavonoides; los cuales, dependieron tanto de la variedad de cebolla como de la etapa de
desarrollo de las plantas. En plntulas, los mayores cambios en los contenidos tanto de
compuestos fenlicos como de flavonoides se presentaron en las variedades blanca y
morada, seguidas de la variedad roja. Mientras que, solamente en los bulbos de las
variedades morada y roja, el tratamiento con T. harzianum caus un aument en el
contenido de compuestos fenlicos y los bulbos de la variedad blanca fueron los nicos en
los que se indujo un aumento en el contenido de flavonoides (Figura 5 y 7)
Diferencias en flavonoides y compuestos fenlicos tambin se encontraron en diferentes
cultivares de cebollas y se seala que el tipo de compuestos que se encuentran en cada
cultivar depende del origen de la semilla. Asimismo, la actividad agronmica y cambios en
48
el ambiente tambin podran afectar la informacin gentica de las semillas produciendo

cambios en el contenido de sus compuestos fenlicos y flavonoides (Rodrguez et al, 2008).
Por otra parte, las capas externas de los bulbos de cebollas pigmentadas (roja y morada)
contienen un mayor contenido de compuestos fenlicos que los de variedades no
pigmentadas (verde y blanca) y este contenido de compuestos fenlicos se correlaciona con
la actividad antioxidante (Prakash et al., 2007). Por lo cual, sera interesante conocer si el
aumento de compuestos fenlicos y flavonoides totales observado en los bulbos tratados
con T. harzianum, se relaciona con una mejor calidad nutricional y de actividad biolgica,
tal es el caso de la actividad antioxidante.
En otro contexto, diversos estudios sealan que uno de los efectos de la aplicacin de
Trichoderma es la induccin de metabolitos secundarios, que pudieran participar en la
respuesta de defensa de las plantas. La aplicacin de T. asperellum en pepino induce la
respuesta sistmica contra Pseudomonas syringae pv. lachrymans representada por la
induccin de fitoalexinas, de naturaleza fenlica y que inhiben el crecimiento de la bacteria
en ensayos in vitro (Yedidia et al., 2003). En particular, previamente se reporta que en
cebolla, T. harzianum induce la sntesis de compuestos antifngicos que absorben en luz
UV (no identificados) que tienen actividad contra el hongo Fusarium oxysporum
(Cokuntuna y Ozer, 2008; Ozer et al., 2004). As mismo, se report que las variedades de
cebolla entre otros aspectos, difieren en su color, pero tambin en su contenido de
compuestos fenlicos que pudieran estar relacionados con la resistencia ante el ataque de
ciertos patgenos (Walker, 1929). Las variedades de cebollas pigmentadas presentaron un
49
mayor contenido de cido protocatequico y de catecol y fueron ms resistentes a la

infeccin por Colletotrichum circinans que las cebollas no pigmentadas (Link, 1933).
El ensayo del crecimiento del micelio de S. rolfsii en presencia de los extractos acuosos
mostr que solamente el extracto proveniente de bulbos de la variedad roja tratados con T.
harzianum redujo el crecimiento del micelio (Cuadro 4). Asimismo, la evaluacin del
nmero de esclerocios no mostr diferencias significativas entre los extractos provenientes
de bulbos de cebollas sin tratar o tratadas con T. harzianum (Cuadro 5). Por lo cual, stos
resultados no permiten concluir que haya una relacin principalmente del aumento de
contenido de compuestos fenlicos observado en los bulbos tratados con T. harzianum con
la actividad fungicida contra S. rolfsii. No obstante, cabe la posibilidad que los extractos
presenten actividad antimicrobiana para otros microorganismos; por lo que, tambin sera
importante evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos contra otros
microorganismos que afecten al cultivo de cebolla.
Despus de 15 das de inoculacin de los bulbos con tejido contaminado de S. rolfsii, se
observ que solamente en la variedad blanca hubo un menor nmero de esclerocios en los
bulbos tratados con T. harzianum que en los controles. Sin embargo, se observ que los
bulbos de las tres variedades tratadas con T. harzianum mostraron una menor severidad de
la enfermedad que sus controles (Cuadro 6). Lo cual sugiere que el tratamiento con T.
harzianum induce en las tres variedades de cebolla, los mecanismos bioqumicos de
resistencia. As mismo, se observ que la variedad blanca tuvo el mayor nmero de
esclerocios y que las variedades pigmentadas destacan por una disminucin en sus valores
de severidad ms evidentes con respecto a sus controles. Resultados que concuerdan con lo
50
reportado por Link (1933), donde las variedades de cebollas pigmentadas fueron ms
resistentes a la infeccin por Colletotrichum circinans que las cebollas no pigmentadas
Otro de los cambios bioqumicos importantes que se observaron en este trabajo por el
tratamiento con T. harzianum fue un aumento en la actividad de la enzima peroxidasa en
los bulbos de las plantas tratadas de las tres variedades (Figura 8).
La respuesta general de defensa de las plantas incluye la induccin de protenas de
respuesta a la patognesis (PR), la acumulacin de fitoalexinas, y la deposicin de
polmeros estructurales, como la calosa y lignina (Van Loon et al., 2006). La aplicacin de
Trichoderma en plantas induce los mecanismos de resistencia local y sistmica. Entre estos
mecanismos esta la induccin de hidrolasas en la planta, tales como exo y endoquitinasas y
-1,3-glucanasas, con potencial antimicrobiano (Harman et al, 2004a; Harman, 2006).
Diversos estudios sealan que la actividad de peroxidasa es una de las respuestas de
defensa en las plantas tratadas con microorganismos benficos tales como Trichoderma. La
actividad de celulasas y peroxidasas son inducidas por T. harzianum como parte de las
respuestas de defensa (Yedidia et al., 1999, Yedidia et al., 2000). El extracto de micelio de
Trichoderma viride usado como un elicitor induce la acumulacin de compuestos
fenlicos, la depositacin de lignina en la pared celular, de enzimas del metabolismo de
fenilpropanoides y de peroxidasas (Mandal y Mitra, 2007). La combinacin de T. viridae
con otro agente de biocontrol como Pseudomonas fluorescens y quitina llev a la induccin
de la actividad de peroxidasas, polifenoloxidasas, la fenilalanina amonio liasa, quitinasas,
-1,3-glucanasas, en combinacin con la acumulacin de compuestos fenlicos
(Ushamalini et al., 2008; Karthikeyan et al., 2006).
51
En particular, se seala que las peroxidasas son importantes en la resistencia a la

enfermedad quizs a travs de un mecanismo que implica la oxidacin de compuestos
fenlicos a quinonas, las cuales podran ser molculas ms txicas a microorganismos que
los fenoles originales (Yedidia et al., 1999; Mandal y Mitra, 2007). Otro mecanismo
bioqumico implica la participacin de las peroxidasas en catalizar reacciones que
conducen a la formacin de lignina, contribuyendo de esta forma al reforzamiento de la
pared celular (Mandal y Mitra, 2007). Por lo cual, se sugiere que ambos mecanismos
podran estar operando en el desarrollo de la resistencia de las tres variedades de cebolla a
la infeccin por S. rolfsii.
52
8. CONCLUSIONES
El tratamiento con T. harzianum tuv un efecto diferencial en la germinacin de las
semillas que dependi de la variedad.
En las tres variedades de cebolla, T. harzianum gener un aument en el desarrollo, pero
las variedades roja y blanca fueron las ms beneficiadas por el tratamiento.
T. harzianum caus cambios en el contenido de compuestos fenlicos y flavonoides que

dependi de la etapa de desarrollo y la variedad. En las plntulas de las tres variedades de
cebolla, se aument el contenido de compuestos fenlicos y flavonoides; mientras que,
solamente en los bulbos de las variedades morada y roja, T. harzianum caus un aument
en el contenido de compuestos fenlicos y los bulbos de la variedad blanca fueron los
nicos en los que se aument el contenido de flavonoides.
En bulbos de las variedades blanca y morada, T. harzianum aument la actividad de la

enzima peroxidasa y fueron en los que se present la mayor actividad de la enzima.
El crecimiento del micelio solamente disminuy en presencia de los extractos acuosos de

los bulbos de la variedad roja tratada y el nmero de esclerocios de S. rolfsii no se afect
con los extractos acuosos de bulbos de cebollas sin tratar o tratadas con T. harzianum.
Las tres variedades tratadas con T. harzianum mostraron una menor severidad de la
enfermedad por S. rolfsii, Las variedades pigmentadas tratadas con T. harzianum tuvieron
una disminucin en sus valores de severidad ms evidentes que la variedad blanca.
53
9. LITERATURA CITADA
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62

Inoculación de Tricho en Cebolla

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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BITICOS

CAMBIOS BIOQUMICOS INDUCIDOS EN CEBOLLA POR LA INOCULACIN CON

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

JAIME ALBERTO APARICIO BELLO

Yautepec, Morelos; Diciembre 2010

El presente trabajo se realiz en el laboratorio de cultivo de clulas vegetales del

2.1 Generalidades de la cebolla

2.2 Diferencias qumicas entre las variedades de cebolla

2.3 Enfermedades en cebolla causadas por hongos de suelo

2.4 Generalidades de Trichoderma

2.5 Efecto de Trichoderma en las plantas

2.6 Efecto de Trichoderma en otros hongos

2.7 Generalidades de Sclerotium rolfsii

2.8 Sclerotium rolfsii en las plantas

2.9 Mtodos de control de Sclerotium rolfsii

5.1 Variedades de cebolla

5.2 Cepas de hongos utilizadas

5.3 Tratamiento con T. harzianum de las semillas de cebolla y

5.6 Determinacin del contenido total de flavonoides

5.7 Evaluacin de la actividad de peroxidasa

5.8 Obtencin de extractos acuosos de bulbos de cebolla

5.9 Efecto de extractos acuosos de bulbos sobre el crecimiento

micelial y produccin de esclerocios de Sclerotium rolfsii.

severidad de Sclerotium rolfsii

6.3 Contenido de compuestos fenlicos en plntulas y bulbos

6.4 Contenido de flavonoides totales en plntulas y bulbos.

6.5 Actividad de la enzima peroxidasa en bulbos de 8 semanas.

6.6 Efecto de extractos acuosos de bulbos sobre el crecimiento

micelial y el nmero de esclerocios de Sclerotium rolfsii.

plantas de cebolla de 8 semanas

6. Efecto de S. rolfsii en el ndice de severidad y nmero de esclerocios

presentes en bulbos tratados con T. harzianum.

5. Contenido de compuestos fenlicos en bulbos de 8 semanas.

6. Contenido de flavonoides totales en plntulas de 8 das.

7. Contenido de flavonoides totales en bulbos de 8 semanas.

8. Actividad de peroxidasa en bulbos de 8 semanas.

Este trabajo tuvo como objetivo evaluar el crecimiento, el contenido de compuestos

El crecimiento del micelio solamente disminuy en presencia de los extractos acuosos de

se inducen en la cebolla por el tratamiento con T. harzianum Tc74 y tampoco se conoce si

2.1 Generalidades de la cebolla

Debido a la actividad antimicrobiana que la cebolla posee se recomienda su uso para el

Figura 1. Situacin nacional de la produccin de cebolla. (SAGARPA, 2009).

2.2 Diferencias qumicas entre las variedades de cebolla

2.3 Enfermedades en cebolla causadas por hongos de suelo

Curvularia, Phoma, Alternaria, Sclerotium, Bipolaris, Rhizopus y Penicillium. De todos

Campo y almacn (82%)

2.4 Generalidades de Trichoderma

color verde brillante con esporulacin densa, debido a los

conglomerados de conidios que se forman en las puntas de las hifas. El micelio es en su

2.5 Efecto de Trichoderma en las plantas

Trichoderma se puede localizar tanto fuera como dentro de la rizsfera; pero es en la

La solubilizacin de fosforo en la raz se asocia a menudo con la promocin del

2.6 Efecto de Trichoderma en otros hongos

las enzimas quitinoltica y glucanolticas de T. harzianum P1

interactuaron sinrgicamente en la inhibicin de la germinacin de las esporas y la

2.7 Generalidades de Sclerotium rolfsii

Es un patgeno esencialmente de suelo, que causa enfermedad en un amplio intervalo de

La germinacin se inhibe a pH mayor de 7.0 y el mximo

2.8 Sclerotium rolfsii en las plantas

2.9 Mtodos de control de Sclerotium rolfsii

5.1 Variedades de cebolla

5.2 Cepas de hongos utilizadas

5.3 Tratamiento con T. harzianum de las semillas de cebolla y evaluacin de la