Cromatografa lquida de alta ecacia

La cromatografa lquida de alta ecacia o high performance liquid chromatography (HPLC) es un tipo de
cromatografa en columna utilizada frecuentemente en
bioqumica y qumica analtica. Tambin se la denomina
a veces cromatografa lquida de alta presin o cromatografa lquida de alta resolucin (high pressure
liquid chromatography) (HPLC), aunque esta terminologa se considera antigua y est en desuso. El HPLC es
una tcnica utilizada para separar los componentes de
una mezcla basndose en diferentes tipos de interacciones qumicas entre las sustancias analizadas y la columna
cromatogrca.

vara en funcin de la hidrofobicidad del compuesto. El

gradiente separa los componentes de la muestra como una
funcin de la anidad del compuesto por la fase mvil utilizada respecto a la anidad por la fase estacionaria. En
el ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los
compuestos ms hidroflicos eluirn a mayor concentracin de agua, mientras que los compuestos ms hidrofbicos eluirn a concentraciones elevadas de acetonitrilo. A
menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas
con tal de optimizar el gradiente de forma que permita
una buena separacin de los compuestos.

1.2 Tipos de HPLC

1
1.1

Principio

1.3 Cromatografa de fase normal

Cromatografa lquida de alta resolu- La cromatografa de fase normal o normal phase HPLC
(NP-HPLC) fue el primer tipo de sistema HPLC utilizacin (HPLC)

do en el campo de la qumica, y se caracteriza por separar

los compuestos en base a su polaridad. Esta tcnica utiliza una fase estacionaria polar y una fase mvil apolar, y
se utiliza cuando el compuesto de inters es bastante polar. El compuesto polar se asocia y es retenido por la fase
estacionaria. La fuerza de adsorcin aumenta a medida
que aumenta la polaridad del compuesto y la interaccin
entre el compuesto polar y la fase estacionaria polar (en
comparacin a la fase mvil) aumenta el tiempo de retencin.

En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna

cromatogrca a travs de la fase estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas
con ciertas caractersticas qumicas en su supercie) mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta presin
a travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones
qumicas o fsicas con la fase estacionaria a medida que
adelantan por la columna. El grado de retencin de los
componentes de la muestra depende de la naturaleza del
compuesto, de la composicin de la fase estacionaria y
de la fase mvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser
eluido de la columna se denomina tiempo de retencin y
se considera una propiedad identicativa caracterstica de
un compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria. La utilizacin de presin en este tipo de cromatografas incrementa la velocidad lineal de los compuestos
dentro de la columna y reduce as su difusin dentro de
la columna mejorando la resolucin de la cromatografa.
Los disolventes ms utilizados son el agua, el metanol y
el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o
compuestos como el cido triuoroactico, que ayudan a
la separacin de los compuestos.

La fuerza de interaccin no slo depende de los grupos

funcionales del compuesto de inters, sino tambin en
factores estricos de forma que los ismeros estructurales
a menudo se pueden diferenciar el uno del otro. La utilizacin de disolventes ms polares en la fase mvil disminuye el tiempo de retencin de los compuestos mientras
que los disolventes ms hidrofbicos tienden a aumentar
el tiempo de retencin.
La NP-HPLC cay en desuso a los aos setenta con el
desarrollo del HPLC de fase reversa o reversed-phase
HPLC debido a la falta de reproductibilidad de los tiempos de retencin puesto que los disolventes prticos cambiaban el estado de hidratacin de la silica o almina de
la cromatografa.

Una mejora introducida a la tcnica de HPLC descrita es

la variacin en la composicin de la fase mvil durante
el anlisis, conocida como elucin en gradiente. Un gradiente normal en una cromatografa de fase reversa puede
empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado

1.4 Cromatografa de fase reversa

La HPLC de fase reversa (RP-HPLC) consiste en una
fase estacionaria apolar y una fase mvil de polaridad
moderada. Una de las fases estacionarias ms comunes
1

1 PRINCIPIO

de este tipo de cromatografa es la silica tratada con

RMe2 SiCl, donde la R es una cadena alquil tal como
C18 H37 o C8 H17 . El tiempo de retencin es mayor para las molculas de naturaleza apolar, mientras que las
molculas de carcter polar eluyen ms rpidamente.

as, muchas columnas de fase reversa estn formadas por

silica modicada con cadenas alquil y no se deben utilizar nunca con bases en medio acuoso puesto que stas
podran daar el esqueleto de silica subyacente. Las columnas se pueden utilizar en cidos en medio acuoso peEl tiempo de retencin aumenta con la adicin de disol- ro no deberan estar expuestas demasiado tiempo al cido
vente polar a la fase mvil y disminuye con la introduc- porque puede corroer las partes metlicas del aparato de
cin de disolventes ms hidrofbicos. La cromatografa HPLC.
de fase reversa es tan utilizada que a menudo se lo denomina HPLC sin ninguna especicacin adicional. La
1.5 Cromatografa de exclusin molecular
cromatografa de fase reversa se basa en el principio de
las interacciones hidrofbicas que resultan de las fuerzas
La cromatografa de exclusin molecular, tambin conode repulsin entre un disolvente relativamente polar, un
cida como cromatografa por ltracin en gel, separa las
compuesto relativamente apolar, y una fase estacionaria
partculas de la muestra en funcin de su tamao. Geneapolar. La fuerza conductora en la unin del compuesto a
ralmente se trata de una cromatografa de baja resolucin
la fase estacionaria es la disminucin del rea del segmende forma que se suele utilizar en los pasos nales del proto apolar del analito expuesto al disolvente. Este efecto
ceso de puricacin. Tambin es muy til para la deterhidrofbico est dominado por el aumento de la entropa,
minacin de la estructura terciaria y la estructura cuatery la consecuente disminucin de la energa libre, asociada
naria de las protenas puricadas.
con la minimizacin de la interfase compuesto-disolvente
polar. El efecto hidrofbico disminuye con la adicin de La cromatografa de ltracin molecular es un mtodo
disolvente apolar a la fase mvil. Esto modica el coe- de cromatografa en columna por el cual las molculas
ciente de particin de forma que el compuesto se mueve se separan en solucin segn su peso molecular, o ms
precisamente, segn su radio de Stokes.
por la columna y eluye.
Las caractersticas del compuesto de inters juegan un
papel muy importante en la retencin. En general, un
compuesto con una cadena alquil larga se asocia con un
tiempo de retencin mayor porque aumenta la hidrofobicidad de la molcula. Aun as, las molculas muy grandes
pueden ver reducida la interaccin entre la supercie del
compuesto y la fase estacionaria. El tiempo de retencin
aumenta con el rea de supercie hidrofbica que suele
ser inversamente proporcional al tamao del compuesto.
Los compuestos ramicados suelen eluir ms rpidamente que sus ismeros lineales puesto que la supercie total
se ve reducida.
Aparte de la hidrofobicidad de la fase inmvil, otras modicaciones de la fase mvil pueden afectar la retencin
del compuesto; por ejemplo, la adicin de sales inorgnicas provoca un aumento lineal en la tensin supercial, y como que la entropa de la interfase compuestodisolvente est controlada precisamente por la tensin supercial, la adicin de sales tiende a aumentar el tiempo
de retencin.
Otra variable importante es el pH puesto que puede cambiar la hidrofobicidad del compuesto. Por este motivo, la
mayora de mtodos utilizan un tampn como el fosfato
de sodio para controlar el valor del pH. Estos tampones
controlan el pH, pero tambin neutralizan la carga o cualquiera resto de silica de la fase estacionaria que haya quedado expuesta y actan como contraiones que neutralizan
la carga del compuesto. El efecto de los tampones sobre
la cromatografa puede variar, pero en general mejoran
la separacin cromatogrca.
Las columnas de fase reversa se echan a perder con menor facilidad que las columnas de silica normales. Aun

En esta cromatografa, la fase estacionaria consiste en largos polmeros entrecruzados que forman una red tridimensional porosa. A los nes prcticos, la columnas se
empaquetan con pequeas partculas esferoidales formadas por esos polmeros entrecruzados. En consecuencia,
estas partculas son porosas, y el tamao de los poros es
tal que algunas molculas (las demasiado grandes) no podrn ingresar a esos poros, en tanto que otras (las sucientemente pequeas) podrn pasar libremente. Los poros quedan conectados formando una malla o red, lo cual
determina una serie de caminos a ser recorridos por las
molculas que acceden al interior de esta.

1.6 Cromatografa de intercambio inico

En la cromatografa de intercambio inico, la retencin
se basa en la atraccin electrosttica entre los iones en
solucin y las cargas inmovilizadas a la fase estacionaria. Los iones de la misma carga son excluidos mientras
que los de carga opuesta son retenidos por la columna.
Algunos tipos de intercambiadores inicos son: i) Resinas de poliestireno, ii) intercambiadores inicos de celulosa y dextranos (geles) y iii) Silica porosa o vidrio de
tamao de poro controlado. En general los intercambiadores inicos favorecen la unin de iones elevada carga
y radio pequeo. Un incremento en la concentracin del
contrain (respecto a los grupos funcionales de la resina)
reduce el tiempo de retencin. Un incremento en el pH
reduce el tiempo de retencin en las cromatografas de
intercambio catinico mientras que una disminucin del
pH reduce el tiempo de retencin en las cromatografas
de intercambio aninico. Este tipo de cromatografa es
ampliamente utilizado en las siguientes aplicaciones: pu-

3
ricacin de agua, concentracin de componentes traza,
Ligand-exchange chromatography, Ion-exchange chromatography of proteins, High-pH anion-exchange chromatography of carbohydrates and oligosaccharides, etc.

1.7

Cromatografa basada en bioanidad

Este tipo de cromatografa se basa en la capacidad de

las sustancias biolgicamente activas de formar complejos estables, especcos y reversibles. La formacin
de estos complejos implica la participacin de fuerzas
moleculares como las interacciones de Van der Waals,
interacciones electrostticas, interacciones dipolo-dipolo,
interacciones hidrofbicas y puentes de hidrgeno entre
las partculas de la muestra y la fase estacionaria.

1.8

dplex antes en el grco resultante, el cromatograma. De

esta manera, como los heterodplex se desnaturalizan a
temperaturas distintas a los homodplex, ambas molculas dan lugar a picos de elucin distintos.
Previo al proceso inicial de desnaturalizacin se suele llevar a cabo una PCR para la amplicacin del ADN molde
en fragmentos de unas 150-450 pb.
Con este sistema pueden detectarse fcilmente sustituciones de una base, inserciones o deleciones, con un coste reducido y de manera rpida (aproximadamente 16
minutos).[1]

2 Parmetros

2.1 Dimetro interno

Cromatografa lquida de alta ecacia en condiciones desnaturalizantes El dimetro interno de una columna de HPLC es un aspecto crtico que determina la cantidad de muestra que
(DHPLC)

Se trata de un mtodo que se emplea para el rastreo de

mutaciones (ya casi totalmente en desuso debido al auge
de la secuenciacin), que permite detectar la presencia de
variaciones en el ADN aunque no se determinan especcamente cules. En este caso, se utiliza la tcnica cromatogrca para la deteccin de heterodplex de ADN,
en lugar de utilizar un gel para correr las molculas de
cidos nucleicos.
El procedimiento consiste en desnaturalizar (aumentando
la temperatura normalmente) una muestra que contenga
tanto el ADN problema como un ADN control, que no
es ms que el mismo ADN problema pero en su versin
silvestre o normal (sin mutaciones). Luego se procede a
renaturalizar (disminuyendo la temperatura), de manera que aquellas cadenas de ADN que vuelvan a unirse
con sus respectivas complementarias (cadena a silvestre con cadena b silvestre; o bien cadena a mutante
con cadena b mutante) no presentarn diferencia con el
estado original; sin embargo, si por ejemplo una cadena
a silvestre hbrida con una cadena b mutante, aquella regin (ms o menos amplia) en la que exista mutacin no complementar, formndose un bucle u horquilla,
es decir, una regin en la que las bases nitrogenadas no
son complementarias y no establecen las uniones caractersticas por puentes de hidrgeno en la doble hlice de
ADN. Dichas estructuras son los denominados heterodplex (dplex de ADN hbridos). Estos heterodplex migran de forma diferente a los homodplex en la columna
de cromatografa de fase reversa(al igual que lo hacen en
un gel de agarosa o acrilamida). La separacin se realiza
en condiciones desnaturalizantes variables, detectndose
las molculas de ADN midiendo la absorbancia a 260 nm.
Esto origina un pico de elucin a un tiempo caracterstico.
A medida que se incrementan las condiciones desnaturalizantes los heterodplex migran por delante de los homodplex, apareciendo los picos correspondientes a hetero-

se puede cargar a la columna y tambin inuye en su sensibilidad. Las columnas de dimetro interno ms grande
(>10mm) se utilizan normalmente en la puricacin de
compuestos para su utilizacin posterior. En cambio, las
columnas de dimetro interno menor (4-5 mm) se utilizan
en el anlisis cuantitativo de las muestras, y se caracterizan por el aumento la sensibilidad y la minimizacin del
consumo de disolventes que conllevan. Estas columnas
se suelen denominar columnas de rango analtico y normalmente estn asociadas a un detector UV-VIS. Aparte,
existen otros tipos de columnas, como las de tipo capilar,
con un dimetro inferior a 0.3 mm, utilizadas principalmente en espectrometra de masas.

2.2 Medida de las partculas

La mayora de HPLC tradicionales se realizan con una
fase estacionaria unida al exterior de partculas esfricas
de silica. Estas partculas pueden tener diferentes medidas, siendo las de 5\mum de dimetro las ms utilizadas.
Partculas ms pequeas ofrecen una mayor supercie y
una mejor separacin, pero la presin que se requiere por
obtener una velocidad lineal ptima aumenta de forma inversamente proporcional al cubo del dimetro de la partcula. Esto signica que disminuir la medida de las partculas a la mitad, aumentara la resolucin de la columna,
pero a la vez, aumentara la presin necesaria en un factor
de ocho.

2.3 Tamao de poro

Muchas fases estacionarias son porosas para proporcionar una mayor supercie. Los poros pequeos proporcionan una mayor supercie mientras que los poros de mayor
medida proporcionan una cintica mejor, especialmente
para los compuestos de tamao ms grande; por ejemplo,

una protena que sea ligeramente ms pequea que el tamao de los poros puede entrar, pero difcilmente saldr
con facilidad.

REFERENCIAS

4 Fabricantes de columnas de
HPLC y accesorios
Merck/ EMD

2.4

Presin del sistema

KONIK GROUP

La presin de las bombas es variable segn el modelo y

fabricante, pero su rendimiento se mide en su habilidad
para generar un ujo constante y reproducible. La presin
puede lograr valores de hasta 40 MPa (o unas 400 atmsferas). Los aparatos ms modernos de HPLC incorporan
mejoras para poder trabajar a presiones ms altas y, por
lo tanto, poder utilizar partculas de tamao ms pequeo en las columnas (< 2 micrmetros). Estos nuevos aparatos, denominados ultra performance liquid chromatography (UPLC) pueden trabajar con valores de hasta 100
MPa de presin (unas 1000 atmsferas). (Hay que tener
en cuenta que las siglas UPLC son una marca registrada de Waters Corporation aunque a veces se utilizan de
forma general para designar este tipo de aparatos).

Macherey Nagel GMBH & CO. KG %

Agilent Technologies *Beckman Coulter, Inc. %
Dionex Corporation %
Gilson, Inc. %
Hitachi %
Isolation Technologies %
Micro-Tech Scientic %
Phenomenex %
Proxeon Biosystems A S/ %
Shimadzu Scientic Instrumentos

Fabricantes
HPLC

de

aparatos

de

Sielc
Supelco

HITACHI

TEKNOKROMA %

KONIK GROUP

Thermo Electron Corporation %

Agilent Technologies % (antiguamente HewlettPackard)

Tosoh Corporation %
Waters Corporation %

Beckman Coulter, Inc. %

Sugelabor S.A. %

Dionex Corporation %

Kromasil %

Eksigent Technologies %
Gilson, Inc. %
Micro-Tech Scientic %
PerkinElmer, Inc. %
Proxeon Biosystems A S/ %
Shimadzu Scientic Instrumentos %
Thermo Electron Corporation %
Waters Corporation %
Knauer%

5 Vase tambin
Cromatografa
Cromatografa de intercambio inico
Cromatografa de exclusin molecular
Cromatografa lquida: Teora y aplicaciones. I. Katime, O. Katime, D. Katime. Editorial Universidad
de Guadalajara, Mxico 1998
Csaba Horvth, inventor de la HPLC

6 Referencias

JASCO%
YOUNG LIN%
Varian

[1] Castro, R.M.R.P.S.; Martins, R.V., et all. (2004) High

capacity and low cost detection of prion protein gene variant alleles by denaturing HPLC. Jorunal of Neuroscience Methods, 139:263-269

Enlaces externos
Silica hielos for liquid chromatography
HPLC Find
LC Resources ChromFAQ
Chromatography Forum
marketoverview//search.php?language=e&market=lc&showtree=yes
Overview ofo HPLC Suppliers
Novasep
HPLC Resources
HPLC Primero

8 TEXTO E IMGENES DE ORIGEN, COLABORADORES Y LICENCIAS

Texto e imgenes de origen, colaboradores y licencias

8.1

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Cromatografa lquida de alta ecacia Fuente: https://es.wikipedia.org/wiki/Cromatograf%C3%ADa_l%C3%ADquida_de_alta_

eficacia?oldid=76947325 Colaboradores: Kernel panic, Boticario, RobotQuistnix, Yrbot, BOT-Superzerocool, GermanX, Pacomeco, Boja, CEM-bot, F.A.A, Thijs!bot, Xoacas, Mpeinadopa, JAnDbot, TXiKiBoT, Centricon, VolkovBot, Technopat, Matdrodes, BlackBeast,
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Soaa molina y Annimos: 55

8.2

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8.3

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