PRACTICA 2.

MUESTREO Y PREPARACION DE MUESTRAS PARA SU ANALISIS

INTEGRANTES:
AGUSTIN CARDONA NARANJO COD: 800812027
FREDY ANDRES GARCIA COD: 800622742
ANDRES FELIPE URREA COD:

DOCENTE:
M.SC. MARIA MARCELA MARTINEZ MIRANDA

UNIVERSIDAD DE CALDAS
FACULTAD DE INGENIERIA
INGENIERIA DE ALIMENTOS
LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS

FOTOGRAFIAS

(recibimiento de la muestra de laboratorio que

para nuestro caso fue de lechuga).

(Etiquetado de la muestra con toda la informacion

como fecha y caracteristica de la muestra).

( Se prepara el lugar en donde se van a pesar los

10g, teniendo en cuenta que debe estar cerca del mechero para que no halla
contaminacion por esporas de otros microorganismos).

( Como la lechuga es una muestra solida por lo

que se debe licuar en agua peptonada).

( Se filtra para evitar los solidos que estan

suspendidos y tener una muestra mas homogenea).

( Se pasa 1ml aun tubo de ensayo y se pasa

sucesivamente hasta la dilucion 10-3 como se describira a continuacion).
Nota: se debe utilizar guantes, tapabocas, vata y gorro en todo momento para
evitar que contaminemos la muestra)
INTRODUCCION
Un aspecto importante de la microbiologa es que usualmente las bacterias se
encuentran distribuidas de manera heterognea dentro de los productos
alimenticios. A su vez, las bacterias no estn homogneamente distribuidas en
un lote completo de alimentos. Por lo tanto, el anlisis de un mayor nmero de
muestras dar una mejor aproximacin de la calidad microbiolgica de los
productos alimenticios. En el siguiente laboratorio se analizara el procedimiento
y precauciones de dichos muestreos.
MATERIALES Y METODOS
Llegadas las muestras al laboratorio, es necesario seguir unos pasos que
dependen de la clase de alimento, procedencia y fines de anlisis. La
operacin de preparacin de muestras para el anlisis microbiolgico exige
unas reglas de manipulacin asptica muy estrictas, as como la utilizacin de
material y diluyentes estriles, para evitar la contaminacin exterior del
alimento.
Una vez preparada la muestra para nuestro caso en particular era lechuga de
la cual se pesaban 10 g obtenidos de la forma ms asptica de una lechuga de
200g y tomando muestras de toda su superficie, se procede a hacer un
recuento de microorganismos viables para determinar el nmero de grmenes
por gramo o por mililitro del alimento en estudio, partiendo de la serie de
diluciones decimales mediante el empleo de tcnicas de recuento en placa por
siembra en masa o en superficie. Pero antes de eso como es una muestra

solida se licua en agua peptonada ( por ser una muestra solida y se agrega
1ml a un tubo de ensayo con 9ml de agua peptonada, despus se sacan otro
ml y se agrega, as sucesivamente hasta la dilucin 10-3)
CUESTIONARIO
1. Investigue los mtodos para calcular el tamao de la muestra en industrias
de alimentos y describa cada uno de ellos.
RTA// METODOS GENERALES DE ANALISIS MICROBIOLOGICO
DE LOS ALIMENTOS
Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los alimentos.
Generalidades sobre la toma de muestras y el anlisis microbiolgico de los
productos finales: Principios ecolgicos, Fundamentos de los procedimientos
analticos (heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los
alimentos, transporte de muestras, confianza en los procedimientos, dao o
lesin , evaluacin sistemtica de los medios de cultivo): Necesidad de valores
de referencia. Muestreo: muestra nica, toma de muestras representativas.
Utilizacin de microorganismos como marcadores (ndices e indicadores).
1. Principios de garanta de la calidad microbiolgica de los alimentos.
El anlisis microbiolgico de alimentos no tiene carcter preventivo sino que
simplemente es una inspeccin que permite valorar la carga microbiana. Por
tanto, no se puede lograr un aumento de la calidad microbiolgica mediante el
anlisis microbiolgico sino que lo que hay que hacer es determinar en la
Industria cules son los puntos de riesgo de contaminacin o multiplicacin
microbiana (los llamados Puntos Crticos del proceso) y evitarlos siguiendo un
cdigo estricto de Buenas Prcticas de Elaboracin y distribucin del alimento
(BPE).
La prevencin, por tanto, est en evitar manufacturar productos de baja calidad
microbiolgica y no en comprobar la calidad microbiolgica de los ya
elaborados (lo que, por otra parte, presenta una relacin coste - beneficio muy
baja por la gran cantidad de muestras que es necesario analizar).
En el desarrollo de las BPE hay que hacer un anlisis del riesgo consistente en
determinar el peligro para la salud humana de un factor patgeno presente en
un alimento y el medio como puede reducirse ese riesgo hasta valores
infinitesimales por medios tecnolgicos. Este riesgo depende de de la DMI
(Dosis Mnima Infectiva) del microorganismo y de los valores del mismo que se
encuentren en el alimento; as mismo hay que valorar la carga inicial de
microorganismos en cada una de las raciones del alimento, y el nmero de
raciones o partes consumidas por la poblacin en un determinado tiempo.
La letalidad del tratamiento a aplicar viene dada por la frmula = log10(N0/Nc)
donde Nc son los valores aceptables del microorganismo a controlar y N 0 la
carga microbiana inicial para dicho microorganismo.

Aplicando estas BPE las oscilaciones en la calidad microbiolgica del producto

disminuyen y el anlisis microbiolgico es ms consistente puesto que permite
detectar alejamientos de las BPE.
2. Generalidades sobre la toma de muestras y el anlisis microbiolgico de los
productos finales.
A.- Principios ecolgicos: Es necesario considerar la distribucin desigual de
los microorganismos en los alimentos, lo que hace necesario seguir un
esquema de toma de muestras para obtener resultados representativos.
El nmero de criterios utilizados a la hora de juzgar la calidad microbiolgica de
los alimentos debe limitarse al mnimo necesario para as poder aumentar el
nmero de anlisis.
Los criterios de anlisis aplicados han de ser especficos de cada alimento
porque son diferentes los microorganismos patgenos y alterantes de cada tipo
de alimento.
B.- Fundamentos de los procedimientos analticos:
B.1.- Heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos: El
factor ms importante en el anlisis es el muestreo, que incluye: (a) Evaluacin
de la muestra necesaria para evitar la distorsin producida por los
microorganismo que se encuentran en diferentes partes de las superficies, por
ejemplo de las canales o de las mquinas, sistemas de alimentos heterogneos
(ensaladas, platos congelados, etc.); (b) Determinacin del modo ptimo de
remocin del microorganismo de la muestra o lugar de muestreo y (c) La
evitacin de la contaminacin ambiental durante la toma o transporte de
muestras.
B.2.- Transporte de muestras: Es importante evitar que durante el transporte de
las muestras se produzca: (a) Multiplicacin de los microorganismos presentes
y (b) Inactivacin de algn microorganismo.
En general es conveniente hacer el transporte a temperaturas del entorne de 0
C por un tiempo no superior a las 24 horas, excepto en el caso de grmenes
termotrofos.
B.3.- Confianza en los procedimientos: Normalmente es necesario detectar
bacterias que suponen entre 10-4 y 10-7 de la flora normal del alimento, flora
sta inocua. Es necesario utilizar medios selectivos para detectar estos
microorganismos presentes en proporciones tan bajas.
Como norma general conviene probar experimentalmente los medios usados
para determinar su selectividad y su productividad; as como no debe usarse un
medio diseado para un producto en otro producto diferente porque las
condiciones ecolgicas pueden ser diferentes dando lugar a una distorsin de
los resultados.

B.4.- Dao o lesin subletal: Tratamientos tecnolgicos pueden producir daos

subletales en los microorganismos que no pueden, en esas condiciones, ser
sometidos rigurosamente a medios selectivos. Son necesarios medios de
recuperacin en los que hay que considerar: (a) El tipo de microorganismo a
recuperar (G+, G-, hongo...), (b) El carcter y la intensidad del dao infligido,
(c) El tipo de alimento en el que est el microorganismo y (d) El medio selectivo
final.
Una vez considerado esto puede decidirse el tratamiento a seguir. De una
forma general, hay dos tipos de tratamiento de recuperacin: recuperacin en
lquido (2 h. 25 en agua peptona) o en slido (>6 h. en agua LB o similar,
incubando luego 4 - 6 h. a 25 C) seguido del tratamiento selectivo (siembra en
medio selectivo o recubrimiento con agar blando selectivo).
B.5.- Evaluacin sistemtica de los medios de cultivo: Dada la variabilidad
debida a pequeos errores en la preparacin de los medios de cultivo, tanto los
generales como los selectivos, es necesario hacer controles peridicos que
permitan comprobar tanto que las bacterias buscadas crecen incluso a partir de
clulas aisladas (colonias aisladas) como que las bacterias de la flora general
son satisfactoriamente inhibidas (no crecen salvo cuando se siembra un gran
volumen)..
C. Necesidad de valores de referencia.
Es necesario comparar los resultados con valores microbiolgicos de
referencia. Estos valores de referencia no son formulaciones tericas de la
carga microbiana aceptable, sino los valores obtenidos cuando la produccin
del alimento se ha ajustado a las BPE (Buenas Prcticas de Elaboracin).
La Microbiologa de alimentos puede evaluar el riesgo asociado a estos valores
de referencia y cuantificar los valores asociados a un alimento concreto para
medir su alejamiento de la referencia (y por tanto de las BPE).
3. Muestreo.
El muestreo consiste en separa una serie de muestras representativas del lote
para someterlas al anlisis microbiolgico.
A. Muestreo nico
Cuando hay que hacer un muestreo de una partida nica de alimento hay que
considerar que los datos de mayor importancia los proporcionan las normas de
elaboracin y conservacin del alimento. Esto es especialmente importante en
partidas de alimentos importados, sobre todo los enlatados.
Ningn muestreo nico puede dar una garanta total de calidad microbiolgica
del alimento; si se analizan 30 muestras de una partida suficientemente grande
y no aparece ninguna en malas condiciones microbiolgicas, an hay una
probabilidad razonable de que el 10% del lote sea microbiolgicamente
defectuoso.

Como norma general, si se trata de un lote desconocido es conveniente

analizar un nmero de muestras equivalente al 1% si el lote es grande y al 10%
si es pequeo. Aunque estos valores hay que adecuarlos a las condiciones
reales.
Cuando se analiza una muestra nica el mejor criterio de seguimiento son las
especificaciones del fabricante. Las muestras nicas estn siempre sometidas
a una gran probabilidad de falsos negativos.
B. Anlisis repetido.
Se pueden definir dos tipos de riesgo microbiolgico: (a) el riesgo del
consumidor: probabilidad de aceptacin de lotes substndard y (b) el riesgo del
fabricante: probabilidad de rechazo de lotes substndard.
Un sistema de muestras basado en el anlisis de 10 muestras al azar y
rechazo del lote cuando se detecte una defectuosa obligar al fabricante a
establecer medidas de seguridad suficientes para proteger adecuadamente al
consumidor.
C Planes de muestreo de tres categoras.
Se aceptan con condiciones algunos alimentos que sobrepasen la norma
microbiolgica establecida conforme a los valores microbiolgicos de
referencia. Clase: aceptable, grado intermedio, inaceptable. [En aquellos casos
en que el obtener valores ms altos que los de referencia no hace inaceptable
el alimento].
D. Toma de muestras representativas.
Una vez decidido el nmero de muestras que hay que tomar, han de
seleccionarse stas de forma estadsticamente representativa utilizando tablas
de nmero al azar. Dentro de cada unidad hay que tomar muestras
representativas de todos los constituyentes del alimento, para ello se debe
homogenizar la muestra usando batidoras o stomacher.
4. Utilizacin de los microorganismos como marcadores (ndices e indicadores).
A. Introduccin histrica, terminologa y bases de su utilizacin.
Histricamente, desde hace un siglo se estudia la deteccin de, primero, E. coli
y posteriormente, el grupo coli-aerogenes (enterobacteriaceas) como ndice de
contaminacin final en lugar de investigar la presencia de Salmonella typhi.
B. Terminologa
Microorganismo ndice: aqul cuya presencia aletar de la posible presencia de
un microorganismo patgeno relacionado ecolgicamente con l. (Ej.: E. col
ndice de S. typhi).

Microorganismo indicador: aquel cuyo numero indica un tratamiento

inadecuado o una contaminacin posterior del alimento analizado.
Un microorganismo dado puede actuar como ndice e indicador
simultneamente, incluso en un mismo alimento. A pesar de que actualmente
es posible detectar casi cualquier tipo de microorganismo patgeno, se siguen
llevando a cabo anlisis de microorganismo determinados como marcadores
por razones de economa, rapidez y sensibilidad.
Los principales marcadores son: grupo coli-aerogenes, E. coli, y estreptococos
del grupo D de Lancefield.
2. Describa los planes de muestreo de atributos o de variables usados para la
extraccin de las muestras de alimentos. Indique cmo escogera un plan de
muestreo determinado.
RTA// Planes de muestreo por atributos: Un plan de muestreo para la

inspeccin por atributos es un mtodo para evaluar la calidad de un lote

consistente en clasificar cada porcin de muestreo como una caracterstica o
atributo conforme o no conforme, segn se cumpla o no una especificacin.
Esa caracterstica puede ser cualitativa (por ejemplo, la presencia de una maca
en la fruta) o cuantitativa (por ejemplo, el contenido de sodio de un alimento
diettico, clasificado como conforme o no conforme de acuerdo con un lmite
establecido). Se cuenta luego el nmero de porciones de muestreo que
presentan el atributo de no conforme y, si no se sobre pasa el nmero de
aceptacin c establecido por el plan, se acepta el lote ;en caso contrario, se
rechaza.
Un plan de muestreo por variables es un mtodo para evaluar la calidad de un
lote consistente en medir, en relacin con cada elemento, el valor de una
variable que caracteriza el producto analizado. La inspeccin consiste en medir
la variable que caracteriza el producto objeto de inspeccin respecto de cada
uno de los n elementos que forman la muestra, as como en calcular luego el
promedio x de esos n elementos de la muestra. La decisin acerca de la
aceptacin o el rechazo del lote se adoptar comparando el contenido medio x
con el valor numrico de una expresin algebraica que incluye los factores
siguientes:
-La especificacin mxima o mnima.
-La desviacin normal de los valores de la variable inspeccionada del lote, que
puede ser conocida o desconocida.
Tablas de planes de muestreo que proporcione la constante de aceptacin
K que depende del NCA de la variable medida.
Planes por atributos:
-No dependen de la funcin de distribucin de la variable inspeccionada en el
lote.
-Sencillez en la obtencin de los resultados de la medicin de la muestra.

-Son menos eficaces que los plan es por variables para una muestra del mismo
tamao, de n porciones de muestreo.
-Ms costosos que los planes por variables ya que se requieren mas muestras
que en los planes por variable para lograr la misma eficacia
3. Qu sustancias se usan como diluyentes paran realizar los anlisis
microbiolgicos en alimentos? Indique su composicin qumica.
RTA//

-Agua destilada: Es aquella a la que se le han eliminado las impurezas e iones

mediante destilacin.
-Solucin salina pepetonada 0.1% y ph 6.8: medio usado como diluyente y para
enriquecimiento bacteriano a partir de alimentos y otros materiales de inters
sanitario.
-Solucin amortiguadora de fosfatos 0.1M y PH 7.0
-Solucin salina isotnica (SSI): 0.85%
-Agua triptona: Medio lquido recomendado para enriquecimiento y para
verificar la produccin de indol por los microorganismos
4. Qu precauciones se deben antes de realizar diluciones a partir de
alimentos congelados, deshidratados o pasteurizados?
RTA// Inicialmente la muestra debe permanecer en las condiciones de
temperatura en las que se encontrara normalmente. Al momento de realizar las
diluciones se debe realizar en un ambiente lo mas estril posible, y realizar el
proceso en la mayor brevedad posible ya que este tipo de alimentos tienen una
flora bacteriana especial, las cuales viven es condiciones extremas ya que
procesos como la deshidratacin y las temperaturas extremas hacen que no
muchos microorganismos puedan crecer all
El problema de trabajar con microorganismos es su bajo tiempo de vida, ya que
para poder trabajar con ellos son necesarias sucesivas generaciones del
organismo que se mantengan idnticas entre s. Esto puede presentar una
serie de problemas.
La conservacin de cepas de produccin a lo largo de un perodo largo de
tiempo es un requerimiento bsico para la fermentacin industrial. El objetivo
no ser solo la supervivencia del organismo, sino que este mantenga sus
capacidades de produccin despus de la conservacin. El objetivo de la
conservacin es mantener las cepas sin cambios celulares tanto tiempo como
sea posible. Ha de encontrarse el mtodo ms adecuado para cada cepa.
1. Subcultivos: Es el mtodo ms fcil. Los microorganismos se mantienen
como cultivo por picadura en agar o en cultivo lquido en nevera, pero presenta
dos inconvenientes:

- Tiene elevados costes.

- Peligroso: Existe un elevado riesgo de contaminacin y de mutacin, ya que
se producir una mutacin cada 8 16 semanas, o alguna al ao. Incluso
pueden morir todas las clulas al haber tardado en hacer un nuevo subcultivo.
En estos casos los cultivos se mantienen a bajas temperaturas, entre 2 y 6 C,
para que las sucesivas resiembras estn espaciadas en el tiempo, hasta
semanas, pero se han de hacer en un momento u otro.
Una variante de este mtodo es el uso de medios pobres, ya sean medios
mnimos o tan solo agua y agar. Al tener a los microorganismos en medios tan
pobres, el crecimiento se ver ralentizado mucho, pudiendo llegar a alargar el
tiempo entre las siembras a meses, entre 3 y 5, pero los riesgos son los
mismos que se han dicho.
2. Almacenamiento por congelacin: Un descenso de la temperatura de 10 C
supone un descenso de la velocidad metablica del 50%. A temperaturas de
ultra congelacin el metabolismo estar totalmente frenado, incluso la actividad
qumica. Existen diferentes temperaturas de congelacin.
- Suave: -18 C, congelador domstico
- Fuerte: -80 C, congelador de 2 compresores
- Ultra congelacin: -196 C, congelacin en N lquido.
La congelacin ha de ser rpida pero gradual, para lo que se han de tener en
cuenta las siguientes consideraciones.
a. Los microorganismos deben estar en un medio rico y lquido, donde crecern
en la fase exponencial hasta llegar a su N Max, justo antes de llegar a la fase
estacionaria.
b. La concentracin de microorganismos ha de ser elevada, para lo que se
eliminar el medio por filtracin y se repartir el cultivo en 50 100 viales.
c. Adicin del crio protector que evitar la formacin de cristales en el interior
de la clula, que puede ser glicerol o DMSO, ya que son los ms usados. La
concentracin de estos crio protectores ha de estar entre el 5 y el 20%, ya que
concentraciones ms elevadas daran problemas de toxicidad al descongelar.
d. Se congela lo ms rpidamente posible.
e. Al cabo de 10-15 das, una vez se haya estabilizado la congelacin, se
debern coger 4 o 5 viales al azar, que se cultivarn. Esto es el control de
calidad o control de viables y es bsico, ya que as podremos conocer el
nmero aproximado de viables que habr en cada vial, ya que al congelar se
habr reducido este nmero. El nmero de viables no ha de ser menor del 70
80% del nmero de viables original. Si se recuperan menos, significar que
algo no habr ido bien.
f. Si el control de viables da los resultados deseados, se reparten los viales
restantes en 2 congeladores, por seguridad.
CONCLUSIONES
Se debe tener en cuenta el plan de muestreo que se va a utilizar si es el de una
o dos vas, tambin se debe tener muy en cuenta el estado de dicha muestra si

es solida o liquida o en qu estado de agregacin se encuentra (temperatura

ambiente o se encuentra refrigerada); ya que nos da una idea de como esta
conservada y que microorganismos se podran encontrar en dicha muestra,
tambin de como debe ser su manejo a la hora de su recepcin por parte del
laboratorio ( en este caso el laboratorio de microbiologa de alimentos).
Tambin debemos tener en cuenta que cuando llegue una muestra al
laboratorio esta debe tener la informacin necesaria como lugar de procedencia
o lote y tipo de proceso al que fue sometido si es el caso de productos
preparados, si el caso de productos o materias primas del lugar de
procedencia, teniendo en cuenta todo lo anterior tratar siempre en la medida de
lo posible manjar dichas muestras, siempre y en todo momento a las mismas
condiciones de ambiente, para que no halla una alteracin que no sea
representativa o verifica del lote o lnea de produccin de donde proviene dicho
producto alimenticio.
BIBLIOGRAFIA
-ARAMBULA, A.L. y MURCIA, G.M. Fundamentos y tcnicas microbiolgicas
de alimentos. Santander: Universidad Industrial de Santander. 1987.
-W. F. HARRIGAN y Mc CANCE, M. E. Mtodos de Laboratorio Microbiologa
de Alimentos y Productos Lcteos. Editorial Academia Len. Espaa. 1966.