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3B-2
GUIA DE PRCTICAS

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGA MDICA


LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLGICA

HISTOTECNOLOGA

AUTOR: PROFESOR ASCARZA GALLEGOS ANGELO

F-GA-04A-3

Rev. Enero 2005

PRACTICA N 1
HISTOTECNOLOGA: BIOSEGURIDAD Y TOMA DE MUESTRAS
Marco Terico
Es la ciencia que estudia los fundamentos tcnicos y la secuencia de manipulaciones
necesarias para llevar a cabo el anlisis de los tejidos de los seres vivos.
Bioseguridad es un concepto amplio que implica una serie de medidas orientadas a
proteger al personal que labora en un laboratorio, visitantes y al medio ambiente que
pueden ser afectados como resultados de la actividad Histotecnolgica
La calidad es un modelo de gestin y un estilo de direccin implantado en los
laboratorio de Histotecnologa.
Muestra Histolgica es toda muestra de tejidos obtenida de un individuo o animal sano
con la finalidad de investigar su estructura y composicin normales.
Competencia Especfica
Explica los fundamentos de las tcnicas histotecnolgicas como metodologas
cientficas coadyuvantes en el diagnstico histopatolgico
Propone procedimientos de Bioseguridad y Calidad como elementos fundamentales en
Histotecnologa.
Material y Mtodos

Rtulos de Bioseguridad.
Microscopio Binocular.
Bao de Flotacin
Micrtomo de Rotacin Manual.
Lmina Histolgica de Piel
Lmina Histolgica de Cerebro.
Lmina Histolgica de Hgado.
Acido Clorhdrico QP
Formaldehido al 40%
Alcohol Absoluto
Acido Pcrico
Piezas Anatmicas Completas fijadas
Instrumental y Material de diseccin

Procedimiento
Observa y esquematiza los procedimientos en Histotecnologa, desde la toma de
muestras hasta la lmina histolgica.

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Redacta protocolos y esquemas de Bioseguridad y Calidad acorde con las distintas


metodologas laboratoriales en Histotecnologa.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.

Cules son los principales procedimientos Histotecnolgicos?


Cuales son las caractersticas macroscpicas de las piezas anatmicas?
Cul es la definicin de Calidad que mas se adapta en Histotecnologia?
Cuales son las principales normas de bioseguridad en Histotecnologa?

Fuentes de Informacin
Carson F. Histotechnology. Chicago: ASCP; 2006.
Garcia Del Moral R. Laboratorio de anatoma patolgica. Mxico D.F.: McGraw Hill;
2010.
Prophet E, Mills B, Arrington J, Sobn L. Mtodos histotecnolgicos. Washington,
D.C.: ARP; 2009.
PRACTICA N 2
FIJACIN DE TEJIDOS
Marco Terico
Es la interrupcin de los procesos degradativos que aparecen tras la muerte celular,
tratando de conservar la estructura y composicin tisular lo ms cercanamente posible
a como se encontraba en el organismo vivo.
Competencia Especfica
Describe diversos tipos de fijadores como elementos fundamentales en la obtencin de
Histogramas.
Explica los fundamentos de los diferentes procedimientos de fijacin en
Histotecnologa.
Material y Mtodos

Agua Destilada.
Formaldehdo al 40%.
Alcohol Absoluto
Acido Pcrico
Acido Actico Glacial
Cloruro de Mercurio.
Dicromato Potsico.
Sulfato Sdico.
Piezas Anatmicas Completas

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Equipo de Diseccin
Alcoholimetro

Procedimiento
Observa y ejecuta los procedimientos de Fijacin en diversos tipos de tejidos.
Prepara fijadores especficos para cada tipo de coloracin segn el tipo de anlisis a
realizar.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.

Cuales son los componentes del Fijador Bouin?


Cuales son los componentes del Fijador Zenker?
Cual es el tipo de Formol ideal?
Cul es el porcentaje de Formaldehdo ideal en una solucin fijadora?

Fuentes de Informacin
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
Troyer H. Histochemistry. Boston: Little, Brown And Company; 2006.
FORMOL SALINO
Se utiliza para prevenir el choque osmtico que provoca el empleo de disoluciones de
formaldehdo en agua destilada.
Preparacin: Disolver 9 gramos de Cloruro de Sodio en 1000 mL de Formalina al 10%
FORMALINA NEUTRA
Se utiliza para neutralizar el exceso de cido Frmico generado por la oxidacin
espontnea del Formaldehdo.
Preparacin: Aadir a la solucin de Formalina al 10% una pequea cantidad de
Carbonato Clcico insoluble que quedaba depositado en el fondo del recipiente.
FORMOL TAMPONADO
Se utiliza para prevenir el choque osmtico que provoca el empleo de disoluciones
formaldehdo en agua destilada, as como el deposito de Pigmento Formlico que
ocurre a pH inferior a 6.
Preparacin: Como amortiguador se emplea el tampn fosfato calibrado n pH 7,0 7,2
Formalina Pura: 100,0 mL

Agua Destilada: 900,0 mL

Fosfato Sdico Monobsico: 4,0 gr

Fosfato Sdico Dibsico: 6,5 gr

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FORMOL CIDO
Se utiliza para fijar tejido nervioso en la preparacin de algunas tcnicas de
Impregnacin Argntica.
Preparacin: Aadir una parte de cido Actico Glacial a 99 partes de Formalina al
10%. Con ello se consigue un pH en torno a 2.
FORMOL CLCICO
Se utiliza en tcnicas de Histoenzimologa, ya que los iones de calcio estabilizan las
molculas enzimticas, cuando es empleado a 4 C.
Preparacin: Aadir Cloruro Clcico al 1 por 100 a una solucin de Formalina Neutra o
Tamponada al 10%.
BOUIN
cido Pcrico 2%(750 mL) + Formol (250 mL) + cido Actico Glacial (50 mL)
ZENKER
Zenker Stock = Cloruro Mercrico (5gr) + Dicromato Potsico (2,5 gr) + Sulfato Sdico
(1gr) + H2O (1L)
Solucin de Trabajo de Zenker = Zenker Stock (95mL) + Formaldehido 40% (5mL)

PRACTICA N 3
PROCESAMIENTO DE TEJIDOS
Marco Terico
Las muestras para estudio Anatomopatolgico pueden ser procesados de muy diversas
maneras, en funcin de:
La naturaleza de la muestra
Tipo de estudio a a realizar
El Procesamiento de Tejidos para estudios Antomo Patolgicos consiste en:
Deshidratacin.-: Es el proceso que tiene por finalidad la eliminacin completa del
agua de la muestra tisular para que el tejido pueda embeber ( absorber ) otros
reactivos que no sean Hidrosolubles.

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Aclaracin.- Se trata de un proceso por el cual se consigue la sustitucin del Agente


Deshidratante (Alcohol) por una sustancia miscible con el Medio de Inclusin
(Parafina) que va a utilizarse. A este proceso tambin se le llama Desalcoholizacin.
Infiltracin.- Es el proceso que tiene por objeto Infiltrar=Rellenar el tejido con el
medio de Infiltracin. El objetivo es: ocupar completamente con Parafina los espacios
intra y extracelulares inicialmente ocupados por el agua.
Competencias Especificas
Describe el Procesamiento de Tejidos como elemento fundamental en la obtencin de
Histogramas.
Detalla los fundamentos de los distintos procedimientos durante el Procesamiento de
Tejidos.
Material y Mtodos

Agua Destilada
Alcohol Absoluto
Xilol
Parafina
Estufa
Alcoholimetro
Sulfato de Cobre
Cubetas de Procesamiento
Pipetas
Piezas Anatmicas Completas
Equipo de Diseccin
Cassettes Plsticos para Inclusin en Parafina

Procedimiento
Acondiciona estaciones de procesamiento histotecnolgico para diversos tipos de
tejido.
Observa y ejecuta los procedimientos de Deshidratacin, Aclaramiento e
Impregnacin.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.

Cul es la funcin del Alcohol?


Cul es la funcin del Xilol?
Cul es la funcin de la Parafina?
Qu cambios fsicos ocurren en el tejido en cada estacin?

Fuentes de Informacin
Garcia Del Moral R. Laboratorio de anatoma patolgica. Mxico D.F.: McGraw Hill; 2010.

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Prophet E, Mills B, Arrington J, Sobn L. Mtodos histotecnolgicos. Washington, D.C.: ARP;


2009.
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.

Bateria de Procesamiento
Agua Corriente
Alcohol al 60%
Alcohol al 70%
Alcohol al 80%
Alcohol al 96%
Alcohol Absoluto I
Alcohol Absoluto II
Alcohol Absoluto III
Xilol I
Xilol II
Xilol III
Parafina I
Parafina II
Parafina III

15
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora
1 hora

PRACTICA N 4
MICROTOMIA
Marco Terico
Es la ciencia que se encarga de estudiar, analizar e interiorizar los fundamentos de
funcionamiento y uso del Micrtomo, as como los procesos y accesorios relacionados.
PARTES
Todos los Micrtomos poseen idnticos principios bsicos de funcionamiento:
Portabloque
Portacuchilla
Mecanismo de Avance
Existen 6 tipos de Micrtomos:
Micrtomo de Balanceo
Micrtomo de Rotacin

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Micrtomo de Deslizamiento
Micrtomo de Congelacin
Criostato
Ultramicrtomo
Competencia Especfica
Describe los procedimientos de Microtoma como elemento fundamental en la
obtencin de Histogramas.
Explica los fundamentos de los distintos procedimientos de Microtoma en
Histotecnologa.
Material y Mtodos

Micrtomo de Rotacin Automtico


Bao de Flotacin
Cuchilla Descartable Perfil Bajo
Laminas Biseladas
Pincel Pelo de Camello
Colapiz
Pinza Mosquito
Bloques de Parafina con Tejidos
Canastilla Portalminas
Lapiz Punta Diamante

Procedimiento
Observa los procedimientos de Microtoma en Histotecnologa.
Ejecuta los procedimientos de retallado, enfriamiento, fijacin de bloque, orientacin
del portabloque y portacuchilla, debastado y seccin.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.

Cuales son los procedimientos en Microtoma?


Cules son los tejidos que presentan mas resistencia a la seccin?
Qu sucede si no se enfra el bloque de parafina a seccionar?
Qu sucede si no se vierte Colapiz en el Bao de Flotacin?

Fuentes de Informacin
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
Troyer H. Histochemistry. Boston: Little, Brown And Company; 2006.
Vacca L. Laboratory manual of histochemistry. New York: Raven; 2006.

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PRACTICA N 5
COLORANTES Y COLORACIONES
Marco Terico
Se define un COLORANTE como: Sustancia lquida que puesta en contacto con un
tejido, se une a l, de forma perdurable, transmitiendole su color
CLASIFICACIN DE LOS COLORANTES SEGN SUS GRUPOS CROMOFOROS
Se distinguen 8 grupos de Colorantes:
A) Colorantes derivados del Xanteno
B) Colorantes derivados del Benceno
C) Colorantes derivados del Naftaleno
D) Colorantes derivados de la Acridina
E) Colorantes derivados de Antraquinona
F) Colorantes derivados del Difenilmetano
G) Colorantes derivados de las Ftalocianinas
H) Colorantes derivados de Iminas Quinnicas
CLASIFICACIN DE LOS COLORANTES SEGN SUS GRUPOS AUXOCROMOS
Se distinguen 5 grupos de Colorantes:
A. Colorantes Bsicos
B. Colorantes cidos
C. Colorantes Neutros
D. Colorantes Indiferentes
E. Colorantes Metacromticos
Competencia Especfica
Describe los procedimientos de la preparacin de reactivos, insumos y colorantes como
elemento fundamental en la obtencin de histogramas

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Explica los fundamentos de los distintos procedimientos en las coloraciones.


Material y Mtodo

Agua Destilada
Cristales de Hematoxilina
Eosina Yellow
Oxido Rojo de Mercurio
Alumbre Potsico o Amonio
Alcohol Etlico
Material de Vidrio
Cocinilla Electrica

Procedimiento
Observa y ejecuta los procedimientos de preparacin de reactivos, insumos y
colorantes.
Acondiciona diversas bateras de coloracin.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.

Como se prepara la solucin de Hematoxiiina?


Cuales son los diversos tipos de Hematoxilina existentes?
Cmo se prepara la solucin de Eosina?
Cules son las maneras de almacenamiento de insumos, colorante sy reactivos?

Fuentes de Informacin
Prophet E, Mills B, Arrington J, Sobn L. Mtodos histotecnolgicos. Washington, D.C.:
ARP; 2009.
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
HEMATOXILINA DE HARRIS
PROCEDIMIENTO TECNICO
Hematoxilina ( cristalizada )
1 gr
Etanol absoluto
10 mL
Disolver calentando suavemente
Alumbre Potasico o Amonico
20 gr
Agua destilada
200 mL
Disolver en caliente. Aadir la solucin de Hematoxilina y llevar a ebullicin. Cuando
comienza a hervir se aade:
Oxido Rojo de Mercurio
0,5 gr

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EOSINA
Solucin Matriz: 1 gramo de eosina Y hidrosoluble en 20 mL de Agua Destilada, aada
80 Ml de Etanol al 95%
Solucin Diaria: A una parte de Soluci Matriz aada 3 partes de Etanol al 80% y 0,5 mL
de cido Acetico Glacial por cda 100 mL del colorante
ROJO DE CONGO
01 gramo de Rojo de Congo en 100 mL de Agua Destilada
FUCSINA BASICA
Al 1%: 01 gramo de Fucsina Basica en 100 mL de Agua Destilada
ESCARLATA DE BIEBRICH
01 gramo de Escarlata de Biebrich en 100 mL de Agua Destilada
VERDE CLARO
Solucin Matriz: 0,2 gramos de Verde Claro, SF amarillento en 100 mL de Agua
Destilada, aada luego 0,2 mL de cido Actico Glacial
Solucin Diaria: 10 mL de la Solucin Matriz de Verde Claro en 50 mL de Agua Destilada
CARBONATO DE LITIO
Solucin al 0,5%: 0,5 gramos de Carbonato de Litio en 100 mL de Agua Destilada
Solucin Saturada: 1,54 gramos de Carbonato de Litio en 100 mL de Agua Destilada
HEMATOXILINA FERRICA DE WEIGERT
Solucin Matriz
A: 01 gramo de Hematoxilina en 100 Ml de Etanol al 95% Solucin Matriz B: 4,0 mL de
Cloruro Ferrico al 29%, 95 mL de Agua Destilada y 01 mL de cido Clorhdrico
Concentrado.
SOLUCIN DIARIA DE HEMATOXILINA FERRICA DE WEIGERT
Partes
iguales (100mL) de soluciones matrices A y B. La solucin diaria de la Hematoxilina
Ferrica de Weigert puede usarse por aproximadamente dos semanas.
SOLUCIN DE YODO
Solucin de Gram: 01 gramo de Yodo, 02 gramos de Yoduro de Potasio en 300 mL de
Agua Destilada

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PRACTICA N6
COLORACIN DE PAPANICOLAO
Marco Terico
La Coloracin de Papanicolaou, se denomina as en honor a George Papanicolaou,
quien en el ao de 1941, publica una tcnica de coloracin que permite correlacionar
cambios citolgicos vaginales con el ciclo menstrual de las mujeres y el diagnostico de
casos asintomticos de neoplasia intrauterina.
Es un mtodo de tinciones policromticas que consta de una Tincin Nuclear y una
Tincin Citoplasmtica.
Tiene 2 ventajas:
1. Ncleo ntido, con buena definicin del detalle, pudiendo evidenciarse el patrn de
cromatina.
2. Citoplasma de aspecto transparente, que permite apreciar los grados de
diferenciacin celular y actividad metablica.
La Coloracin de Papanicolaou utiliza 3 colorantes:
1. Hematoxilina
2. Orange G
3. EA-50

La Coloracin de Papanicolaou tiene 4 pasos principales:


a. Fijacin
b. Tincin Nuclear
c. Tincin Citoplasmtica
d. Aclaramiento
Competencia Especfica
Describe los procedimientos de la Coloracin de Papanicolao como elemento
fundamental en la observacin celular de un extendido crvico vaginal
Explica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Coloracin de
Papanicolao
Material y Mtodo

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Agua Destilada
Solucin de Trabajo de Hematoxilina de Harris
Solucin Orange G
Solucin de EA50
Xilol
Laminas Fijadas con Extendidos Crvico Vaginales
Alcohol: 100%, 96%, 80%, 70%
Cubetas de Coloracin
Canastillas de Coloracin
Blsamo de Canad

Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico de la Coloracin de Papanicolao
Acondiciona la batera de coloracin de Papanicolao.
Ejecuta la Coloracin de Papanicolao.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.

Cul es la funcin de la solucin de Hematoxiiina de Harris?


Cuales es la funcin del Orange G?
Cul es la funcin del EA50?
Cul es la funcin del Agua Amoniacal?

Fuentes de Informacin
Garcia Del Moral R. Laboratorio de anatoma patolgica. Mxico D.F.: McGraw Hill;
2010.
Prophet E, Mills B, Arrington J, Sobn L. Mtodos histotecnolgicos. Washington,
D.C.: ARP; 2009.
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.

COLORACIN DE PAPANICOLAOU

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1.-Fijacin en Alcohol ter

>=15

2.-Enjuagar en Agua Corriente

3.-Hematoxilina de Harris

4.-Enjuagar en Agua Corriente

5.-Alcohol Acido 1%

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6.-Enjuagar en Agua Corriente

7.-Agua Amoniacal

10

8.-Enjuagar en Agua Corriente

9.-Alcohol Etlico de 96%

10.-Orange G

11.-Alcohol Etlico de 96%

30

12.-EA50

13.-Alcohol Etlico de 96%

30

14.-Alcohol Etlico de 96%

30

15.-Alcohol Absoluto

30

16.-Alcohol Absoluto

30

17.-Xilol

18.-Xilol

Resultados:
Se observan clulas de los diferentes estratos del epitelio vaginal y del endo y
exocervix, con diferentes tonalidad de coloracion, Eosinfilas y Cianfilas. Se pueden
observar las caracteristicas estructurales del ncleo color violeta asi como
determinadas pigmentaciones en los citoplasmas.
PRACTICA N7
COLORACIN DE HEMATOXILINA EOSINA
Marco Terico

HEMATOXILINA DE HARRIS
Es la Hematoxilina mas utilizada en la coloracin rutinaria de los ncleos celulares,
debido
a) Su estabilidad (se conserva entre 6 y 12 meses)
b) Su facilidad de manejo.

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Es una Coloracin Regresiva: Primero se sobrecolorea y luego se retira el exceso de


colorante por Diferenciacin
EOSINA
Es un derivado Hidroxixantnico Halogenados con 3 grupos anilo.
Las diferentes Eosinas se diferencian por el tipo y numero de tomos Halgenos que
contienen
Eosina Y: cuatro tomos de Bromo
Eosina B: dos tomos de Bromo
En general la Eosina tiene autofluorescencia espontnea y colorean los tejidos de
diversas tonalidades entre rojo y rosa.
La Eosina se difunde fcilmente entre las estructuras tisulares, sobre todo en las mas
compactas, a las cuales tien debido a que por su carcter cido son atrados
fuertemente hacia los radicales Bsicos de la Histidina, Lisina y Arginina presentes en
las protenas titulares.
Competencia Especfica
Describe los procedimientos de la Coloracin Hematoxilina - Eosina como elemento
fundamental en la obtencin de Histogramas.
Explica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Coloracin Hematoxilina
- Eosina.
Material y Mtodo

Agua Destilada
Solucin de Trabajo de Hematoxilina
Solucin de Trabajo de Eosina
Xilol
Alcohol: 100%, 96%, 80%, 70%
Cubetas de Coloracin
Canastillas de Coloracin
Blsamo de Canada

Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico de la Coloracin de Hematoxilina Eosina.
Acondiciona la batera de coloracin de Hematoxilina Eosina.
Ejecuta la Coloracin de Hematoxilina Eosina.
Cuestionario
5. Cul es la funcin de la solucin de Hematoxiiina?

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6. Cuales es la funcin de la Solucin de Eosina?


7. Cul es la funcin de los Agentes Deshidratantes?
8. Cul es la funcin del Acido Clorhdrico?
Fuentes de Informacin
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
Troyer H. Histochemistry. Boston: Little, Brown And Company; 2006.
Vacca L. Laboratory manual of histochemistry. New York: Raven; 2006.

BATERIA DE COLORACIN DE HEMATOXILINA--EOSINA


1.- Estufa

60

2.- Xilol

3.- Xilol

4.- Alcohol Absoluto

5.- Alcohol Absoluto

6.-Alcohol 96

7.-Alcohol 80

8.-Alcohol 70

9.-Agua Destilada

10.-Hematoxilina

11.-Agua Destilada

30

12.- Agua Acida 1%

13.- Agua Destilada

30

14.- Agua Amoniacal

10

15.- Agua Destilada

30

16.- Eosina

17.- Agua Destilada

30

18.- Alcohol 70

19.- Alcohol 80

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20.- Alcohol 96

21.- Alcohol Absoluto

22.- Alcohol Absoluto

23.- Xilol

24.- Xilol

Montar con Blsamo de Canad o Entellan


Resultados: Ncleos Violeta y Citoplasmas Rosados
PRACTICA N8
PRIMERA EVALUACIN TEORICA
PRACTICA N9
TINCIN PARA AMILOIDES: ROJO DE CONGO
MARCO TERICO
La coloracin con rojo Congo funciona sobre la base de enlaces por puente de
hidrgeno con el componente de hidrato de carbono del substrato. El amiloide,
teido por el rojo Congo, muestra un llamativo bicromatismo bajo la luz
polarizada, los sedimentos muestran sectores verdes luminosos sobre fondo
oscuro, mientras que otros materiales, como colgeno, que tambin son
teidos por el rojo Congo, no muestran este efecto.
Competencia Especfica
Describe los procedimientos de la Coloracin Rojo de Congo como elemento
fundamental en la tincin de amiloides.
Explica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Coloracin Rojo de
Congo.
Material y Mtodo
Como material de partida se usan cortes con un espesor de 4-5 m, de tejidos
fijados con formol, incluidos en parafina.
Reactivos
Solucin 1: Solucin de rojo Congo 100 ml
Solucin 2: Solucin de KOH 2 x 100 ml
Necesario adicionalmente:
Hematoxilina en solucin segn Gill III 500 ml
Hematoxilina en solucin segn Gill II 500 ml

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Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico de la Coloracin Rojo de Congo.
Acondiciona la batera de coloracin Rojo de Congo.
Ejecuta la Coloracin Rojo de Congo.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.

Cul son los amiloides?


Qu colorante acta a nivel celular?
Cul es la funcin del Rojo de Congo?
Qu color toman los amiloides?

Fuentes de Informacin
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
Troyer H. Histochemistry. Boston: Little, Brown And Company; 2006.
Tcnica
Etapa Tiempo
Desparafinar en forma tpica los cortes y rehidratar.
Enjuagar en agua destilada. 1 min.
Teir en solucin de hematoxilina segn Gill III o Gill II 5 min.
Enjuagar en agua corriente del grifo 5 min.
Teir en solucin de rojo Congo 10 min.
Enjuagar en agua destilada
Diferenciar en solucin de KOH 30 - 40 segundos
Enjuagar en etanol del 96 % 30 segundos*
Enjuagar en etanol del 96 % 30 segundos*
Deshidratar en etanol del 100 % 1 min*
Deshidratar en etanol del 100 % 1 min*
Aclarar en Neo-Clear 5 min.
Aclarar en Neo-Clear 5 min.
Montar con Neo-Mount
Resultado
Ncleos azul obscuro
Amiloide al trasluz rosa a rojo
Amiloide bajo luz polarizada metacromasia verde
Tejido conjuntivo rojo claro
PRACTICA N10
COLORACIN PARA CARBOHIDRATOS: REACCIN DE PAS

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Marco Terico
La histoqumica es la aplicacin de reacciones qumicas y bioqumicas en la tcnica
histolgica, con el fin de localizar y determinar de manera cientfica ciertas sustancias
o su actividad.
En todas estas reacciones o bien se tie la sustancia que buscamos o los colorantes
reaccionan qumicamente con ella, como es el caso del PAS.
Los hidratos de carbono o glcidos son polialcoholes oxidados (polihidroxicetonas o
polialdehidos). Los polisacridos son glcidos formados por la unin de muchas
molculas de monosacridos (mas de 10). Entre los polisacridos adems de los
polisacridos simples como el glucgeno destacan los polisacridos complejos.
Los polisacridos complejos se dividen en 3 grandes grupos:
Mucopolisacaridos que pueden dividirse en :
Mucopolisacaridos neutros
Mucopolisacaridos cidos
Mucoprotenas
Mucolpidos.

Competencia Especfica
Describe los procedimientos de la Reaccin PAS como elemento fundamental en la
obtencin de Histogramas
Explica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Reaccin del cido
Peridico de Schiff.
Material y Mtodo

Agua Destilada
Acido Peryodico
Reactivo de Schiff
Fucsina Bsica
Acido Clorhdrico Concentrado
Metabisulfito Sdico
Xilol
Laminas con Tejidos Desparafinados
Alcohol: 100%, 96%, 80%, 70%
Cubetas de Coloracin
Blsamo de Canad

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Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico de la Reaccin del cido Peridico de
Schiff.
Acondiciona la batera de la Reaccin del cido Peridico de Schiff.
Ejecuta la Reaccin del cido Peridico de Schiff.
Cuestionario
1.
2.
3.
4.

Cul es la funcin del Acido Perydico?


A que nivel acta los Colorantes de Contraste?
Cul es la funcin del Reactivo de Schiff?
Qu tonalidad adquiere la estructura celular?

Fuentes de Informacin
Garcia Del Moral R. Laboratorio de anatoma patolgica. Mxico D.F.: McGraw Hill; 2010.
Prophet E, Mills B, Arrington J, Sobn L. Mtodos histotecnolgicos. Washington, D.C.:
ARP; 2009.
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.
PROCEDIMIENTO TCNICO DEL PAS
Fijacin:
o Formol al 4 % o Lquido de Carnoy o Bouin.
o cido Peridico0.5 % p/v.
o Reactivo de Schiff:
Fucsina bsica (CI: 42510) 1g.
Agua destilada... 200 ml.

Disolver la fucsina en 200 ml de agua (d) hirviendo.


Dejar enfriar hasta aproximadamente 50 C. y filtrar
Posteriormente agregar 20 ml de HCl 1N. Despus enfriar hasta 25 C y aadir 1g de
Bisulfito sdico o Metabisulfito potsico (sdico).
Mantener en la oscuridad. El liquido tarda unos 2 das o a veces 24h en tornarse de
color amarillo que indica que est listo para su uso.
Aadir 2g de carbn activado, mezclar y filtrar hasta que desaparezca el color.

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La solucin debe conservarse en el refrigerado protegido de la luz.


o Bao de cido Sulfuroso o Agua sulfurosa:
o cido Clorhdrico (HCl) 1N 5 ml.
o Metabisulfito sdico 10 %... 6 ml.
o Agua (d)... 100 ml.
o Colorante de contraste: Hematoxilina, Orange G o Van Gieson.

Tcnica de Tincin:
Desparafinar e hidratar (xilol y decrecientes alcoholes)
cido peridico 0.5 % 5 min.
Lavar en agua (d).
Reactivo de Schiff.. 15- 30 min.
Aclarar en 3 baos de agua sulfurosa 2 min. Cada uno.
Lavar en agua corriente
Colorante de contraste
Lavar con agua corriente.
Deshidratar, aclarar y montar.

PRACTICA N12
COLORACIN PARA TEJIDO CONECTIVO: TRICRMICA SEGN MASSON
Marco Terico
Las coloraciones trcromas permiten visualizar de forma selectiva fibras musculares,
fibras colgenas, fibrina y eritrocitos por el empleo combinado de tres soluciones
colorantes diferentes. Los mtodos originales se emplearon sobre todo para la
diferenciacin de fibras colgenas y musculares. La seleccin de los colorantes
empleados, que se diferencian por su tamao de molcula, produce una coloracin
diferenciada de los distintos componentes tisulares.
La tincin de Masson-Goldner ofrece las siguientes ventajas: el mtodo puede
realizarse con material fijado en formol; previa tincin nuclear con hematoxilina
frrica de Weigert se tien los componentes tales como musculatura, citoplasma y
eritrocitos con azofloxina y solucin de anaranjado G.
Seguidamente se contratie el tejido conectivo con solucin de verde luz SF.

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Competencia Especfica
Describe los procedimientos de la Coloracin Tricrmica segn Masson como elemento
fundamental en la tincin de Tejido Conectivo
Explica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Coloracin Tricrmica
segn Masson.
Material y Mtodo
Cortes parafnicos de 3-5 m de espesor
Solucin 1: Solucin de azofloxina 500 ml
Solucin 2: Solucin de cido fosfovolfrmico-anaranjado G 500 ml
Solucin 3: Verde luz SF en solucin 500 ml
Solucin 4: cido actico 10% 500 ml
Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico de la Tincin para Tejido Conectivo:
Tricrmica segn Masson
Acondiciona la batera de coloracin Tricrmica segn Masson
Ejecuta la Coloracin Tricrmica segn Masson
Cuestionario
5.
6.
7.
8.

Cul es la funcin de la Soluciona de Azofloxina?


A que nivel acta el cido fosfovolfrmico-anaranjado ?
Cul es la funcin del Verde Luz?
Qu tonalidad adquiere la estructura celular?

Fuentes de Informacin
Prophet E, Mills B, Arrington J, Sobn L. Mtodos histotecnolgicos. Washington, D.C.: ARP;
2009.
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
PROCEDIMIENTO DE LA COLORACIN PARA TEJIDO CONECTIVO: TRICRMICA DE
MASSON
Etapa - Tiempo
Xileno 5 min.
Xileno 5 min.
EtOH 100% 30 segundos
EtOH 100% 30 segundos
EtOH 96% 30 segundos

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EtOH 96% 30 segundos


EtOH 70% 30 segundos
EtOH 70% 30 segundos
Hematoxilina de Weigert 5 min.
Agua corriente del grifo, fluente 5 min.
Enjuagar en cido actico del 1 % 30 segundos
Solucin de azofloxina 10 min.
Enjuagar en cido actico del 1 % 30 segundos
Solucin de cido fosfovolfrmico-anaranjado G 1 min.
Enjuagar en cido actico del 1 % 30 segundos
Verde luz SF 2 min.
Enjuagar en cido actico del 1 % 30 segundos
EtOH 70 % 30 segundos
EtOH 96 % 30 segundos
EtOH 100 % 30 segundos
EtOH 100% 30 segundos
EtOH 100% 2 min.
Xileno 5 min.
Xileno 5 min.
PRACTICA N13
COLORACIN PARA MICROORGANISMOS: ZIEHL NIEELSEN
Marco Terico
La tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una tcnica de tincin diferencial rpida y
econmica, para la identificacin de microorganismos patgenos, por ejemplo M.
tuberculosis.
Fue descrita por primera vez por dos mdicos alemanes, Franz Ziehl (1859 a 1926), un
bacterilogo y Friedrich Neelsen (1854 to 1894), un patlogo.
Este mtodo se basa en que las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias
contienen cido graso|cidos grasos (por ejemplo, el cido miclico) de cadena larga
(50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin
con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan
cido-alcohol resistencia|bacilos cido-alcohol resistentes o BAAR.
Competencia Especfica
Describe los procedimientos de la Coloracin Ziehl Nieelsen como elemento
fundamental en la obtencin de Histogramas
Explica los fundamentos de los distintos procedimientos de la Coloracin Ziehl
Nieelsen

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Material y Mtodo

Agua Destilada
Acido Peryodico
Cristales de Fenol
Fucsina Acida
Hematoxilina
Acido Clorhdrico Concentrado
Metabisulfito Sdico
Xilol
Laminas con Tejidos Desparafinados con probada infeccin al M. tuberculosis
Alcohol: 100%, 96%, 80%, 70%
Cubetas de Coloracin
Blsamo de Canad

Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico de la Coloracin ZN.
Acondiciona la batera de la Coloracin Ziehl Nieelsen.
Ejecuta la Coloracin Ziehl Nieelsen.
Cuestionario
1. Cul es la funcin del Acido Perydico?
2. A que nivel acta la Hematoxilina?
3. Cul es la funcin de la Fucsina Acida?
4. Qu tonalidad adquiere la estructura del M. tuberculosis?
Fuentes de Informacin
Lillie R. Biological stains. 8 ed. Baltimore: Waverly; 2008.
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
Troyer H. Histochemistry. Boston: Little, Brown And Company; 2006.

TECNICA PARA MICROORGANISMOS: ZIEHL NIEELSEN


Reactivos
1. cido Peridico 5%
2. Carbol Fucsina de Ziehl (fucsina fenicada). Preparar mezclando en el orden dado:

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0,5 g fucsina bsica

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50 cc agua destilada

5 cc etanol absoluto

2,5 g cristales de fenol derretidos

3. Hematoxilina
4. Alcohol cido 1%:
Alcohol de 70
cido Clorhdrico
El procedimiento es el siguiente:
1. Desparafinar e hidratar los cortes
2. cido peridico 5%, 10 min
3. Lavar con agua destilada
4. Fucsina fenicada, 15 min
5. Decolorar en alcohol cido al 1%
6. Lavar con agua destilada
7. Hematoxilina, 10 min
8. Azulidificar con, por ejemplo, carbonato de litio
9. Deshidratar, aclarar y montar preparaciones
Resultados
BAAR: Rojo.
Ncleos: Azul.
PRACTICA N15
INMMUNOHISTOQUMICA: INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA E INDIRECTA
Marco Terico
INMUNOHISTOQUMICA
Tcnicas de Inmunofluorescencia

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Generalidades sobre Mtodos Inmunohistoqumicos


Los mtodos Inmunohistoqumicos sirven para detectar Antgenos celulares o tisulares
mediante Reacciones Antgeno-Anticuerpo.
Para visualizar el lugar donde ocurre la reaccin antgeno anticuerpo es preciso
emplear un Trazador o Marcador.
El marcaje puede realizarse con:
Fluorocromos: Tcnicas de Inmunofluorescencia
Enzimas: Tcnicas Inmunoenzimticas
Iones Metlicos en Forma Coloidal: Tcnica Inmuno Oro
Istopos Radioactivos
El Antgeno puede detectarse tanto por: Marcaje Directo del Ac: Tcnicas Directas
Marcaje Secundario del Ac: Tcnicas Indirectas
Tcnicas de Inmunofluorescencia Directa.- Se utiliza un Anticuerpo especifico
Conjugado a un Fluorocromo, frente al Antgeno que se desea detectar.
Tcnicas de Inmunofluorescencia Indirecta.- Se utiliza en un primer paso un Anticuerpo
Especifico NO marcado (Ac Primario). En una segunda fase se utiliza un Anticuerpo
marcado con el correspondiente Fluorocromo (Ac Secundario) que reacciona de forma
especifica con el Anticuerpo Primario.
Competencia Especfica
Describe los procedimientos en Inmunofluorescencia como elemento fundamental en la
deteccin de Antgenos y Anticuerpos.
Explica los fundamentos de los distintos procedimientos en Inmunofluorescencia
Material y Mtodo

Microscopio de Fluorescencia
Laminas con Tejidos seccionados en Criostato
Sueros de Pacientes con Enfermedades Autoinmunes
Acetona
PBS
Antisuero Primario Conjugado (Fluorescena)
Cmara Hmeda
PBS Glicerol Gelatina

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Lmina Histolgica Preparada de Rin

Procedimiento
Observa el procedimiento Histotecnolgico en Inmunofluorescencia
Ejecuta los procedimientos en Inmunofluorescencia
Cuestionario
1. Cul es la funcin del Acido Perydico?
2. A que nivel acta la Hematoxilina?
3. Cul es la funcin de la Fucsina Acida?
4. Qu tonalidad adquiere la estructura del M. tuberculosis?
Fuentes de Informacin
Sheehan D, Hrapchak B. Histotechnology. 2 ed. Columbus: Battelle; 2006.
Troyer H. Histochemistry. Boston: Little, Brown And Company; 2006.
Vacca L. Laboratory manual of histochemistry. New York: Raven; 2006.
TCNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (tejido congelado)
PROCEDIMIENTO TCNICO
1.-Se realizan cortes en el criostato de aproximadamente 5 micras de espesor.
2.-Se delimita mediante un circulo realizado con un lpiz de diamante alrededor de
cada seccin, la superficie de incubacin con los anticuerpos ( utilizar portaobjetos
diseados especficamente para metodologas Inmunohistoqumicas ).
3.- Fijar en acetona fra a -20C entre 5 y 15 minutos
4.- Secar los cortes al aire
5.- Realizar 3 lavados en PBS de 10 minutos c/u.
6.- Drenar el exceso de PBS y secar alrededor del circulo usando un pauelo de papel.
7.- Cubrir la seccin con el Antisuero Primario Conjugado, a la dilucin ptima
determinada previamente. La incubacin se realizar en cmara hmeda a
temperatura ambiente y durante 30 minutos.
8.- Realizar otros 3 lavados como en el paso 3 y secar igualmente en torno al circulo.

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9.- Montar utilizando un medio hidrosoluble especifico para Inmunofluorescencia o en


su defecto en PBS Glicerol gelatina. Sellar los bordes del cubreobjeto con
polivinilalcohol.
10.- Almacenar a 4C hasta su lectura en un microscopio de fluorescencia preservando
en todo momento de la luz
Resultados:
Marcaje con FITC

Fluorescencia verde manzana

Marcaje con TRITC

Fluorescencia rojo anaranjada

Observaciones
La tcnica de Inmunofluorescencia se usa fundamentalmente en el diagnostico de la
patologa renal y de determinadas lesiones cutneas.
TECNICA DE INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
PROCEDIMIENTO TCNICO
Modo de Operar
1.-Diluir en PBS el suero que se desee probar. Para la mayor parte de auto anticuerpos
puede emplearse una dilucin a 1/10, para detectar Anticuerpos frente a los Islotes de
Langerhans y se debe emplear el suero sin diluir.
2.-Incubar las secciones de tejido elegidas con el suero problema, durante 30 minutos
a temperatura ambiente o bien toda la noche a 4C.
3.-Realizar 3 lavados en PBS de 10 minutos cada uno.
4.-Drenar el exceso de PBS.
5.-Incubar con el conjugado de Inmunoglobulina anti Ig Humana y Fluorocromo a la
dilucin optima durante 30 minutos en cmara hmeda.
6.-Decantar el antisuero y realizar 3 lavados con PBS de 10 minutos cada uno.
7.-Montar en medio hidrosoluble especfico para Inmunofluorescencia
Resultados
Marcaje con FITC: Fluorescencia verde manzana

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Marcaje con TRITC: Fluorescencia rojo anaranjado


Observaciones: Los sueros que resulten positivos pueden titularse haciendo diluciones
seriadas del suero problema e indicando la dilucin mas alta a la que la tcnica resulta
positiva. Por ejemplo, si se seala que unos anticuerpos antimicrosomiales son
positivos con un titulo de 1/1600 quiere decirse que esta es la dilucin mas alta a la
que la inmunotincin resulta positiva.

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