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Actualidad profesional

Una nueva era para el diagnstico

gentico en salud y produccin animal
En este trabajo se intenta trasmitir el amplsimo campo de utilizacin y aplicacin de la PCR en tiempo real (RT-PCR) aplicando
sondas TaqMan en cuanto al estudio del genoma en animales domsticos con resultados muy eficientes en un tiempo reducido.

Figura 1. Equipo de Real

Time PCR (Applied Biosystems 7300) del laboratorio de Citogentica y Gentica Molecular de la Facultad de Veterinaria de
Zaragoza.

S. Llamb2, C.B. Garca1

y M.V. Arruga1
1
Laboratorio de Citogentica
y Gentica Molecular
Facultad de Veterinaria de Zaragoza
2
Area Gentica. Facultad de Veterinaria.
Montevideo-Uruguay
E-mail: mvarruga@unizar.es
Imgenes cedidas por los autores
La tecnologa de la reaccin en cadena
de la polimerasa (PCR), si bien se describi por primera vez en el ao 1985
como una novedosa tcnica de deteccin de cidos nuclicos (ADN, ARN),
con el tiempo super los alcances de la
misma convirtindose en una poderosa
herramienta en la investigacin con
fines de diagnstico. A travs de los
aos, el desarrollo de distintas variantes
de la tcnica ha permitido una aplicacin cada vez ms especfica en medicina humana y animal. Actualmente nos
encontramos frente a una novedosa tcnica denominada PCR en tiempo real
(RT-PCR) aplicando sondas TaqMan.

PCR en tiempo real (RTPCR) con sonda TaqMan

Esta nueva variante de PCR logra ptimos resultados en cuanto a una mejor
estandarizacin, cuantificacin, automatizacin y miniaturizacin de las experiencias con una reduccin de tiempo y coste
en el diagnstico a la vez que un aumento en el nmero de muestras a analizar.
Esta tcnica cuantitativa se logra a travs del desarrollo e integracin de la
informtica aplicada a la tcnica de PCR
y la tecnologa lser para la deteccin de
productos de amplificacin (figura 1).
Por otro lado, la estandarizacin de placas de 96 pocillos permite analizar y
obtener un resultado de un gran nmero
de muestras en pocas horas*.
Esta tcnica comprende una serie de
caractersticas y reacciones bioqumicas
particulares de sus componentes (ADN
molde o blanco, cebadores u oligonucletidos, sonda TaqMan, enzima TaqMan
polimerasa, nucletidos).

Funcionamiento
El funcionamiento ocurre cuando la
ADN TaqMan polimerasa comienza a
sintetizar la hebra de ADN complementaria al fragmento y, a su vez, por su
accin exonucleasa comienza a degradar
la sonda liberando el extremo 5 con el
colorante R; de esta manera, la fluores-

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cencia emitida comienza a aumentar

mientras que la del fluorocromo Q
comienza a decrecer. La visualizacin del
resultado va apareciendo en la pantalla
del ordenador mediante la integracin de
la seal fluorescente reflejndose como
una curva de amplificacin (figura 3). El
resultado se resuelve como positivo
cuando la seal emitida es superior al
umbral que se establece. El aumento de
la fluorescencia R est relacionado con el
incremento de productos de PCR.
Cuando la sonda est intacta, el fluorocromo TAMRA (Q) absorbe la energa
del fluorocromo FAM (R).
El incremento y la deteccin de la fluorescencia emitida por R slo se observa
si la sonda es complementaria al ADN
blanco y si es degradada. Este alto grado
de especificidad hace que no existan problemas cuando se producen reacciones
inespecficas de PCR en otros sitios del
genoma.
Los requerimientos analticos para la
reaccin son, en algunos pasos, similares
a lo que estamos acostumbrados en una
reaccin tpica de PCR como extraccin
de ADN, la amplificacin por PCR, y la
determinacin del espectro de fluorescencia de las muestras de PCR en tiempo
real, siendo una variante del denominado
PCR cuantitativo.
En resumen los pasos principales seran:
Desnaturalizacin del ADN.
Hibridacin de los cebadores y de la
sonda.
Extensin de la TaqMan y accin exonucleasa.
Degradacin de la sonda con liberacin del extremo 5 y emisin de fluorescencia.

Ventajas y desventajas
de esta tcnica
Principales ventajas

Se necesitan cantidades muy pequeas

de ADN.

No se tiene que realizar en ningn tipo

de soporte (geles de agarosa o acrila-

mida) para obtener el resultado, con lo

cual se minimizan riesgos en el laboratorio al tener que manipular sustancias
cancergenas y/o mutagnicas como el
bromuro de etidio y la acrilamida.
Los ensayos son fciles y rpidos (PCR
en tiempo real donde simultneamente
se va obteniendo el resultado ciclo a
ciclo en el ordenador).
Una vez que el tubo se cierra y
empieza la reaccin de PCR a funcionar no se necesita abrir ms el tubo,
obteniendo el resultado en forma
directa, con lo cual evitamos los riesgos consecuentes de contaminacin
del laboratorio y/o de las muestras
con productos post-amplificacin.
Esta era una de las grandes problemticas de falsos-positivos por contaminacin que podan obtenerse con la
PCR convencional y que esta nueva
tecnologa ha superado.
La experiencias son altamente reproducibles y automatizadas cuando se
optimizan las temperaturas de hibridacin y las concentraciones de ADN.

En el campo de la medicina
veterinaria las aplicaciones
de esta tcnica son mltiples,
e incluyen la deteccin,
diagnstico y cuantificacin
de patgenos virales,
bacterianos, hongos, etc.
Principales desventajas
Se necesita datos de la secuencia de
ADN o de ADN copia para la construccin de los cebadores y de la sonda.
Para esto se recurre a los bancos de
secuencias de cidos nucleicos como el
GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Tambin, se puede recurrir al European
Bioinformatics Institute (EMBL-EBI,
http://www.ebi.ac.uk/embl/).

Aplicaciones en medicina
veterinaria
En medicina veterinaria las aplicaciones
de esta tcnica son mltiples pudindose
resumir en tres grandes campos:
Deteccin, diagnstico y cuantificacin
de patgenos virales, bacterianos, hongos, etc. Como hemos utilizado en nuestro Laboratorio respecto a la deteccin
de Legionella (ver tabla).
Genotipado por discriminacin allica
(deteccin de mutaciones y patologas
puntuales, estudio de polimorfismos de
un solo nucletido o SNP).
Investigacin de expresin de genes
(genes del desarrollo, factores de transcripcin, factores de crecimiento, genes que
intervienen en procesos oncolgicos, etc).
En cuanto al diagnstico de patgenos
uno de los ejemplos actuales ha sido la
deteccin y cuantificacin viral de coronavirus canino en materias fecales de
perros infectados experimentalmente y
naturalmente. En este caso, al ser un
virus ARN existe un paso previo que es
la transcripcin reversa del material
gentico con la enzima retrotranscriptasa para obtener el ADN complementario (ADNc) y, posteriormente, realizar
los ensayos con sonda fluorescente Taqman. La sensibilidad obtenida por esta
tcnica fue significativamente mayor a la
tcnica de PCR convencional (en 78
muestras fecales, los autores obtuvieron
un resultado positivo en 29 de ellas, y 48
con los ensayos de sonda TaqMan)
(Decaro et al., 2004).

1
2
3

Discriminacin allica
(amplificacin
alelo especfica)
Con esta tecnologa se pueden detectar
en forma rpida y certera la presencia de
mutaciones en el genoma, como las
mutaciones puntuales que producen
enfermedades hereditarias en animales
domsticos y los denominados polimorfismos de un solo nucletido (SNP).

Principios del desarrollo de la RT-PCR con sonda Taq-man

Utilizacin de una sonda interna que hibridar

Figura 2. Esquema de la reaccin de PCR con sonda Taq-Man.

sobre el ADN molde (localizada entre los dos cebadores u oligonucletidos) especfica de ADN marcada en ambos extremos con dos fluorocromos
Q
R
distintos, el colorante reporter (R o reporter) en
el extremo 5 y el colorante enmascarador o absorbente (Q o quencher) en el extremo 3
Accin 5-3 nucleasa de la enzima TaqMan que
polimeriza la reaccin
Agregado de grupo fosfato (P) al extremo 3 de
R
la sonda para evitar la extensin de la sonda en la
reaccin de PCR
Q
Cebadores u oligonucletidos que hibridan en
secuencias especficas a ambos lados de la sonda
manteniendo distancias variables en pares de
bases (figura 2)
Los fluorocromos ms utilizados son el FAM (6-carboxifluorescena) como colorante R y el TAMRA (6- Mientras la sonda no es degradada por la TaqMan el fluorocromo Q enmascara al fluorocrocarboxi-tetrametil-rodamina) como colorante Q.
mo R. A medida que se va degradando la sonda comienza a aumentar la flourescencia de R

Actualidad profesional
Figura 3.

Grfica donde se observa las curvas de emisin de fluorescencia

a medida que transcurren los ciclos de PCR en tiempo real.

Algunos ejemplos en medicina veterinaria de patgenos virales y bacterianos

sobre los cuales se aplic la tecnologa del real time PCR para su deteccin
Diagnstico

5000
Intensidad de fluorescencia

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Corynebacterium pseudotuberculosis equino

Mycobacterium aviar
Coronavirus canino
Coronavirus felino
Inmunodeficiencia felina viral
Diarrea vrica bovina
Legionella

4000

3000

Spier et al., 2004.

Tell et al., 2003.
Decaro et al., 2004.
Gut et al., 1999.
Leutenegger et al., 2000a.
Bhudevi y Weinstock., 2001.
Gruas et al., 2005

2000

1000

Fluorocromo R

Fluorocromo Q

Ruido de fondo

La deteccin se basa en la construccin de dos sondas alelo especficas, es

decir una sonda que es especfica para el
alelo normal (salvaje) y una segunda
especfica para el alelo mutante. Ambas
sondas son marcadas con dos fluorocromos distintos.
La sonda se disea de tal forma que la
mutacin puntual quede en la parte
media de la misma. El proceso de hibridacin es altamente especfico de tal
forma que en un individuo homocigtico
normal (sus dos alelos son normales)
slo se producir la unin de la sonda
especfica para dicho alelo y segn el
fluorocromo utilizado se obtendr una
sola seal. En el caso de un individuo
heterocigtico o portador de una enfermedad hereditaria (presencia de un alelo
normal y un alelo mutante) se obtendrn
dos seales fluorescentes procedentes de
la sonda marcada para el alelo normal y
de la sonda para el alelo mutante.

Enfermedades hereditarias
por mutaciones puntuales

Una de las
principales
ventajas de esta
nueva tecnologa es
que los ensayos son
fciles y rpidos, ya
que es una PCR en
tiempo real donde
simultneamente
se va obteniendo
el resultado ciclo
a ciclo en el
ordenador.

Leutenegger (2001) propone un protocolo para el anlisis de la deficiencia leucocitaria bovina (BLAD) mediante discriminacin allica con el sistema TaqMan.
Nosotros hemos tenido experiencia
directa en el diagnstico de esta patologa hereditaria mediante la PCR convencional y vemos con agrado la simplicidad
y economa de la aplicacin del nuevo
sistema en el diagnstico de enfermedades hereditarias por mutaciones puntuales (Llamb y Arruga, 2002). Utilizando
el sistema TaqMan el diagnstico es
directo en una sola reaccin mientras
que con la PCR convencional hay varios
pasos a seguir, como:
Amplificacin del ADN.
Evaluacin en gel de agarosa.
Corte con enzimas de restriccin para
evaluar las variantes allicas (RFLP o
polimorfismo del largo de los fragmentos de restriccin).
Evaluacin y resultado de dicho polimorfismo en un nuevo gel (4 pasos de
la tcnica convencional resumidos en
un solo tubo de reaccin con el sistema
automatizado Taqman).

Anlisis de SNP
(polimorfismo de
un solo nucletido)
Los SNP son variaciones o cambios de un
nucletido a lo largo de todo el genoma
(en humanos se estima que estos polimorfismos ocurren cada 1.000 pares de bases).
En bovinos actualmente se han descubierto unos 600.000 SNP (mapa de SNPs
bovino). La distribucin de stos no es uniforme existiendo regiones del genoma ms
propensas a presentar estos cambios. La
utilidad de estos marcadores es mltiple
debido a que a travs de ellos podemos
determinar qu regiones del genoma contribuyen en la variacin gentica aditiva y
no aditiva en caractersticas de inters econmico en produccin animal.
Con sondas TaqMan se puede realizar
el estudio de SNPs y ver qu combinaciones allicas presentan un reproductor o

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Referencia

una hembra de lite desde el punto de

vista productivo. Igualmente una vez
conocida la secuencia de ADN, se pueden
caracterizar SNPs interespecficos como
hemos utilizado en nuestro laboratorio
para la identificacin de distintas especies
de perdiz (Garca y Arruga, 2005).
Debido a que la distribucin de estos
marcadores no es igual en todos los cromosomas es por lo que uno de los puntos
de inters ha sido el estudio de SNPs en
el cromosoma X bovino.

En vacuno lechero permite

entender los mecanismos de
regulacin de la inmunidad
durante las infecciones de la
glndula mamaria.
Existen en este cromosoma genes que
intervienen en la reproduccin y en la
determinacin sexual como el receptor
de andrgeno (AR), trofina (TRO, codifica para una protena que interviene en
la implantacin embrionaria) o protena
dedos de zinc (ZFX). Mediante el estudio de SNPs en estos genes se puede
detectar el estado de activacin o inactivacin del cromosoma X en hembras y
conocer el modo de herencia de determinadas caractersticas ligadas al sexo
(compensacin de dosis e imprinting
gentico) (Asai, 2004).

Expresin de genes
En cuanto al estudio de expresin gnica,
una de las aplicaciones de inters en medicina veterinaria ha sido el estudio de las
citoquinas (molculas proteicas que intervienen en la regulacin de la diferenciacin celular, comunicacin clulas a clula, proliferacin celular y sistema inmune).
En gatos domsticos, mediante el estudio de la expresin de citoquinas por
PCR cuantitativo con TaqMan, se ha
podido realizar el seguimiento de la
inmunizacin con vacunas para la inmunodeficiencia viral felina (Leutenegger et
al., 2000b). Este tipo de investigacin
tiene importancia en el diseo de planes
de vacunacin con distintas cepas virales
y en epidemiologa veterinaria.
Otra aplicacin de importancia en produccin de ganado lechero es entender
los mecanismos de regulacin de la
inmunidad durante las infecciones de la
glndula mamaria de vacas en produccin. Mediante el sistema TaqMan es
posible seguir los perfiles de citoquinas
(transcripcin de los genes) en clulas
que aparecen en la leche durante la lactacin y definir cuales citoquinas estn
involucradas en los procesos inflamatorios de la glndula mamaria.
Bibliografa en poder de redaccin

* La tecnologa con sonda Taq-man ha

sido implementada por la empresa
Applied Biosystems (ABI) (California,
USA) siendo actualmente uno de los sistemas ms sofisticados.