Ccayac P 062 1

UL
TA
NS
CO
DE
O
NT
ME
DO
CU
"DEBE CONFIRMARSE SU VIGENCIA ANTES DE HACER USO DE STA VERSIN, POR SI HA SIDO MODIFICADA"
COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

COBERTURA
GUA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE MTODOS
DE PRUEBA MICROBIOLGICOS PARA EL ANLISIS DE
ALIMENTOS
VIGENTE A PARTIR DE:
FECHA DE PRXIMA REVISIN:
2012-10-15
2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 2 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
3.1.8. Los microorganismos de prueba debern ser obtenidos colecciones nacionales o

internacionales certificados o en su defecto microorganismos obtenidos a partir de
aislamientos en el mismo laboratorio, siempre que estos estn perfectamente bien
identificados en su identidad, pereza y viabilidad.
DE
CO
NS
UL
TA
3.2. Estrategia para la evaluacin del desempeo del los mtodos de prueba
microbiolgicos.
3.2.1. Para cada mtodo de anlisis que se implemente en el laboratorio, es necesario realizar
la evaluacin del desempeo del mismo, por lo que el laboratorio debe contar con un plan
general o documento maestro de validacin donde se incluya la evaluacin del
desempeo de los mtodos de anlisis microbiolgicos, en el que se debern describir las
estrategias para alcanzar la validacin en las matrices de inters del laboratorio.
3.2.2. Cada evaluacin del desempeo debe documentarse mediante un protocolo, en el que se
deben mencionar los parmetros y mtodos estadsticos utilizados para evaluar el
desempeo de un mtodo microbiolgico, ademas de un Informe de la evaluacin en el
cual se debera incluir la descripcin de las actividades realizadas, la enumeracin de los
materiales, medios, reativos y equipos utilizados, su rastreabilidad y los resultados
obtenidos, la aplicacin de los parametros definidos y la conclucin de la evaluacin del
desempeo.
DO
CU
ME
NT
3.3. Lineamientos
3.3.1. Siguiendo el plan de validacin, cada mtodo de prueba debe evaluarse para demostrar
que es adecuado para el analisis en cada uno de los grupos de alimentos de interes,
evaluando almenos una de las matrices que lo conforman.
3.3.2. Las muestras utilizadas preferentemente deben ser ausentes del microorganismo de
inters, pero no limitarse estos, en la presente gua se describen los criterios para el uso
de muestras no contaminadas.
3.3.3. El uso de muestras naturalmente contaminadas debe describirse en cada protocolo y no
contra decir lo descrito en la presente gua, los criterios estadsticos y las referencias
utilizadas debern incluirse como anexos en el protocolo de validacin.
3.3.4. Para el alacence del este documento se ha propuesto la siguiente clasificacin del
productos de interes sanitario, basada en la experiencia de la RNLSP y lo sealado en la
ISO 16140.
Grupos de
inters
Crnicos
Aves
Tipos de
alimentos
Crudos
Procesados
Congelados
Otros
Crudos
Procesados
Congelados
Otros
Ejemplos de
matriz:
Carne molida
Guisados
Carne
congelada
Pollo
Nugets
Milanesas de pollo
congelado
Productos de la
pesca
Crudos
Procesados
Congelados
Secos
Otros
Moluscos
Pescado
Filete
Camarn
Frutas y
Vegetales
Crudos
Procesados
Congelados
Secos
Otros
Productos
Lcteos
Crudos
Procesados
Congelados
Secos
Otros
Mango
Coctel
Leche
Queso
Leche en polvo

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 3 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
DO
CU
ME
NT
DE
CO
NS
UL
TA
3.3.5. Los criterios de seleccin de una matriz deben estar descritos y justificados en cada
protocolo.
Se debern elegir las matrices representativas que tenga el alcance de la
metodologa a evaluar, una vez elegida, se deben hacer pruebas previas de
ella para conocer su microbiota. Se deber contar con cantidad suficiente de
muestra para hacer todos los anlisis. Las matrices elegidas y su justificacin
deben mencionarse en el protocolo de validacin.
3.3.6. Cuando se indique dos analistas diferentes, deber entenderse como dos analistas
diferentes o un mismo analista en condiciones de trabajo diferentes, por ejemplo, fechas
de anlisis diferentes, lotes de medios de cultivo diferentes etc.
3.3.7. Las cepas empleadas debern proceder de colecciones nacionales o internacionales
certificadas o en su defecto, cepas aisladas en el laboratorio siempre que se demuestre
su identidad, pureza y viabilidad.
3.3.8. Para mtodos cualitativos debern emplearse cepas control negativo y control positivo.
3.3.8.1.
Las cepas control positivo debern ser aquellas de propsito de inters del
mtodo
3.3.8.2.
Las cepas control negativo debern ser aquellas indicadas en el mtodo de
prueba o en su defecto las que puedan mencionarse biota acompaante o que se
puedan considerar como interferentes del microorganismo control positivo.
3.3.9. Para mtodos cuantitativos:
3.3.9.1.
Para los mtodos de grupos microbianos, pueden utilizarse mezclas de
microorganismos.
3.3.9.2.
La verificacin puede realizarse por vaciado en placa utilizando un medio como
agar cuenta estndar para los mtodos cualitativos y el mismo medio que se
describa para cuenta para los mtodos cuantitativos, por ejemplo: Agar Rojo Bilis
Violeta, Agar Baird Parker, etc.
3.3.10. Criterios de Aceptacin
3.3.10.1. Mtodos Cualitativos
Parmetro
Verificacin del tamao del
inoculo
Verificacin de la muestra.
Verificacin del lmite de
deteccin.
Falsos positivos
Criterio de aceptacin Mtodos Cuantitativos

Al verificar el tamao del inoculo por lo menos seis veces en promedio se obtienen cuentas de
menos de 10 UFC* y ninguna de 10 UFC o mas.
Numero de repeticiones: 3
Analistas: uno
Resultados positivos: 0%
Numero de repeticiones: al menos 10 por analista
Analistas: al menos dos
Resultados positivos: al menos el 80 %
Tamao del inoculo: menos de 10 UFC
Numero de repeticiones: al menos 10 por analista
Analistas: al menos dos
Resultados positivos: 100 %
Tamao del inoculo: mas de 100 UFC

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Parmetro
Incertidumbre
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 4 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Criterio de aceptacin Mtodos Cuantitativos

Mencionar las fuentes de incertidumbre asociadas a las mediciones.
* Preferentemente menores o iguales a 5 UFC
DE
Reproducibilidad
Resultado: r < 3
Muestras no contaminadas:
Nmero de repeticiones: por lo menos 10 por
analista
Nmero de analistas: por lo menos 2
Nivel de fortificacin: Al menos 1 (medio)
Clculo:
Resultado: r < 3
Muestras contaminadas:
Nmero de repeticiones: por lo menos 10 por
analista
Nmero de analistas: por lo menos 2
Nivel de fortificacin: no aplica
Clculo:
Resultado: R < 3
Resultado: R < 3
Solo muestras no contaminadas:
Numero de repeticiones: por lo menos 10
Nmero de analistas: uno
Nivel de fortificacin: por lo menos uno (medio)
Clculo:
NT
Recuperacin
NS
Repetibilidad
Criterio de aceptacin Metodos cuantitativos

Muestras no contaminadas:
Muestras naturalmente contaminadas:
Nmero de repeticiones: 10
Nmero de repeticiones: 10
Nivel de fortificacin: Al menos uno (valor medio)
Nivel de fortificacin: no aplica
Clculo:
Clculo:
CO
Parmetro
Mtodos Cuantitativos
UL
TA
3.3.10.2.
DO
CU
ME
Resultado: Entre el 90% y el 110% log

Solo muestras no contaminadas:
Numero de repeticiones: por lo menos 10
Nivel de fortificacin: por lo menos uno (medio)
Clculo:
Sesgo
Resultado:
Incertidumbre
La diferencia absoluta de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log

a) Especificar el mensurando.
b) Identificar las fuentes de incertidumbre.
c) Realizar clculos para la incertidumbre global
4. DESCRIPCIN DE LA ACTIVIDAD.
Etapa
Actividad
Responsable
4.1 Elaboracin Elabora el protocolo, cumpliendo con los requerimientos mnimos Responsable
del protocolo
indicados en el anexo: Elaboracin del protocolo
de
la
validacin

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Hoja: 5 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
UL
TA
Actividad
Responsable
Selecciona la muestra con base en criterios definidos en el plan de Responsable
validacin. Preferentemente muestras no contaminadas.
de
la
Validacin
Se asegura de contar con la cantidad de muestra necesaria para
completar la evaluacin del desempeo.
Verifica la presencia o ausencia del microorganismo(s) de inters
en la muestra.
Realiza los clculos para determinar el tamao del inculo.
Responsable
de
la
Siguiendo un mtodo comnmente utilizado por el laboratorio validacin.
realiza la estandarizacin del inoculo (puede consultarse el anexo
1 de la presente gua como referencia).
CO
4.3 Preparacin
del inoculo
Rev. 1
NS
Etapa
4.2 Seleccin
de la Matriz
Clave: CCAYAC-P-062
DE
Verifica en tres ocasiones distintas la preparacin del inoculo.

Durante la evaluacin del desempeo verifica el inoculo empleado
y lo identifica como valor de referencia.
4.4 Preparacin
de la muestras
NT
Nota: La verificacin del tamao de inoculo debe comprobarse durante la ejecucin del protocolo
para cada suspensin de microorganismos empleada. Dicha verificacin deber realizarse por lo
menos por sextuplicado.
Homogeniza la muestra perfectamente.
ME
Nota: se recomienda que las muestras perecederas sean analizadas de inmediato o en su defecto
mantenerse en refrigeracin.
Responsable
de
la
validacin
DO
CU
Fortificacin de la muestra.
En condiciones aspticas pesa la muestra conforme al mtodo de
prueba he inocula la muestra con el microorganismo de prueba.
Alternativamente puede inocularse la muestra antes de realizar los
sub muestreos, procurando homogenizar perfectamente.
4.5 Ejecucin
del protocolo.
La fortificacin de la muestra debe realizarse conforme se

describe para cada tipo de mtodo.
Siguiendo el mtodo de prueba analiza la muestra el numero de Responsable
veces que corresponde, segn los criterios de aceptacin
de
la
validacin
Ejemplo 1:
Mtodos cualitativos
Se desea validar el mtodo cualitativo para aislamiento de un patgeno; para la verificacin del
lmite de deteccin deber prepararse un inculo de menos de 10 UFC, preferente mente 5 UFC del
microorganismo control positivo y para verificacin de los falsos positivos las muestras debern
inocularse con mas 100 UFC del microorganismos control negativo

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Etapa
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 6 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Actividad
Responsable
Al realizar las pruebas para la preparacin del inoculo control positivo se determina que en la
dilucin 10-7, se obtienen 820 UFC/mL.
UL
TA
El da de la prueba se deber preparar una suspensin de microorganismos de la misma forma que

en las pruebas anteriores y realizar diluciones decimales hasta 10 -9, en teora en esta dilucin
deberan encontrase aproximadamente 8 UFC, a partir de esta dilucin, transferir 0.5 ml a cada una
de las muestras (10), inmediatamente despus de cada inoculo colocar 0.5 ml de la suspensin del
microorganismo en una placa de Petri para realizar la verificacin del inoculo.
NS
Para la verificacin del inculo, incubar en condiciones adecuadas y hacer los clculos para
determinar la cantidad de microorganismos inoculados a la muestra. La prueba es vlida si en
promedio se encuentran menos de 10 UFC, ya que los inculos idealmente deben ser menores de 5
UFC, podran encontrarse cuentas <1 UFC, sin embargo el promedio de todas las placas debe ser
menor de 10UFC y ninguno de los inculos mayor de 10 UFC
CO
Podran obtenerse resultados como:

3, 4, 2, <1, 3, 2, 4, 3, 8, 5
Promedio:3.4 es decir 3 UFC

Por lo tanto se cumple el criterio de verificacin del inoculo.
DE
Para las muestras inoculadas proceder como se indica en el mtodo de prueba. Registrar los
resultados de ausencia y presencia.
Supongamos que para la verificacin de limite de deteccin se obtienen los siguientes resultados:
Ausencia 1
Presencia 9
NT
Puede concluirse que se cumple el criterio de aceptacin del limite de deteccin, ya que el 90 % los
resultados tiene resultado esperado.
Para las muestras inoculadas con la cepa control negativo, debera obtenerse que
ME
Ausencia 10
Presencia 0
Por lo que puede concluirse que se cumple el criterio.
DO
CU
Al mismo tiempo que se analizaron las muestras inoculadas deber analizarse por lo menos por
triplicado la muestra si en ninguna de las muestras se confirma la ausencia del microorganismo de
inters se puede concluir que no hay interferencia y por lo tanto se cumple el criterio de verificacin
de la muestra.
Ejemplo 2:
Mtodos cuantitativos
Para la preparacin del inoculo se debe usar por lo menos pero no limitado un nivel de fortificacin,
para fines de clculo es necesario considerar el valor medio del intervalo de lectura. Cuando el
mtodo de prueba indica que se deben contar cajas con cuentas entre 25 y 250 UFC, el valor medio
(realizando la linerizacin de la variable mediante el uso de logatimo) es de 79 UFC.
Por lo anterior, en las placas de lectura deberan encontrarse aproximadamente 80 UFC, si cada
placa se inocula con un mL, entonces deben inculcarse 80 UFC/ml, digamos de la dilucin 10 -2, asi
que en la dilucin 10-1 debera haber 800 UFC, si se utilizan muestras de 25 g entonces cada
muestra debera inocularse con 20 000 UFC
Nota: Todos los inculos deben ser verificados utilizando la tcnica de vaciado en placa, empleando
para el clculo 6 cajas.

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Etapa
4.6 Clculos.
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 7 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Actividad
Mtodos cuantitativos
Responsable
Repetibiliad
Calcular las unidades formadoras de colonias en cada repeticin y calcular el log.
Placa 1
Placa 2
Promedio
Cuenta
log
Repeticin 1
Repeticin 2
Repeticin 3
Repeticin 4
Repeticin 5
Repeticin 6
Repeticin 7
Repeticin 8
Repeticin 9
70
71
80
76
78
77
56
87
77
90
91
80
82
82
88
80
80
86
80
81
80
79
80
83
68
84
82
8000
8100
8000
7900
8000
8300
6800
8400
8200
3.90
3.91
3.90
3.90
3.90
3.92
3.83
3.92
3.91
NS
UL
TA
Repeticin
RSD =
CO
Calcular la desviacin estndar relativa, como el cociente de la desviacin estndar sobre la media.
s
x
0.03
3.90
0.007
10
1%
NT
Desviacin estndar
Promedio
DSR
n
r
DE
Calcular el valor de r
ME
Reproducibilidad
DO
CU
Utilizando el mtodo de referencia, al menos dos analistas en momentos diferentes procedern

como se describi antes, considerando la aplicacin de la siguiente formula.
Recuperacin
Con los datos obtenidos en repetibilidad en muestras fortificadas calcular la cantidad de UFC, en
cada repeticin y calcular el logaritmo de cada cuenta, promediar los logaritmos. Calcular el
logaritmo del inculo verificado.
Sesgo
Finalmente calcular el % de recuperacin

% Recuperacin= Media de la cuenta de logaritmo de las cuentas x100
Logaritmo de las UFC inoculadas
A partir de los clculos de recuperacin, calcular la diferencia de la media de los logaritmos de las
cuentas menos el logaritmo del inculo utilizado.
Donde:
Ve= valor esperado
Vo= valor obtenido

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Rev. 1
Hoja: 8 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Actividad
Para mtodos cualitativos menciona las fuentes de incertidumbre
Distribucin de los microorganismos en la muestra;
Efecto de la matriz;
Personal operativo;
Mediciones (pesada o medicin de la muestra);
Diluciones y volmenes;
Homogeneizacin;
Calidad de los medios;
Tiempo hasta la inoculacin;
Temperatura de incubacin;
Responsable
Responsable
de
la
validacin.
NS
UL
TA
Etapa
4.7 Definicin
de la
incertidumbre
Clave: CCAYAC-P-062
ME
NT
DE
CO
Para mtodos cuantitativos mencionar las fuentes de

incertidumbre, adems considerar que:
La Naturaleza de los Mtodos Microbiolgicos de Recuento
Dado el carcter de los ensayos microbiolgicos, mtodos
empricos, donde es difcil construir un modelo apropiado que
permita cuantificar las contribuciones de cada paso a la
incertidumbre del proceso de medida y, la poca disponibilidad de
materiales de referencia certificados que representen al
microorganismo en su hbitat natural, el consenso actual sobre la
estimacin de la incertidumbre en los ensayos microbiolgicos
cuantitativos es que la precisin es el componente ms importante
y el nico que puede determinarse de una manera prctica,
mediante la utilizacin de datos experimentales.
DO
CU
Un Mtodo emprico:
Es un mtodo que determina un valor al que slo se puede llegar
en trminos del mtodo en cuestin y que, por definicin, sirve
como el nico mtodo para establecer el valor aceptado del
parmetro medido (AOAC).
Un mtodo de ensayo diferente (a menudo para el mismo analito)
puede dar un resultado diferente, dado que el mensurando se
define en los trminos del mtodo. Por esta razn, en los mtodos
microbiolgicos cuantitativos, el sesgo o bia n c ntribuy a la
incertidumbre del mtodo, dado que los resultados dependen de
las condiciones definidas en el mtodo, tales como, la temperatura
y tiempo de incubacin, los medios de cultivo, etc.
A partir de muestras naturalmente contaminadas o inoculadas.
Dos analistas, analizan simultneamente 10 muestras, y se realiza
el siguiente calculo.

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Etapa
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 9 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Actividad
Responsable
DE
CO
NS
UL
TA
Donde
yij :son los datos transformados a logaritmo, en log10 (ufc / g) o log10 (ufc / ml);
i :es el ndice de la muestra, i = 1 a n (n > 10);
j :es el ndice de la condicin de reproducibilidad, j = A o B.
NT
La incertidumbre expandida U tal como se define por GUM, se

deriva de la incertidumbre estndar combinada uc(y), con un factor
de cobertura k elegido en esta Especificacin Tcnica como un
valor de 2 (como para corresponder aproximadamente a un nivel
de confianza del 95%):
ME
U = 2uc(y) = 2 sR
Elabora informe conforme a lo descrito en el anexo: Elaboracin

del Informe
DO
CU
4.8 Elaboracin
del informe
Responsable
de
la
validacin

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 10 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Diagrama de flujo
Etapa
Inicio
.
Elabora el protocolo.
.
Selecciona la muestra
Se asegura de contar
con la cantidad
de muestra necesaria
Verifica la presencia o ausencia

del microorganismo(s)
de inters en la muestra
Realiza los clculos

para el inoculo
Estandariza inoculo
Verifica el inoculo por triplicado .
Registra como valor de

referencia.
Homogeniza la muestra
Perfectamente
.
Fortifica la Muestra
Analizar la muestra
.
Repetir segn criterios
Realiza los clculos para:
Mtodos Cuantitativos:
Repetibilidad, Reproducibilidad,
Recuperacin y Sesgo
Verifica el inoculo por triplicado .
Registra como valor de

referencia.
Mtodos cualitativos:
Menciona fuentes
de incertidumbre.
Mtodos Cualitativos
Determina Incertidumbre
expandida:
Elabora informe
.
FIN
DE
4.3 Preparacin del inoculo
CO
NS
4.2 Seleccin de la Matriz
UL
TA
4.1 Elaboracin del protocolo
Responsable de la valiacin
NT
4.4 Preparacin de la muestras
DO
CU
ME
4.5 Ejecucin del protocolo.
4.6 Clculos.
4.7 Definicin de la incertidumbre
4.8 Elaboracin del informe

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 11 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Glosario.
Analito: Componente medido por el mtodo de anlisis, puede ser un microorganismo o un grupo
microbiano. Microorganismo de prueba.
UL
TA
Blanco: Es el alimento usado como matriz, en el que no est el analito de inters.
Coeficiente de Variacin (CV): Es la relacin entre la desviacin estndar y la media multiplicada

por 100.
NS
CO
CV= 100
x
DE
Exactitud relativa recuperacin:

Es la aproximacin entre un resultado de la prueba y el valor de referencia aceptado. Para el
propsito de esta gua, es la cantidad de microorganismo recuperado entre la cantidad de
microorganismo inoculado o nivel de fortificacin.
NT
Fase estacionaria.- Es el intervalo de tiempo en donde la curva de crecimiento microbiana se

hace constante y antecede a la muerte microbiana. En esta etapa se puede conocer con cierta
seguridad y durante un lapso corto de tiempo la concentracin microbiana.
ME
Fortificacin de la muestra. Inoculacin de una cantidad conocida del o los microorganismos de

prueba.
DO
CU
Incertidumbre de medida: Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que caracteriza la

dispersin de los valores que podran ser razonablemente atribuidos al mesurando.
Intervalo de trabajo: Intervalo comprendido entre las concentraciones superior e inferior, en el
cual el analito puede cuantificarse con un nivel satisfactorio de repetibilidad y recuperacin.
Lmite de deteccin: Es el numero ms pequeo de microorganismos en una muestra que puede
ser detectado bajo las condiciones de anlisis. El limite microbiolgico de una prueba determina la
presencia o ausencia de microorganismos por ejemplo ausencia de Salmonella spp. en 25 g de
muestra.
Matriz: Es la muestra de alimento en la que potencialmente se encuentra el analito.
Mtodo Normalizado: Proceso de medicin robusto donde pequeas variaciones en el
procedimiento no deben producir de forma imprevista grandes variaciones en los resultados.
Mtodos internacionalmente aceptados y validados.

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 12 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Nivel de fortificacin o tamao del inculo: Es la cantidad conocida de microorganismos

inoculados a una muestra.
UL
TA
Protocolo para la evaluacin del desempeo: Documento que describe los pasos a seguir
durante la evaluacin del desempeo de un mtodo analtico microbiolgico, cuyo fundamento se
encuentra descrito en el presente documento.
NS
Resultado Aberrante: Corresponde a cualquier valor extremo que ocurra durante la ejecucin de
la prueba. En menos de 1% de las pruebas esos resultados pueden ocurrir aleatoriamente en
situaciones normales.
DE
CO
Evaluacin del desempeo: Es el proceso que realiza un laboratorio para demostrar que un
mtodo normalizado produce consistentemente resultados confiables en las condiciones
particulares del laboratorio. Confirmacin mediante la aportacin de evidencia objetiva de que un
mtodo analtico validado internacionalmente cumple con su propsito en las condiciones
particulares del laboratorio donde se realiza el anlisis.
NT
Repetibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analticos individuales obtenidos

por la aplicacin de un mismo procedimiento analtico, a diferentes porciones de la misma matriz,
en las mismas condiciones de anlisis (analista, equipamientos, laboratorio) en intervalos cortos
de tiempo.
Documentos de referencia.
DO
CU
ME
Reproducibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analticos individuales

obtenidos por la aplicacin de un mismo procedimiento analtico, a diferentes porciones de la
misma matriz, realizadas bajo distintas condiciones de medicin (personal) y en diferentes
tiempos (o a intervalos de tiempos ms largos).
Documento
Criterios de aplicacin de la norma 17025 de la EMA
USP 32, <1223> Validation of Alternative Microbiological Methods.
USP 32, <1225> Validation of Compendial Procedures
USP 32, <1227> Validation of Microbiological Recovery from Pharmacopeical
Articles
Dulce Toccheto S. Curso-terico-prctico Validacin de Mtodos Microbiolgicos
bajo un Sistema de Aseguramiento de la Calidad. Santa Cruz de la Sierra Bolivia.
Proyecto TCC/ Bolivia-Mxico. 2007.
European Cooperation for Accreditation EA-04/10 Accreditation for Microbiological
laboratories. 2002.
Cdigo
No aplica
No aplica
No aplica
No aplica
No aplica
No aplica

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Rev. 1
Hoja: 13 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
Cdigo
No aplica
No aplica
Registros:
Tiempo de
conservacin
ME
Registro
NT
Responsable de
conservarlo
Permanente
Cada Laboratorio
Informes
Permanente
Cada Laboratorio
Generados por la
evaluacin del desempeo.
Permanente
Cada Laboratorio
DO
CU
Protocolo
No aplica
No aplica
No aplica
No aplica
No aplica
DE
CO
NS
UL
TA
Documento
G.A. Leotta, I. Chinen. Validacin de una tcnica de PCR mltiple para la deteccin
de Escherichia coli productor de toxina shiga. Revista Argentina de Microbiologa.
Vol.37, No. 1 2005.
Gua de Validacin de Mtodos Analticos. Colegio Nacional de Qumicos
Farmacuticos Bilogos de Mxico, A.C. Edicin 2002.
ISO/IEC. 2003. International Standard ISO 16140:2003 (E). Microbiology of food
and animal feeding stuffs Protocol for the validation of alternative methods. First
Edition.
ISO/TR 13843:2000 - Water Quality Guidance on Validation of Microbiological
methods. First Edition.
ISO 17994:2004 Water QualityCriteria for Establishing Equivalence between
Microbiological methods. First Edition.
The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method
Validation and Related Topics. Eurachem Guide. 1998. Disponible en
http://www.eurachem.org/guides/pdf/valid.pdf (febrero 2011)
Philip Feldsine, Carlos Abeyta, Wallace H. Andrews. AOAC International Methods
Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food
Microbiological Official Methods of Analysis. 2002. Disponible en
http://www.aoac.org/vmeth/omamanual/Microbiology-Guidelines-Appendix-X.pdf (febrero 2011)
Clave: CCAYAC-P-062
Cdigo de registro e
identificacin nica
CCAYAC-PV-Nmero
asignado por GGC
CCAYAC-IV-Nmero
asignado por GGC
No aplica
Anexos
9.2 Elaboracin del informe
9.3 Anexo Informativo: Preparacin y ajuste del inculo
9.4 Gua Informativa para la fortificacin de una matriz.

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 14 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28

Estructura para el protocolo para la evaluacin del desempeo de mtodos de anlisis microbiolgicos:
Protocolo para la evaluacin del desempeo del mtodo: el nombre y clave
del mtodo que se pretende evaluar.
Considerar los parmetros de desempeo a evaluar y el analito a
determinar
Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplica la validacin
Elaborar un diagrama de flujo del mtodo en cuestin
Mencionar el equipo a utilizar y las condiciones que requiere (verificacin
y/o calibracin, si aplica)
Indicar los materiales a utilizar
a) Indicar el nombre de los reactivos a utilizar y su grado.
b) Indicar los medios de cultivo a utilizar
c) Indicar las cepas que se usaran y la forma de preparar los inculos
2. Campo de aplicacin
3. Mtodo de ensayo
4. Equipo
5. Materiales
6. Reactivos y Medios de
Cultivo
CO
1.Objetivo
NS
UL
TA
Ttulo
DE
Indicar las caractersticas, forma de almacenamiento y cantidades de

muestra estimadas para llevar a cabo la validacin.
Detallar la preparacin de los blancos de muestra o muestras adicionadas.
8. Desarrollo
Detallar las instrucciones para cada uno de los parmetros de desempeo
experimental
a ensayar.
9. Resultados
Formato para el registro de resultados
Establecer para cada parmetro de desempeo la herramienta estadstica
10. Anlisis estadstico
a utilizar para su evaluacin.
11. Criterios de
Establecer los criterios de aceptacin que deben cumplirse con su
aceptacin
respectiva referencia bibliogrfica.
Nota: El protocolo debe incluir firmas de quien elabor, revis y aprob.
DO
CU
ME
NT
7. Muestras

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 15 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
9.2 Elaboracin del Informe

Estructura del informe de evaluacin del desempeo:
4. Equipo
5. Materiales
6. Reactivos y Medios de
cultivo
Indicar las caractersticas, forma de almacenamiento, marca, presentacin,

caducidad y cantidades de muestra utilizadas para llevar a cabo la
validacin.
Detallar la preparacin de los blancos de muestra o muestras adicionadas
utilizadas.
DE
7. Muestras
Incluir el diagrama de flujo del mtodo.
NT
8. Mtodo de ensayo
Detallar como se llevaron a cabo los ensayos de cada uno de los

parmetros de desempeo.
Presentacin de resultados en forma de tablas, sealando fechas de inicio
10. Resultados
y trmino, analistas, laboratorio, microorganismo(s) de prueba, matriz,
unidades y clave de bitcora o registro primario
Presentar en forma de tabla los criterios de aceptacin considerados y los
11. Anlisis de resultados
resultados obtenidos y hacer las observaciones correspondientes.
Efectuar una conclusin final en donde se seale que el mtodo se ajusta al
12. Conclusin
uso propuesto (Numeral 5.4.3 17025)
13. Bibliografa
Referencias utilizadas.
Los que aplique:
Registros primarios,
Bases de datos utilizadas
Certificados de equipos,
14. Anexos
Medios de cultivo
Cepas
Formatos de verificacin,
Grficos de control, etc.
Nota: El informe de resultados debe incluir firmas de quien elabor, revis y aprob.
DO
CU
ME
9. Desarrollo
experimental
UL
TA
2. Campo de aplicacin
NS
1.Objetivo
Informe de resultados de la evaluacin del desempeo del mtodo: el

nombre y clave del mtodo que se evalo.
Considerar los parmetros de desempeo evaluados y el analito
determinado.
Indicar el tipo de producto (s) para los cuales aplic la validacin
Listado
de
los
equipos
utilizados
y su
estado
de
calibracin/verificacin/mantenimiento
Listado de los materiales utilizados.
Listar los reactivos y medios utilizados y su estado de calidad.
CO
Ttulo

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 16 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
9.3 Anexo Informativo: Preparacin y ajuste del inculo.

Este procedimiento es general y adecuado para la mayora de los microorganismos de prueba, pueden
aplicarse variaciones en este, siempre que se obtengan inculos constantes.
NS
UL
TA
Inocular una colonia tomada a partir de un cultivo puro del microorganismo de prueba en 9ml de caldo
BHI o cualquier otro caldo de enriquecimiento, incubar a 35C +/- 2C, por 22h a 24h, (este tiempo
puede ser diferente dependiendo de la experiencia en el laboratorio y el tipo de microorganismo del que
se trate) del cultivo transferir un mililitro a 90ml de BHI e incubar a 35C +/- 2C, por 22h a 24h, a partir
del cultivo hacer diluciones decimales, de cada una de ellas transferir por duplicado un mililitro a cajas
de Petri y adicionar agar cuenta estndar, incubar a 35C +/- 2C, por 18h a 24h, realizar el conteo en
cada dilucin para conocer la concentracin de microorganismos.
DE
CO
Registrar los resultados indicando la concentracin de microorganismos en cada dilucin. Estos

resultados servirn de referencia para la estimacin de la dilucin adecuada a utilizar durante la
fortificacin de las muestras en la evaluacin del desempeo del mtodo de prueba.
Antes de cada prueba deber repetirse la preparacin del inculo de forma idntica que en la
determinacin de concentracin de la cuenta bacteriana en la fase estacionaria y cada inculo deber
ser verificado por vaciado en placa utilizado al menos dos cajas.
DO
CU
ME
NT
Nota 1: Con la prueba previa de fase estacionaria se fija el tiempo de incubacin, volumen necesario que lleve la concentracin
microbiana, para fortificar cada una de las alcuotas de acuerdo al protocolo de evaluacin de desempeo del mtodo en particular.
Durante su manipulacin se recomienda sumergir el recipiente que contiene la FE en agua fra.
Nota 2: Cuando la matriz sea slida, fortificar las alcuotas. Si es lquida se puede fortificar la matriz completa o las alcuotas.

COBERTURA
ALIMENTOS
2012-10-15
2015-10-15
Clave: CCAYAC-P-062
Rev. 1
Hoja: 17 de 17
SUBSTITUYE A:
CCAYAC-P-062
DE
FECHA 2011-03-28
9.4 Gua Informativa para la fortificacin de una matriz

La fortificacin de muestras se hace por medio de la adicin de diluciones conocidas del
microorganismo a prueba, a partir de un inoculo conocido, en la matriz en cuestin, como sigue:
UL
TA
Estimacin de la dilucin de trabajo

A partir de un cultivo del microorganismo de inters en BHI (o cualquier otro medio de enriquecimiento).
Hacer diluciones decimales hasta 10-9 en agua peptonada amortiguada al 0.1%; o el diluyente que
utilice el laboratorio.
NS
Hacer recuento por triplicado de las diluciones, 10-6, 10-7, 10-8 y 10-9 en agar soya tripticaseina o Agar
cuenta estndar.
DE
CO
Realizar las lecturas y clculos de los nmeros de clulas en cada una de las diluciones para establecer
la dilucin que ser usada en la fortificacin de la matriz y registrar los resultados de los recuentos y
clculo.
DO
CU
ME
NT
Preparacin del Inculo

Preparar un nuevo cultivo en caldo BHI, preparar las diluciones necesarias con base en los resultados
obtenidos en la estimacin de la dilucin de trabajo, verificar la concentracin del inculo por
sextuplicado.
COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE COBERTURA

CONTROL DE CAMBIOS DE DOCUMENTOS DEL SISTEMA DE
GESTIN DE LA CALIDAD
Revisin No:
CLAVE:
1
Fecha de emisin:
2012-10-15
GUIA PARA LA EVALUACIN DEL DESEMPEO DE

MTODOS DE PRUEBA MICROBIOLGICOS PARA EL
ANALISIS DE ALIMENTOS
PGINA
REVISIN: 0
NUMERAL O
PRRAFO
Todo el
documento
CLAVE:
CAMBIOS:
Se especifica el alcance a alimentos
Titulo
CCAYAC-P-062
UL
TA
FECHA: 2011-03-28
CCAYAC-P-062
NS
Se organizo toda la informacin, para cumplimiento del nuevo formato

de procedimientos.
Todo el
documento
CO
De 1 a 17
Se modifican los criterios de aceptacin:

Se reduce el nmero de repeticiones para mtodos cualitativos y se
incluye el uso de cepas control positivo y negativo.
DE
Se eliminan los anexos informativos de formatos y guas para hojas de

calculo.
DO
CU
ME
NT
1/17
Se incluyen los clculos para incertidumbre de mtodos cuantitativos.

Se especifica el alcance a alimentos y agua.
Cambio de redaccin.
CCAYAC-F-001/3

Ccayac P 062 1

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UL

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

3.1.8. Los microorganismos de prueba debern ser obtenidos colecciones nacionales o

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

Criterio de aceptacin Mtodos Cuantitativos

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

Criterio de aceptacin Mtodos Cuantitativos

* Preferentemente menores o iguales a 5 UFC

Criterio de aceptacin Metodos cuantitativos

Resultado: Entre el 90% y el 110% log

La diferencia absoluta de lo recuperado y lo inoculado es < 0.3 log

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

Verifica en tres ocasiones distintas la preparacin del inoculo.

Homogeniza la muestra perfectamente.

La fortificacin de la muestra debe realizarse conforme se

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

El da de la prueba se deber preparar una suspensin de microorganismos de la misma forma que

Podran obtenerse resultados como:

Promedio:3.4 es decir 3 UFC

Por lo que puede concluirse que se cumple el criterio.

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

Utilizando el mtodo de referencia, al menos dos analistas en momentos diferentes procedern

Finalmente calcular el % de recuperacin

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

Para mtodos cuantitativos mencionar las fuentes de

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

La incertidumbre expandida U tal como se define por GUM, se

Elabora informe conforme a lo descrito en el anexo: Elaboracin

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

Verifica la presencia o ausencia

Realiza los clculos

Verifica el inoculo por triplicado .

Registra como valor de

Repetir segn criterios

Realiza los clculos para:

Verifica el inoculo por triplicado .

Registra como valor de

4.3 Preparacin del inoculo

4.2 Seleccin de la Matriz

4.1 Elaboracin del protocolo

4.4 Preparacin de la muestras

4.5 Ejecucin del protocolo.

4.7 Definicin de la incertidumbre

4.8 Elaboracin del informe

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

Blanco: Es el alimento usado como matriz, en el que no est el analito de inters.

Coeficiente de Variacin (CV): Es la relacin entre la desviacin estndar y la media multiplicada

Exactitud relativa recuperacin:

Fase estacionaria.- Es el intervalo de tiempo en donde la curva de crecimiento microbiana se

Fortificacin de la muestra. Inoculacin de una cantidad conocida del o los microorganismos de

Incertidumbre de medida: Parmetro, asociado al resultado de una medicin, que caracteriza la

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

Nivel de fortificacin o tamao del inculo: Es la cantidad conocida de microorganismos

Repetibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analticos individuales obtenidos

Reproducibilidad: Es el grado de concordancia entre los resultados analticos individuales

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

9.1 Elaboracin del protocolo

Indicar las caractersticas, forma de almacenamiento y cantidades de

COMISIN DE CONTROL ANALTICO Y AMPLIACIN DE

9.2 Elaboracin del Informe

Indicar las caractersticas, forma de almacenamiento, marca, presentacin,

Incluir el diagrama de flujo del mtodo.