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Pruebas de sensibilidad microbiana

Magdalena Lizbeth Sailema Ortiz


Laboratorio de Microbiologa Industrial, Facultad de Ciencia e
Ingeniera en Alimentos, Universidad Tcnica de Ambato.
Resumen
Los antibiogramas permiten susceptibilidad de una cepa bacteriana a varios antimicrobianos que son
opciones de tratamiento para ese agente infeccioso.
Se realiz la evaluacin de la actividad inhibitoria del crecimiento que ejercen los aceites esenciales sobre
la Escherichia coli. La actividad antimicrobiana se determin mediante la prueba de difusin en disco, en
las cajas Petri de medio de cultivo E.C Agar (Merck, Alemania). Los aceites esenciales inhiben el
crecimiento microbiano, sin embargo aceites de naranja y de jengibre no inhiben el crecimiento de la
Escherichia coli. Mientras que el sulfato de estreptomicina

present una actividad antibacteriana

marcada, observndose una inhibicin del crecimiento bacteriano de la Escherichia coli. El halo de
inhibicin fue de 1 centmetro. Y se calcul el porcentaje de inhibicin del crecimiento el cual fue de
4,94% cuando se us el sulfato de estreptomicina el cual se evidenci a las 24 horas de incubacin.
Introduccin
Los aceites esenciales derivados de palntas son conocidas por su elevada actividad antimicrobiana contra
un amplio rango de bacterias y hongos, ademas de potenciar la actividad antioxidante de los propios
productos tratados (Ayala-Zavala et al., 2005)
Los antibiticos se definen como sustancias producidas por diversas especies de microorganismos
(bacterias, hongos, actinomicetos) que suprimen la proliferacin

de grmenes y al final pueden

destruirlos.
La eleccin del medio adecuado es un factor importante para garantizar la reproduccin en los anlisis
realizados.
Debido a que es imposible predecir la susceptibilidad de una bacteria responsable de una determinada
infeccin a los antimicrobianos, las Prueba de Sensibilidad Antimicrobiana efectuadas en el laboratorio

microbiolgico se convierten en un instrumento esencial para el manejo teraputico de los pacientes


(Forbes, 2009).
El estudio de la sensibilidad a los agentes antimicrobianos se basa siempre en someter a un determinado
nmero de microorganismos procedentes de un mismo inoculo a la accin de varias concentraciones de
antimicrobianos, dejar incubar en condiciones adecuadas y observar la existencia de crecimiento.
Es importante considerar que la concentracin mnima inhibitoria va a medir la capacidad de un agente
antimicrobiano para inhibir la multiplicacin de los microorganismos, pero si se elimina el antibitico el
microorganismo va a seguir creciendo (Garca, 2004).
Con los datos preliminares aqu expuestos, es necesario apuntar que el objetivo del presente escrito es
determinar la presencia o ausencia de actividad antimicrobiana de los aceites esenciales de naranja y
jengibre sobre la Escherichia coli.
Material y mtodos
Se prepar dos cajas de medios de cultivos E.C Agar (Merck, Alemania), se seleccion antibiticos tales
como aceites esenciales de naranja, jengibre y sulfato de estreptomicina, se prepar una suspensin de
Escherichia Coli de 1/105 - 1/106, se procedi a colocar 100l (micro litros ) de la suspensin en la caja de
cultivo y se lo difundi uniformemente sobre las placas, se dej secar por algunos minutos y con la ayuda
de unas pinzas se procedi a colocar los discos de papel en las cajas, cuatro discos de papel
previamente esterilizados en cada caja separados uniformemente y a continuacin se dispers los
antibiticos elegidos 20l (micro litros) de cada uno respectivamente sobre el disco el primer disco se
tom como control, en el segundo se agreg aceite esencial de naranja, el tercer aceite esencial de
jengibre y el cuatro sulfato de estreptomicina, la cajas se las colocaron en la incubadora (Memmert,
Alemania) a 37C, pasadas las 48 horas se midi el dimetro del halo de inhibicin.
Resultados
La difusin en disco hace referencia a la difusin que experimenta un agente antimicrobiano en este caso
es el sulfato de estreptomicina una determinada concentracin a partir de discos de papel que se
depositaron en un medio de cultivo E.C Agar (Merck, Alemania), que ha sido sembrado. El mtodo de
difusin en disco se basa en la determinacin de una zona de inhibicin del crecimiento que es
proporcional a la sensibilidad de la bacteria frente al antimicrobiano presente en el disco.
En esta prctica se trat ver si los aceites esenciales presentan alguna accin antimicrobiana ante la
presencia de la Escherichia coli, Utilizando aceites esenciales de naranja y de jengibre. Sin embargo

estos aceites no inhibieron el crecimiento de la Escherichia coli, ya que el crecimiento de la bacteria


sigue su curso alrededor de los discos.
Los componentes de los aceites esenciales, bsicamente timol, carvacrol y eugenol, son compuestos
fenlicos que poseen fuertes propiedades antimicrobianas contra diversos microrganismos. Por lo tanto
su mecanismo de accin es muy similar a otros compuestos fenlicos provocando un desorden en la
membrana citoplasmtica debido a que el carvacrol y timol. En la Escherichia coli el carvacrol y el timol
desintegra la membrana externa de esta, permitiendo la fuga de iones fosfato y provocando problemas
de permeabilidad de la membrana, conduciendo finalmente a la muerte del microorganismo (Lambert et
al, 2001).
En la Figura 1 se puede ver como el nico que presenta inhibicin ante esta bacteria es el cuarto disco,
por lo tanto el nico antibitico eficaz ante la inhibicin bacteriana es el sulfato de estreptomicina. El
disco 1, sirvi de control, se puede ver que el crecimiento microbiano no es inhibido al igual que en los
discos 2 y 3 los cuales tienen aceites esenciales de naranja y jengibre respectivamente.

Figura1. Inhibicin del sulfato de estreptomicina (discos 4) y actividad no inhibitoria de los aceites esenciales de nara

El aceite esencial de naranja presenta los siguientes componentes qumicos: limoneno, -linalol, decanal,
2(10)-pineno,(1S,5S)-, mientras que el aceite esencial de jengibre tiene: sesquiterpenos (camfero, dfelandreno, zingibereno), alcoholes sesquiterpnicos (isoborneol-linalol), y terpenos, con citrol y resinas
(Ryman, 1994). Por lo tanto comparando la composicin qumica entre los aceites que se utiliz ninguno
de ellos presenta grupos fenoles que contengan timol o a su vez carvacrol, por lo tanto estos aceites no
son inhibidores microbianos. Debido a la ausencia de timol y el carvacrol en su estructura qumica no
pudieron inhibir el crecimiento de las bacterias como es el caso de la Escherichia coli.
La estreptomicina que se utiliz para inhibir el crecimiento de la Escherichia coli actu en ella cuando
penetra la pared y la membrana celular de las bacterias, se fija a la subunidad menor de los ribosomas
de esta por lo tanto no deja que se forme el complejo de iniciacin durante la fabricacin de protenas de
las bacterias, por lo tanto la bacteria no puede crecer y muere.

La inhibicin microbiana se puede ver cuando alrededor de los discos se forma halos de inhibicin. En la
Tabla 1 se pudo observar que el halo formado por la inhibicin bacteria alrededor del disco es de 1
centmetro cuando se utiliza el sulfato de estreptomicina.
Tabla 1 Presencia de la actividad antimicrobiana y tamao de halo inhibitorio.

Inhibicin
Parmetros

Aceite esencial

Aceite esencial

Sulfato de

de naranja

de jengibre

estreptomicina

No

No

No

Si

----

----

----

1 cm

Control

Presencia de
inhibicin
Tamao del halo

Cuanto mayor es la zona de inhibicin, menor es la concentracin del antimicrobiano que se requiere para
inhibir el crecimiento de la Escherichia coli. El porcentaje de inhibicin con respecto al rea de la placa de
agar fue del 4.94%. No obstante, esto depende tambin de la concentracin del antibitico en el disco y
de su capacidad de difusin.
Clculo la zona de inhibicin.

Area caja = r 2
Area caja= ( 45 mm )

6361,725 mm2

314,159 mm2
2

Area caja=6361,725 mm
Area halo = r 2

100%
x

X= 4,94% de inhibicin con el sulfato de


estreptomicina

Area halo = ( 10 mm )2
Area halo =314,159 mm2
Los resultados obtenidos en el presente estudio evalundo la capacidad antimicrobiana de aceites
esenciales de naranja y jengibre frente a Escherichia coli coinciden con los resultados obtenidos por
Jurez et al., (2010) & Vsquez et al., (2001) pues no presentan actividad microbiana contra Escherichia
coli, cuando trabajaron con aceites esenciales de naranja y jengibre respectivamente.

Cuestionario
Cul es la importancia de los ensayos antimicrobianos?
Las pruebas de susceptibilidad son tambin importantes en estudios epidemiolgicos de resistencia y en
estudios de nuevos agentes antimicrobianos (Prat, 2014).
Qu ventajas presenta la tcnica de difusin en disco frente a otros mtodos?

Bajo coste
Facilidad para modificar los discos con los antimicrobianos de prueba cuando as se requiera.
Se puede utilizar como una prueba de deteccin frente a gran nmero de aislamientos.
Se puede identificar a un subconjunto de aislamientos para pruebas posteriores por otros
mtodos, como la determinacin de las concentraciones mnimas inhibitorias (Forbes, 2009).

Cul es el mecanismo de accin antimicrobiano de los aceites esenciales y del antibitico


utilizado?
El mecanismo de accin antibacteriano de los aceites esenciales est relacionada con la ruptura de la
pared celular e inhibicin de las enzimas bacterianas, provocando la muerte bacteriana. Tiene la ventaja
de mantener su actividad en presencia de materia orgnica (Enrile, 2009).
La estreptomicina al penetrar la pared y la membrana celular de las bacterias, se fija a la subunidad
menor de los ribosomas de esta, conocida como la subunidad 30S y no deja que se forme el complejo de
iniciacin durante la fabricacin de protenas de las bacterias (Pardo, 2008).
Qu compuestos presentes en los aceites esenciales utilizados son responsables de la actividad
antimicrobiana?
En el aceite esencial se ha identificado los siguientes compuestos: Monoterpenos: geranil, mentol, ocinemi, -felandreno, dipenteno, y -pineno, tagenona; Flavoides ; comferitrin, camferol y su
ramnsido.; Sesquiterpenos: limoneno, linalol y su acetato (Osuna, 2005)
Indique otros mtodos o tcnicas que pueden ser utilizados para evaluar la actividad
antimicrobiana de un compuesto.
Tcnica de dilucin en tubo. En el mtodo de dilucin en tubo se utilizan una serie de tubos que
contienen un medio de cultivo estril y varias concentraciones de cada uno de los antibiticos que se van
a ensayar. Todos los tubos se inoculan con el microorganismo que va a ser ensayado y se incuban a la
temperatura ptima de crecimiento del microorganismo. Posteriormente se examinan los tubos para
determinar en cules de ellos se ha inhibido el crecimiento del microorganismo. Tambin se calcula la
concentracin mnima inhibitoria (CMI) que es la concentracin ms baja que es capaz de prevenir el
crecimiento del microorganismo. Aquellos antibiticos que tengan la CMI ms baja debern ser los que
tengan la mayor actividad antimicrobiana frente al patgeno (Mateos, 2014).

Tcnica de difusin en placa. En este mtodo se incuba el microorganismo en una placa Petri con
medio de cultivo solidificado sobre la que se aaden discos de papel impregnados con una cantidad
conocida de antibitico. Despus de la incubacin se observan en la placa la presencia de zonas claras
alrededor de los discos llamadas halos de inhibicin. La ausencia de un halo significa que el
microorganismo es resistente al antibitico. Por el contrario y por regla general, cuanto mayor es el halo
ms efectivo es el antibitico. Este mtodo se puede utilizar tambin para determinar la CMI al utilizar
discos con distintas concentraciones de un mismo antibitico (Mateos, 2014).
Conclusiones
Los antibiogramas permiten determinar la susceptibilidad de una cepa bacteriana a varios antimicrobianos
que son opciones de tratamiento para ese agente infeccioso.
Se determin que los aceites esenciales de naranja y jengibre no presentan actividad antibacteriana
contra Escherichia coli. Pues en la composicin de estos aceites no contienen fenoles (timol y carvacrol)
los mismos que son los responsables de su amplia accin antimicrobiana por lo que no inhibe el
crecimiento de estas bacterias.
Los antibioticos tales como el sulfato de estreptomicina presentan toxicidad selectiva e infieren con las
funciones vitales de las bacterias provocando su muerte.
Bibliografa
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