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- Bien choisir la valeur cible et lencadrer. Attention de bien regarder le volume dposera change tout.
ANNALES 2004 :
JOUR 2
2. TRANSDUCTION GENERALISEE
2.1.
Culture dune souche sauvage de E.coli MC 4100 Quel doit tre son phnotype ? ttracycline sensible Pourquoi ? pour
pouvoir slectionner les cellules qui ont reu le transposon Tn10 qui confre le gne de rsistance la ttracycline et
liminer les cellules qui nont pas acquis le gne de rsistance.
2.1.1. Transduction
La multiplicit dinfection pour une transduction correcte est : 1 phage 1 bactrie. Le stock titre .. particules/ml.
Raliser 1 tmoin : lequel et dans quel but ? 200L de cellules comptentes, pas de phages, le volume de phage est
remplac par du milieu LB, permet de vrifier que la souche E.coli MC4100 est bien sensible la ttracycline. Le jour de
la lecture, il ne doit pas y avoir de pousse sur le milieu LB + ttracycline pour permettre la validation des rsultats.
- Laisser au repos pendant 15 minutes temprature ambiante sans agitation.Que ce passe-t-il durant lincubation ? il
va y avoir adsorption des phages sur les rcepteurs spcifiques prsents la surface des bactries sensibles rendues
comptentes par les ions Ca2+. Puis, injection de lADN phagique dans les bactries comptentes et puis rplication.
- Justifiez lutilisation du milieu slectif : LB + ttracycline. Permet la slection des transductants : bactries qui ont
intgres le Tn10
- Dans une population stock de P1, il y a 0,1% de particules qui sont des particules transductrices. Un phage P1
emporte 2% du chromosome bactrien, il y a donc 2% de particules transductrices qui portent un gne donn parmis
tous les gnes du chromosome bactrien. Calculer le nombre thorique de transductants : si A = 0.950 C = 0.950 x 5.10 8
= 4.8.108 cellules/mL. La multiplicit dinfection est d1 phage pour 1 bactrie donc si le volume de bactrie est de 200 L,
on a 4.8.108 x 200.10-3 /1 = 9.5.107 bactries donc lquivalent en phage mis en contact avec la bactrie et tal.
- 0.1% des 9.5.107 sont des particules transductrices : 9.5.107 x (0.1/100) = 9.5.104 particules transductrices
- 2% des particules transductrices portent le gne donn : 9.5.104x (2/100) = 1900 particules avec le gne donn.
- explication diffrence thorique pratique : soucis dintgration du Tn10 par recombinaison homologue : transduction
abortive et soucis de trs faible probabilit de tomber sur les particules transductrices lors de la mise en contact bactrie phage.
- Calculer le rendement de la transduction : R = nombre rel de transductants /nombre thorique de transductants x 100
= 2/1900x100 = 0.1%.
- Donner le mode daction de la ttracycline : action sur la synthse des protines, elle se fixe sur la fraction 50 S des
ribosomes et empche la pntration ou la fixation du complexe acide amin-ARNt.
EXERCICE :
A partir dune suspension bactrienne donnant une absorbance de 0.610 et en sachant que 1UA = 5.10 8 bactrie/mL.
Dterminer le volume de suspension phagique (titre approximatif de 2.10 9 UFP/mL) ajouter pour obtenir une multiplicit
dinfection proche de 1 phage pour 4 bactries et ceci dans un volume final de 7 mL de suspension bactrienne.
3. LYSOGENIE
- Justifier lajout de MgS04 et de maltose au milieu de culture utilis pour la croissance de la souche sensible E.coli s
- Ladsorption est facilit par des ions positifs bivalents ex: Ca2+ , Mg2 + qui rendent les cellules comptentes en
permabilisant la membrane bactrienne. (Les ions magnsium chlate les phospholipides des membranes et participent
la rigidification des membranes froid. De plus le magnsium neutralise l'ADN transformant et lui permet de sdimenter
au contact de la membrane avant sa pntration)
- Ladsorption du phage se fait sur des rcepteurs membranaires cods par le gne inductible lamB servant
transporter le maltose, comme le gne est inductible par le maltose pour que le rcepteur soit exprim la surface de la
cellule, il faut absolument ajouter du maltose dans le milieu pour que le phage puisse saccrocher.
- Pourquoi utiliser des cellules en phase exponentielle de croissance ? Le phage dtourne son profit le systme
enzymatique et nergtique de la cellule hte permettant sa rplication. Cest pour cette raison que les phages ne se
multiplient que dans des bactries htes qui ont un mtabolisme actif en phase exponentielle de croissance
- Quelle est laction des UV ? La frquence de l'induction est augmente par les rayons UV qui endommagent lADN.
Ces agents activent le systme SOS, la protine Rec A (implique dans la rparation de lADN) hydrolyse le rpresseur
C1 du phage et permet lexpression du cycle lytique. On passe donc du cycle lysognique au cycle lytique.
- Pourquoi doit-on maintenir les cellules irradies dans lobscurit ? Aprs exposition aux UV les botes sont mises
labri de la lumire pour viter la photoractivation du systme SOS (systme de rparation de lADN) et laction
rparatrice de la protine Rec A.
- Que se passe-t-il durant lincubation ? sous laction des UV les phages ont induits lexcision du phage lambda du
chromosome bactrien. Le phage induit donc le cycle lytique dans la bactrie, il y a expression des gnes du cycle lytique
et la cellule va tre lyse et librer de nouveaux phages qui vont pouvoir sadsorber sur dautres cellules et y injecter leur
ADN et induire dautres cycles lytiques.ainsi de suite.
- Calcul taux induction spontane : (nombre UFP spontane (bote 1) / nombre de bactries lysogne)x100
- Calcul taux induction provoque chaque temps : (nombre UFP provoqu / nombre de bactries lysogne)x100
taux induction spontane
4. CONJUGAISON
- justifier le crible de slection ? souche femelle (F-) : Mal -, Str R, Tet S, souche male (Hfr) : Mal +, Str S , tet R, le
milieu slectif contient du Maltose + Streptomycine et Ttracycline :
- limination des souches femelle Tet S non conjugues et des souches mles Str S
- Slection des souches qui vont pouvoir se dvelopper sur le milieu seront Str R et tet R avec la capacit utiliser ou
non le maltose
- le milieu + maltose permet le reprage des colonies recombines mal + car la souche femelle de dpart est mal , sur
ce milieu pousse les souches mal + et mal ( mais attention les souches F - femelles qui sont mal - ne pourront par
pousser car elles sont limines par leur sensibilit la ttracylcine ( Tn 10 proche de lorigine de transfert)
Ce milieu est important, car il va nous permettre de reprer les souches mal + et mal conjugues, indispensable quand
les souches Hfr nont pas la mme efficacit de transfert.
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En effet, le transfert du locus mal et sa recombinaison ne sont pas systmatique tout dpend de la localisation du locus
mal par rapport lorigine de transfert et le sens de transfert, plus le locus est proche de origine et dans le sens de
transfert plus vite il sera transfr et plus il aura de chance dtre recombin. Il faut donc calculer la frquence de
recombinaison et non le nombre de mal +.
- Mlange 5 F- / 1 Hfr dans un volume final de 400 500 l. Le nombre total de bactries dans le tube doit tre de
lordre de 2,5.108 cellules. Pour cela comparer les absorbances 540 nm des cultures et effectuer des dilutions si
ncessaire. On donne la correspondance suivante : A540nm = 1 5.108 cellules/mL
On fixe deux paramtres sur les 3 : le rapport et le nombre final de cellule, il reste donc une variable dterminer le
volume pipeter : Donnes : E.coli (F-) = 1.5.109 cellules/mL et Hfr 161 = 4.6.108 cellules/mL
Jai droit 2.5.108 cellules/mL divis par 6 (total : 5 F- + 1 Hfr) soit = 4.2.107 cellules/mL : 1 hfr = 4.2.107 x1= 4.2.107
cellules/mL et 5 F- = 4.2.107 x 5 = 2.1.108 cellules/mL
- E.coli (F-) = 1.5.109 cellules/mL et je veux 2.1.108 soit 2.1.108 x 1 /1.5.109 = 144 L
- Hfr 161 = 4.6.108 cellules/mL et je veux 4.2.107 soit 4.6.108 x 1 /4.2.107 = 92 L
Total 144 + 92 = 236 L < 400 L donc il faut faire une dilution au de chaque lment pour atteindre (144x2)+(92x2)
= 472 L
- Exploitation de rsultats thoriques
Hfr n161
Hfr n162
Hfr n163
Hfr n166
Hfr n168
Hfr n170
Hfr n174
Nombre de colonies
mal+
0
6
0
0
0
113
0
Nombre de colonies
mal17
19
>300 (516)
0
0
101
>300 (363)
- Classer les Hfr par ordre dcroissant defficacit de transfert (par rapport la recombinaison totale).
163 > 174 > 170 > 162 > 161 et pour 166 et 168 on ne sait pas car absence de pousse
- Classer les Hfr par ordre dcroissant de frquence de recombinaison pour le caractre maltose.
170>162 > les autres on ne sait pas car on na pas dautre marqueurs de visualisation
- Interprter les rsultats de la manipulation en ce qui concerne la localisation du gne maltose sur le chromosome
dEscherichia coli.
166 et 168 ne pousse pas pourquoi ?
gne rpsl codant pour un rpresseur du gne de rsistance la streptomycine est proche des origine de transfert de 166
et 168 do linhibition de la pousse.
Localisation du gne maltose ?
Il est compris entre lorigine de transfert 162 et 170 car les seules recombinants mal + sont obtenus pour les souches 162
et 170 se qui implique un transfert du gne et quil soit situ proche des origine de transfert pour avoir une frquence de
transfert suffisamment importante.
On remarque galement que la souche 163 ne transfert pas le gne mal ce qui nous permet de prciser davantage la
position du gne mal entre lorigine de transfert de 170 et celle de 163 .
Ori C 83 minutes et avant uxu AB 97 minutes
5. TRANSFORMATION
-
Rechercher sur Internet le vecteur pGlo puis le schmatiser en plaant ses lments constitutifs et expliquer leur rle.
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- Justifier lisolement des cellules comptentes (tube T) sur milieu LB et LB + ampicilline + arabinose.
Milieu LB + ampi + ara : Les cellules comptentes non transformes sont ampicilline sensibles donc elle ne
pourront pas se dvelopper sur ce milieu contenant de lampicilline. On attend une absence de pousse.
Milieu LB : nous permet de vrifier que la souche est capable de se dvelopper sur le milieu LB sans ampicilline
malgr le choxc thermique qui emdommage une bonne partie des cellules. On attend de la pousse.
- Raliser les schmas de manipulation pour les deux techniques, puis calculer en justifiant votre dmarche l'efficacit de
transformation pour le cas o l'on compte 560 colonies en moyenne pour 50 ng de plasmide. Voir travail fait en TP
- En supposant que chaque colonie tait l'origine une bactrie transforme par un seul plasmide et sachant que celui-ci
fait 4500 paires de base, calculer en vous justifiant le pourcentage d'ADN transformant par rapport l'ADN total utilis.
MM 1 pb = 660 Dal, N = 6,023 . 1023 Voir travail fait en TP
ANNALES 2001
JOUR 1
JOUR 2
Trucs et astuces :
- Bien rflchir la matrice : intercaler les dilutions fortes et les dilutions faibles (voir fiche conseil
distribue en cours danne) de faon viter que les diamtres dinhibition se chevauchent
- Respecter les distances de dpt des disques sur grande bote 1.5 cm du bord et 3cm entre chaque
disques
- La glose doit tre parfaitement sche avant dpt
- Lors des dpts de disques ne jamais dplacer un disque qui est tomb
- Veiller au bon alignement des disques
- Appuyer lgrement au centre du disque lors du dpt pour garantir une bonne adhsion
- Laisser diffuser sur la paillasse et retourner au moment de lincubation pour viter la condensation
- une calculatrice
- des mouchoirs
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DENOMBREMENT
Prlvt
Mesure
Abs
-homo
-prlvt pip droit
-aseptie
-orga poste
-remise ltuve
- blanc
- agitation
- paraf
-3en1
-portoir
-Estimat densit
-tableaux +
encadremt
- justif choix dil :
valeur cible selon la
norme et
encadrement
TP DOSAGE ANTIBIOTIQUE
bote
Matrice
sche
1,5cm/1,5
3cm/1,5
placemt
disq/3
Homognit
inoculum
Disposition
disques
- Pas de trace
- colonies
confluentes
- Alignement
disque
- Pas de
dplacement
-Titre
-Condition de culture
(TC, agitation..)
-Echelle (choix)
-Axes
-Units
- qualit du trac
-myclium :
texture
densit
-couleur :
au revers
en surface
-contours :
rguliers ou irreg
-divers
Micro schma
Qualit
Lgendes
-hyphes septs
-conidiophores
-vsicule
-phialides
-conidiospores
Cohrence
et exploitat
rsultats
Rpartitio
n du soft ?
- Intra vol
- Inter vol
Bonne
rpartition
sur toute la
bote
- Norme
- Formule
- Signification
- Calcul
- Nbr signif
- Unit
Tmoin
Avec ou
sans plage
selon
rsultats
attendus
TP SUIVI CROISSANCE
trac
Technique
des
spots
- Botes bien
sche
- Pas de coulure
- Qualit Matrice
- Pas de plage de
lyse parasites
AUTRE
Exploitation du trac
MOISISSURES
macro
TP PHAGES
-Analyse de la courbe
- Def G /1
- Dterminatgraphique ou
calcul
-Valeur G
- Calcul ou dterminat
EXAMEN MICROSCOPIQUE
Interprtation
Cl
- Hyphes septs ou
non
- Spores forme et
couleurs
- type App fructifre :
en pomme darrosoir
ou pinceau.
technique
CR
- pas de dbordement
- mise au point
-choix du champ
-densit
-dchet dans 3 en 1
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