TCNICAS MICROBIOLGICAS QUE SE UTILIZAN PARA LA

IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS.
Wilfido Hoyos Muoz.

Palabras claves: inmunoensayos, bacterias, protozoarios, agua, microbiologa

de aguas, identificacin rpida

Resumen.
Son muchas las enfermedades
trasmitidas al ingerir alimentos o agua
contaminada en donde estos actan como vehculos de trasmisin de organismos
dainos como son salmonelosis, hepatitis viral tipo A y toxoplasmosis. Ms de 250
enfermedades conocidas se transmiten a travs de alimentos. Esta situacin,
aunada a la demanda por resultados inmediatos y a los avances tecnolgicos, ha
conducido al desarrollo de una amplia gama de mtodos rpidos en las ltimas
dcadas(Palomino-Camargo C & Gonzlez-Muoz Y) en tal sentido en el
presente artculo se detallan las tcnicas microbiolgicas que nos brindan agilidad
para la identificacin de microorganismos tales como, tcnicas moleculares para la
deteccin e identificacin de patgenos en alimentos, Mtodos inmunolgicos
utilizados en la identificacin rpida de bacterias y protozoarios en aguas,
Identificacin bacteriana basada en el espectro de masas de protenas
Introduccin
Se sabe que ms de 250 enfermedades conocidas son trasmitidas a travs e
alimentos y que alrededor de 40 diferentes patgenos de origen alimentario
causan enfermedades humanas. Ms del 90% de los casos confirmados y las
muertes causadas por dichos patgenos han sido atribuidos a bacterias
(Palomino-Camargo C & Gonzlez-Muoz Y), los mtodos de identificacin
clsicos requieren generalmente de un uso adecuado de cultivo que resulta costo
y demanda gran cantidad de tiempo con resultados de baja sensibilidad, es por
ello necesario el estudio de tcnicas agiles y efectivas que permitan identificacin
de patgenos que afectan la humanidad.
Mtodos.
Se realiz una revisin de tipo narrativo referente a las tcnicas de tcnicas
microbiolgicas, obteniendo informacin
de fuentes primarias de carcter

cientfico, donde se tuvo en cuenta la actualidad de la informacin consultada,

anlisis objetivo y alcance del mismo. Los trminos de bsqueda fueron :
Tcnicas moleculares para la deteccin e identificacin de patgenos en
alimentoshttp://www.scielosp.org/pdf/rpmesp/v31n3/a20v31n3.pdf,
Mtodos
inmunolgicos utilizados en la identificacin rpida de bacterias y protozoarios en
aguas.
Pgina
web:
http://www.scielo.sld.cu/pdf/hie/v51n1/hie09113.pdf,
Identificacin bacteriana basada en el espectro de masas de protenas: Una nueva
mirada a la microbiologa del siglo XXI, http://www.scielo.cl/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S0716-10182012000300003

Discusin
Mtodos moleculares para la deteccin e identificacin de patgenos transmitidos
por alimentos
La identificacin molecular se basa en la composicin constitutiva de los cidos
nucleicos ms que en los productos de su expresin. Estos mtodos
moleculares se utilizan a menudo en asociacin con la identificacin
microbiolgica convencional, estos mtodos tiene su origen en investigaciones
desde los aos 1.980, siendo los primeros mtodos de identificacin molecular la
hibridacin ADN-ADN, l anlisis de secuencias del ADNr 16S, la hibridacin con
una sonda especfica y el anlisis RFLP o ribo tipificacin.
El descubrimiento de la PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) la clonacin,
la secuenciacin y la tecnologa de deteccin por fluorescencia, y la accesibilidad
a gran cantidad de informacin en la web ayud al desarrollo de nuevas
herramientas. Se puede destacar la plataforma molecular, incluyendo sistemas de
amplificacin in vitro en tiempo real, biosensores y microarreglo, desarrollados o
se estn desarrollando para su uso como mtodos rpidos en la deteccin de
patgenos en alimentos.
Reaccin en cadena de la polimerasa
Se constituye en la tcnica de diagnstico molecular ampliamente utilizada debido
a su protocolo rpido y de fcil uso, generalmente se requiere de 2 a 3 horas para
completar una PCR, pero resultados ms avanzados solamente requieren
minutos.
Amplificacin basada en la secuencia de cidos nucleicos (NASBA)
Es una tcnica menos desarrollada que la PCR, hay registros de ensayos para
identificar patgenos con resultados en tiempo real por lo tanto se prev con
mucho inters por su capacidad de detectar organismos viables

Electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE).

Se ha utilizado para la caracterizacin de Salmonella, Listeria y otros patgenos

de transmisin alimentaria, en la tipificacin de Salmonella, aislada a partir de
alimentos de origen animal y pacientes humanos y ha sido utilizada mundialmente
para la vigilancia e investigacin de los brotes de E. coli
Biosensores.
Se han aplicado exitosamente en la deteccin de patgenos alimentarios. Estos
sensores se han desarrollado utilizando ADN, tcnicas inmunolgicas y pptidos
de fagos. El uso de biosensores en un estudio demostr que E. coli y Salmonella
podran detectarse en leche descremada, con lmites de deteccin de 25 y 23
UFC/Ml respectivamente (Fuente: Hakovirta, 2008)
Microarreglos
Consisten en un gran nmero de sondas (clones de ADN, productos de la PCR u
oligonucletidos sintticos) inmovilizadas sobre una superficie slida. Tras los
pasos de hibridacin y lavado, el cido nucleico enlazado a las sondas genera un
patrn de fluorescencia que es entonces registrado y analizado utilizando un
escner que ha permitido gran acumulacin de datos recogidos por instituciones
acadmicas y organizaciones industriales se han desarrollado para los patgenos
asociados a alimentos. Un microarreglo particular, basado en el gen gyrB, fue
utilizado para detectar e identificar rpidamente a Salmonella y Shigella.
Pirosecuenciacin 454: una nueva herramienta para la deteccin de
patogenos en alimentos y medioambiente.
La tecnologa de secuenciacin de cidos nucleicos ha dado pasos increbles en
los ltimos cinco aos, con el desarrollo y comercializacin de microrreactores
para la rpida secuenciacin de alto rendimiento, tambin conocido como
pirosecuenciacin 454 (52). Con estas nuevas tecnologas, los genomas pueden
ser completamente secuenciados en semanas (incluso en horas), en lugar de
aos, debido a que esta metodologa no requiere bibliotecas de ADN, ni clones,
solo el cido nucleico aislado. Esta secuenciacin ha ampliado el repertorio de los
genomas bacterianos secuenciados, incluyendo mltiples cepas patgenas , y ha
ayudado a identificar los agentes potenciales, bacterianos, protozoarios o virales,
asociados con enfermedades de etiologa desconocida.

Mtodos inmunolgicos utilizados en la identificacin rpida de bacterias y

protozoarios en aguas.

Mtodo por precipitacin

Al mezclar cantidades suficientes de un antgeno soluble con anticuerpos
especficos, la interaccin Ag-Ac puede dar lugar a una red capaz de ser
visualizada como un precipitado. Esta estar constituida por grandes complejos
inmunes formados por la interaccin Ag-Ac. Cuando se agregan concentraciones
crecientes de antgeno soluble a una cantidad fija de suero que contiene
anticuerpos especficos, a medida que la cantidad de antgeno agregado aumenta,
la cantidad "de precipitado se incrementa hasta alcanzar un mximo, luego del
cual declina (Revista Cubana de Higiene y Epidemiologa. 2013; p.5)
Estos mtodos pueden ser desarrollados en medios lquidos o en geles y han
demostrado una notable eficacia para individualizar y purificar los antgenos
dotados de diferencias particulares. La unin Ag-Ac se traduce por la formacin de
un precipitado insoluble con la condicin de que los reactivos se encuentren a
concentracin equivalente.
Mtodos por aglutinacin
Las reacciones de aglutinacin involucran una interaccin entre el Ag y el Ac que
llevar a la aparicin de un aglutinado que se visualiza como grumos, grnulos de
aglutinado o agregado; consisten en hacer reaccionar cantidades equivalentes de
los reactantes (Ag y Ac). Los principios fisicoqumicos que gobiernan la formacin
de estos aglutinados son los mismos que rigen la de un precipitado.
La gran diferencia entre las reacciones de precipitacin y las reacciones de
aglutinacin radica en las caractersticas del Ag: mientras que en las reacciones
de precipitacin se emplean antgenos solubles, en las reacciones de aglutinacin
el Ag es particulado. Con un Ag soluble, tambin es posible disear una reaccin
de aglutinacin gracias a que es posible utilizar distintas partculas (partculas
inertes, ejemplo: ltex) y realizar un pegado qumico o fisicoqumico del Ag soluble
a dichas partculas, para generar un "Ag particulado" til para fines de
identificacin. Las reacciones de aglutinacin desde el punto de vista de su utilidad
en el laboratorio tienen la ventaja de ser muy sencillas de realizar, no requieren de
ningn equipamiento para su lectura, son rpidas y fciles de implementar.
Adems, presentan una mayor sensibilidad que las reacciones de precipitacin,
por lo que las han sustituido en muchos casos. Sin embargo, cabe mencionar que
las reacciones de aglutinacin presentan una menor sensibilidad que otras

reacciones, tales como ELISA e inmunofluorescencia indirecta; son menos

especficas, pues tienen la desventaja de depender grandemente de los factores
fsico - qumicos, tales como concentracin de electrolitos, pH, temperatura y
tiempo de reaccin. No obstante, las ventajas enumeradas hacen de estas una
valiosa herramienta para la deteccin de antgenos en colonias bacterianas
obtenidas a partir de muestras de agua.( Revista Cubana de Higiene y
Epidemiologa. 2013;51 p.6)
Aglutinacin por mtodo del ltex
Est basado en la prueba de aglutinacin. Los anticuerpos son adheridos a
partculas de ltex. Al enfrentarse el ltex sensibilizado con el Ag especfico se
produce la agregacin entre estas esferas y los antgenos. Esta prueba ha sido
usada principalmente en bacteriologa y en virologa. Se han desarrollado con
xito mtodos por aglutinacin de ltex para Salmonella spp., Vibrio cholerae y E.
coli.
Determinacin de antgenos por ELISA
Se utiliza para la determinacin de antgenos. Este tipo de sistema permite tanto la
deteccin de bacterias patognicas como de toxinas en muestras ambientales,
con una sensibilidad 1-5 UFC/25 mL de muestra y una especificidad de 95 - 99 %,
lo cual ofrece resultados en tiempos ms cortos que los mtodos tradicionales.
La modalidad ms frecuente del mtodo ELISA para la determinacin de
antgenos es el modelo ELISA "sandwich" directo. En este modelo, el Ac
especfico para el Ag de inters se encuentra adsorbido en un soporte slido sobre
el cual se aadir la muestra biolgica. En el caso de que en dicha muestra se
encuentre el Ag, quedar capturado en la placa y ser puesto en evidencia tras la
adicin de otro Ac especfico conjugado con la enzima. Por ltimo, se aade el
sustrato incoloro que, por accin de la enzima, dar un producto coloreado que
producir un color observable a simple vista y cuantificable mediante un
espectrofotmetro.
Inmunofluorescencia
La presencia del Ac conjugado con el flourocromo no necesita de ninguna
reaccin qumica para hacerse evidente. Los fluorocromos emiten luz de una
determinada longitud de onda luego de ser exitados por un haz de luz de longitud
de onda menor.19 Cada fluorocromo es capaz de emitir luz dentro de un
determinado espectro de longitud de onda. Por ejemplo, el fluorocromo
denominado isotiocianato de fluoresceina (FITC, siglas en ingls) emite en la
gama del verde, mientras que la ficoeritrina emite en la gama del rojo. El hecho de

que existan distintos fluorocomos capaces de emitir a diferentes longitudes de

onda, permite que puedan detectarse antgenos diferentes en un mismo
microorganismo.La visualizacin de la reaccin puede realizarse utilizando un
microscopio de fluorescencia (para colonias de microorganismos fijadas en
portaobjetos) o por citometra de flujo (para microorganismos en suspensin).(
Revista Cubana de Higiene y Epidemiologa. 2013;51 p.6).

Conclusiones
Debido a su rapidez, elevada sensibilidad y eficiencia para la deteccin temprana
de microorganismos patgenos, las tcnicas de diagnstico molecular representan
una alternativa prometedora en el campo de los alimentos y se vislumbra como
una herramienta novedosa con un futuro prometedor para la industria de los
alimentos , por ello, el nmero de mtodos moleculares con potencial utilidad en el
rea de microbiologa de alimentos se ha ido incrementando y diversificando, cada
uno con sus respectivas fortalezas y debilidades.

Referencias bibliogrficas
http://www.scielosp.org/pdf/rpmesp/v31n3/a20v31n3.pdf
http://www.scielo.sld.cu/pdf/hie/v51n1/hie09113.pdf