CANDIDIASIS

DIAGNSTICO DE LABORATORIO
- Muestras:
Escamas de piel y faneras.
Hisopado de mucosa: bucal, vaginal, surco balano-prepucial, etc.
Materia fecal
Hemocultivo, esputo, LBA, biopsia, LCR, puncin heptica, etc.
(Tener en cuenta las recomendaciones previas, la toma de muestra y las condiciones de conservacin de
las mismas).

Observacin en fresco (con o sin agregado de KOH 20%

y/o Guegun)

- Examen directo del material

Observacin por tincin: MGG, GN, Groccot
(no se realiza de rutina para piel y mucosas).

Medios generales
-

Cultivo:

28 y 37 C (de acuerdo al tipo de muestra)

Medios selectivos
Medios enriquecidos

- Identificacin de gnero y especie: CHROMAgar, AHM,

Deteccin de Ac
- Pruebas complementarias

Deteccin de Ag
Deteccin de metabolitos, ADN

- Interpretacin e informe de los resultados

- EXAMEN DIRECTO

Examen microscpico en fresco: si se trata de material crneo (escamas de piel, raspado de

uas, pelos) se lo examina con una solucin de KOH 20% en caliente (para disgregar y clarificar
el material). Si se trata de material obtenido de mucosas, heces, etc., el material se examina
directamente entre porta y cubreobjetos. Tambin en ambos casos se puede utilizar colorante
Guegun. Si es esputo es conveniente observar el material con KOH 20%. Si se trata de LCR,
adems se debe utilizar tinta china para poner en evidencia la cpsula de Cryptococcus spp. Si la

muestra es positiva, se deberan observar elementos levaduriformes, de 3 a 5

de dimetro, con

o sin pseudomicelio, y/o hifas verdaderas (FIG. 1).

Examen microscpico por coloracin: esputos y secreciones pueden ser fijados y coloreados
con May Grunwald Giemsa o Gram Nicolle. Tambin se pueden observar elementos
levaduriformes con o sin pseudomicelio o hifas verdaderas (FIG 2).

FIG 1: Levaduras y pseudomicelio en hisopado de

mucosa bucal. Guegun-1000x

FIG 2: Levaduras y pseudomicelios- Hisopado de

mucosa bucal. Coloracin MGG-1000x

- CULTIVOS

Los hongos del gnero Candida crecen bien en los medios generales: Agar Sabouraud glucosa
(ASG), Czapek, Agar papa dextrosa (APD). Es conveniente sembrar medios con antibiticos,
como el cloranfenicol (ASG cloranfenicol) o cicloheximida (Mycosel) (tener en cuenta que C.
krusei, C. tropicalis son sensibles a este ATB) para impedir el desarrollo de bacterias
contaminantes. El medio Lactrimel se utiliza en materiales de piel para el aislamiento de
dermatofitos. El medio Cerebro corazn sangre (CCS), est indicado para el aislamiento de
Histoplasma capsulatum a 37 C.

Escamas de piel

ASG, Lactrimel, Mycosel. Incubar

a 28 C, 2 semanas

Hisopado de mucosa

ASG, ASG cloranfenicol. Incubar a 28

C, 1 semana

Hemocultivos

Esputo, LBA, biopsia,

Liq. puncin, etc.

En caldo
Lisis-centrifugacin
Sb, Sb cl, mycosel, CCS. Incubar
a 28 C y 37C, 1 mes
ASG, ASG cl, mycosel, CCS. Incubar a
28 C y 37C, 1 mes

El desarrollo de las levaduras se torna visible a las 24-48 hs a 28 C aunque no conviene

eliminar los tubos sembrados antes de los 7 das para los materiales superficiales y de 1 mes para
los profundos. Las colonias obtenidas son generalmente lisas, blandas, brillantes, de color blanco
o ligeramente beige (FIG 3); con el tiempo pueden tornarse rugosas, plegadas o membranosas.

FIG 3: Colonias levaduriformes en ASG

El examen microscpico de estas colonias, permite observar microorganismos unicelulares

esfricos u ovoides, de paredes delgadas, de 4 a 7 de dimetro, brotantes, con pseudomicelio
escaso o ausente.
- IDENTIFICACIN DE GNERO Y ESPECIE

Previa a la identificacin de gnero y especie de las levaduras, es necesaria la utilizacin de un

medio cromognico como el CHROMagar Candida (CHROMagar, Paris, France) para
detectar la posible mezcla de levaduras en una misma muestra (FIG 4) y realizar una
identificacin presuntiva de las levaduras del complejo C. albicans (C.

albicans/C.

dubliniensis/C. africana): color verde, C. tropicalis: color azul y C. krusei: colonias rosas
secas y rugosas, y colonias rosas hmedas: otras especies de Candida.

Verde: complejo
Candida albicans

Rosa seca: Candida krusei

Rosa hmerda: Otras especies de Candida

Azul: Candida tropicalis

FIG 4: Placa de CHROMagar con mezcla de levaduras

Una vez aislada la levadura, se practican las siguientes pruebas, para confirmar las levaduras
verdes del complejo C. albicans y distinguirla de otras especies:
- Filamentizacin en suero: permite observar la formacin de tubos germinativos entre las 2

y 3 hs. a 37C, si la levadura a identificar se trata de C. albicans/C. dubliniensis/C. africana.

(FIG 5)
- Micromorfologa en Agar Harina de Maz + Tween 80 (AHM) o Agar Leche (AL): si la
especie en estudio es C. albicans/C. dubliniensis, en este medio se observan blastoconidios
(levaduras brotadas), pseudomicelio y la formacin de clamidoconidios terminales a las 48 hs.
de incubacin. (FIG 6). Si la especie da colonias verdes en CHROMagar pero ausencia de
clamidoconidios en AHM es probable que la especie sea Candida africana (se debe corroborar
con pruebas bioqumicas y/o estudios moleculares).
La ausencia de clamidoconidios en AHM y colonias de color diferentes al verde en
CHROMagar, indica que se trata de otra especie de Candida En stos casos en el AHM se
pueden observar levaduras y pseudomicelio (FIG 7) o solo levaduras (FIG 8) y se debe informar
como levadura no Candida albicans.

FIG 5. C. albicans. Formacin deFIG

tubos
germinativos-Guegun
1000x
6: C.
albicans. Formacin de
Clamidoconidios en AHM-Guegun 1000x

FIG 7: Levaduras y pseudomicelio de C.

parapsilosis en AHM-Guegun 400x
FIG 8: Levaduras de C. glabrata en AHM- Guegun 400x

Si bien Candida dubliniensis, forma tubos germinativos en suero y clamidoconidios (CL) en las
condiciones antes mencionadas, su frecuencia de aparicin en los diferentes materiales clnicos
es mucho menor que C. albicans y se ha descripto su aislamiento principalmente de candidiasis
orofarngeas en pacientes HIV(+). Algunas de las caractersticas metablicas y morfolgicas que
presentan estas dos especies tienen utilidad en la diferenciacin de las mismas en el laboratorio:

C. albicans
C. dubliniensis

Dxilosa

-metilDglucsi

CL

Crecimient

en

oa

+*

AS

45C

+
-

REF.:CL en ASGi: produccin de clamidoconidios en medio Agar semilla de girasol a las 24 hs;
+*: indica utilizacin;

Adems, ambas especies poseen diferentes cdigos de asimilacin con el sistema API 20 C AUX
e ID 32 C (Biomrieux, France).
C. africana, es la 3 especie del complejo C. albicans y se diferencia de las anteriores por no dar
clamidocoidios terminales en AHM. La gran mayora de los aislados de C. africana se han
recuperado a partir de muestras genitales femeninas. Si bien se la clasifica como una especie
diferente, su status taxonmico es controvertido, ya que muchos autores la consideran como una
variedad dentro de C. albicans.
La identificacin de las levaduras no C. albicans se basa en sus caractersticas fisiolgicas, como
fermentacin

(zimograma)

utilizacin

de

carbohidratos

sustancias nitrogenadas

(auxonograma). En la actualidad hay equipos comerciales para la identificacin rpida (48-72 hs)
de cepas de levaduras como API 20 C AUX e ID 32 C (Biomrieux, France).
En el siguiente diagrama se muestra una marcha para la identificacin de las especies de
Candida:

Marcha para la identificacin de

especies de Candida
Aislamiento primario (o reaislamiento) en CHROMagar

Colonias de 1
nico color

Mezcla de
Colonias (ms
de un color)

Especie aislada

Mezcla de especies
Aislar cada una de las
colonias de diferente color

Siembra en
AHM+Tween 80

Colonias verdes y
clamidoconidios

Colonias verdes sin Colonias azules y Colonias rosas

Colonias rosas
secas y pseudomicelio
clamidoconidios
hmedas
pseudomicelio

Siembra ASG
Candida albicans
o C. dubliniensis

Candida africana
C. tropicalis

Clamidoconidios en 24 hs
(-) C.
albicans

(+) C.
dubliniensi
s

Otras especies de Candida

C. krusei

Identificacin definitiva
con API 20 AUX, API 32 IC
o Auxonograma y
Zimograma

Importancia clnica de las especies de Candida:

- Candida albicans (sensu stricto):
Es el principal agente productor de candidiasis de la mucosa del TGI y vaginal y es el agente
ms aislado en candidemias en la Argentina (40,75 %) y en el mundo, aunque este porcentaje va
disminuyendo a expensas del aumento de otras especies consideradas reemergentes
(principalmente C. parapsilosis y C. tropicalis); est considerada como causante de infecciones
de origen endgeno. Su aislamiento en CI ha sido asociado mayormente a pacientes con tumores
slidos, sin neutropenia y que no han sido sometidos a profilaxis con FCZ.
- Complejo Candida parapsilosis:
Forman parte de este complejo: Candida parapsilosis (sensu stricto), C. metapsilosis y C.
orthopsilosis. La diferenciacin de las 3 especies se realiza por biologa molecular (PCR,
secuenciacin, etc).
Candida parapsilosis (sensu stricto) es el 2 agente ms aislado en candidemias en la Argentina
(28,67%), detrs de C. albicans (40,75%). Est relacionada al manejo inadecuado de los
catteres, contaminacin de material quirrgico o transmisin horizontal a partir de infecciones
del personal en Unidades de cuidados intensivos (UCI).
- C. tropicalis:
Es el 3 agente ms aislado en CI (15,84%), es ms frecuente en pacientes con enfermedades
hematolgicas malignas, tiene gran capacidad invasiva, el 60-80% de los pacientes
neutropnicos con CI estn previamente colonizados.
- Complejo C. glabrata:
Junto con C. krusei constituye una de las especies menos susceptibles al FCZ (desarrolla
resistencia 2). Present una baja frecuencia de aislamiento (2,64%) en nuestro pas. Es el 2
agente ms frecuente en los EEUU. Est asociada al 75% de las candidemias de los pacientes en
tratamiento con FCZ. Actualmente se han descripto 2 especies nuevas relacionadas con
C.glabrata: Candida bracarensis y Candida nivariensis.
- C. krusei:
Esta especie es intrnsecamente resistente al FCZ y se ve un aumento en la frecuencia de esta
especie en pacientes tratados preventivamente con este ATF.
- C. famata :
Surge como

una especie emergente de importancia en nuestro pas, donde es ms frecuente que

C. krusei y C. guillermondii.

- C. dubliniensis:
La mayora de los aislamientos se obtuvieron de muestras orofarngeas de pacientes VIH
positivos. Esta especie tambin ha sido aislada de muestras de pacientes VIH (-). En nuestro
pas no se han publicado casos de fungemias, pero si se ha reportado aislamiento de C.
dubliniensis en otras localizaciones como BAL, esputo, materia fecal y flujo vaginal.
PRUEBAS COMPLEMENTARIAS
El diagnstico temprano de las Candidiasis Invasiva (CI) resulta extremadamente dificultoso
debido a que los signos y sntomas de esta infeccin no son especficos y las tcnicas de
diagnstico microbiolgico tradicionales, como los hemocultivos, son frecuentemente negativos
o se positivizan muy tardamente. Esto lleva a un retraso en el diagnstico de la CI con la
inevitable demora en el comienzo del tratamiento antifngico apropiado. Adems, debido a las
condiciones subyacentes en los pacientes en condiciones crticas, no est permitido usar tcnicas
de diagnstico invasivas para estudios histopatolgicos. Estos hechos has estimulado el
desarrollo de nuevas pruebas rpidas de diagnstico, no basadas en el cultivo, como tcnicas de
deteccin de anticuerpos, de antgenos, de metabolitos fngicos y de cidos nucleicos.
1. Deteccin de Anticuerpos (Ac):
Se cuestiona su utilizacin en el diagnstico de la CI debido a que presenta 2 limitaciones
importantes: a) la deteccin de ttulos altos de Ac en pacientes que estn solamente
colonizados por Candida y b) la respuesta de Ac puede estar retrasada, reducida o no
existir en pacientes inmunocomprometidos.
Tcnicas utilizadas: Inmuno difusin (ID), Contrainmunoelectroforesis (CIEF),
Aglutinacin de partculas de ltex (APL), ELISA.
Antgenos (Ag) utilizados: homogenado crudo, Ag de manana (Ag pared). La utilizacin
de Ag citoplasmticos, Ag inmunodominantes (48-kD o enolasa) y Ag de la fase micelial
de Candida (Candida albicans IFA Ig) aumentan la especificidad en el diagnstico
serolgico de la CI (la fase micelial facilita la penetracin del hongo y la deteccin de Ac
contra esta fase sera un marcador de la invasin tisular por Candida).
Conducta a seguir: solicitar muestras seriadas; considerar otros datos clnicos y de
laboratorio.
Utilidad: diagnstico y seguimiento de CI (si se utilizan Ag citoplasmtico, enolasa o Ag
anti-micelio).
2. Deteccin de Antgenos:

El Ag ms utilizado es el Ag de manano, que es un polisacrido de la pared celular de la

mayora de las especies de Candida. Permite un diagnstico de alta especificidad (E) en
pacientes comprometidos inmunolgicamente, pero de baja sensibilidad (S), debido a la
corta duracin de la mananemia. No existe an una tcnica aceptada universalmente.
Existen disponibles en el mercado varios equipos comerciales
Ag detectados: principalmente Ag de manana y Ag inmunodominante de 48 kDa
(enolasa).
Tcnicas utilizadas: APL, ELISA, Inmunobloting.
Ac utilizados: mono o policlonales.

PRUEBA
PLATELIA Candida
Ag
CAND-TEC
PASTOREX Candida
No comercializado

TCNICA
ELISA
APL
APL
Inmunobloti
ng

Ag
detectado
Ag
Manano
Ag
termolbil
Ag
Manano
Enolasa

Ac Utilizado
Policlonal ( E;
Policlonal ( E;
Monoclonal ( E;
Policlonal ( E;

S)
S)
S)
S)

Utilidad y conducta a seguir: dado que la antigenemia en los pacientes con CI es

transitoria, se aconseja realizar pruebas seriadas y adems utilizar ms de una tcnica que
detecten diferentes Ag o combinar con otras pruebas (deteccin de Ac, DNA u otros
metabolitos fngicos), para aumentar la sensibilidad diagnstica.
3. Deteccin metabolitos fngicos (componentes no antignicos):
En los ltimos aos se has realizado importante avances en la deteccin de marcadores
sricos de la CI diferentes de los Ag y Ac. Entre ellos debemos destacar el D-arabinitol y
el (1-3)--D-glucano (FungiTec G y Fungitell).
El D-arabinitol es un metabolito producido por C. albicans C. tropicalis, C. parapsilosis
y C. kefyr. Puede detectarse utilizando cromatografa gas-lquido en el suero y orina de
pacientes con CI, aunque son tcnicas complejas para un laboratorio de rutina.
El (1-3)--D-glucano es un componente importante de la pared celular que se libera
durante la infeccin y puede detectarse en el plasma. No es especfico para la CI (es un
metabolito panfngico) por lo que debe combinarse la deteccin de (1-3)--D-glucano
con otras tcnicas, como por ej. la deteccin de Ac anti micelio para el diagnstico de la
CI. El organismo humano carece de glucanasas, por lo tanto la eliminacin de este
metabolito es lenta. La evaluacin de la tcnica ha mostrado una S mayor de 78% y una
E mayor del 87,5%.

4. Deteccin de ADN:
Los mtodos basados en la PCR, especialmente los que tienen como diana

las

secuencias de los genes ribosomales y sus espaciadores internos, son las tcnicas ms
ampliamente utilizadas para el diagnstico de la CI. Tienen una mayor sensibilidad que
el cultivo y una especificidad comparable a ste. El mayor problema es que por el
momento ninguna prueba has sido ampliamente evaluada como para que sea utilizada
universalmente. La estandarizacin de los mtodos de extraccin y de deteccin del
ADN, permitir introducir estos mtodos al laboratorio micolgico de rutina.
La combinacin de los mtodos tradicionales (cultivos y estudios histopatolgicos) con
uno o ms de los nuevos mtodos descriptos permitir obtener la mxima informacin
para el diagnstico temprano y especfico de la CI.

- INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS.

Para definir un diagnstico es necesario que exista correlacin entre:

-

Examen directo (es muy importante)

Cultivos (es importante si el material es de un rgano estril)

Cuadro clnico.
Cuando se aslan levaduras de una muestra clnica es necesario determinar:

Si es un contaminante

Si est colonizando

Si est causando infeccin

Para ello se adoptan distintos criterios dependiendo de:
Hongo involucrado.
Tipo de muestra.
Caractersticas del paciente.

CRITERIOS A SEGUIR PARA EL DIAGNSTICO DE CANDIDIASIS:

EN

CANDIDIASIS

CUTNEA,

CANDIDIASIS

VAGINAL,

CANDIDIASIS

OROFARNGEA, CANDIDIASIS ESOFGICA, CANDIDIASIS MUCOCUTNEA

CRNICA:

- Presencia de lesin con signos clnicos compatibles,

- Examen directo positivo (levaduras y/o pseudomicelio) Y
- Cultivo positivo para levaduras.
EN CANDIDIASIS INVASIVAS:
-

CANDIDEMIA (PACIENTES NEUTROPNICOS):

Presencia de signos clnicos compatibles Y

Hemocultivo positivo (con retrocultivo negativo).
-

CANDIDIASIS PROFUNDA LOCALIZADA O CANDIDIASIS SISTMICA

(PACIENTE NEUTROPNICO):

Presencia de signos clnicos compatibles

Biopsias con examen directo Y/O cultivo positivo; orina por puncin
suprapbica positiva.
(No se considera como criterio diagnstico de Candidiasis sistmica un examen directo
positivo y/o cultivo positivo para levaduras de catter, retrocultivo, orina por sonda o
chorro medio, heces, BAL u otras muestras provenientes de sitios no estriles).

BIBLIOGRAFA
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