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2 tecnologas de Immunoproteomics
para el descubrimiento de biomarcadores
Los avances tecnolgicos en la investigacin de biomarcadores en
las ltimas dcadas han cambiado el paradigma de hypothesisdriven
ms enfoques basados en el descubrimiento. Esto ha sido
Iniciado por la disponibilidad de la secuencia del genoma humano,
tcnicas de separacin de alta resolucin de la protena, la protena/pptido
mtodos de deteccin como MS y ordenadores potentes y
software dedicado para realizar la bioinformtica. La combinacin de
de estos desarrollos permitieron el descubrimiento de previamente
cambios desconocidos en el cuerpo de fluidos o tejidos slo
mirando todas las protenas durante los Estados sanos y enfermos. Para
Figura 2. Principios de los enfoques immunoproteomics. Representacin esquemticade los pasos importantes durante tres immumoproteomics
principales:
enfoques basadosen. (A) 2-D pgina se basa en la separacin de las protenas basadoen su pI, seguido por separacin de gel basado en
peso molecular. A continuacin, las
protenas son transferidas desde el gel einmovilizadas en una membrana por borrar occidental. Protenas antignicas
(immunome) puede detectarse mediante la aplicacin de suero del paciente a lamancha, despus de que paciente limite IgGs se puede visualiz
ar por etiquetadosecundaria
anticuerpos. Antgenos son desnaturalizados y slo nonconformational epitopos(lineal) se pueden detectar en este enfoque (ver seccin 2.1 par
a
detalles). (B) la construccin de matrices de protena se basa en la separacin libre degel de protenas en las columnas de
la LC. Esto puede basarse en pI, sino tambin
hidrofobicidad, o una combinacin de caractersticas de
la protena para permitir lamxima resolucin. A continuacin, fracciones son vistas en una superficie slida enun
manera ordenada, despus de
lo cual fracciones antignicas pueden ser detectadospor anticuerpos etiquetados secundarios y suero del paciente. Si son lisados deprotena
losantgenos son obtenidos mediante un protocolo de nondenaturing, en principioen su forma nativa, permitiendo la deteccin de eptopos confor
macionales.
Enlugar de protenas fraccionadas, tambin pptidos (epitopos) o antgenospurificados pueden ser identificados para producir matrices de antge
no especficos.(C) antgeno
perfiles por Inmunocaptura MS se basan en la inmovilizacin de paciente IgGs, quedirectamente se utilizan para capturar y aislar antignica
protenas de una mezcla compleja de protenas. Los antgenos capturados sonperfilados por MS. Tambin en este caso, los antgenos con epito
posconformacionales
pueden ser detectados.
casos, estos tratamientos provocan una respuesta inmune que interfiere con laefectividad de
la droga. En principio, immunoproteomic
enfoques podran usarse para definir al paciente
respuesta inmune frente a un grupo de medicamentos relacionados (protena)
para facilitar la aplicacin del frmaco selectivo para optimizar individualizado
tratamiento.
4.3 diagnstico y pronstico de enfermedades autoinmunes
Enfermedades autoinmunes surgen de activacin errnea de la
sistema inmune, dando como resultado el ataque de uno mismo-protenas
dentro del cuerpo humano. Ejemplos de enfermedades autoinmunes
incluyen la artritis reumatoide (ar), autoinmune diabetes, tipo
psoriasis y lupus eritematoso sistmico (les), en
que una variedad de componentes de uno mismo son blanco de IgG o
Anticuerpos IgM [62, 63]. Adems, las enfermedades autoinmunes como
puede ocurrir durante las transfusiones de sangre o embarazo
Cuando se forman anticuerpos antirhesus que el rojo
clulas sanguneas del donante o del feto, respectivamente [64]. Por otra parte,
una reaccin autoinmune hacia componentes placentarios
se ha implicado en el desarrollo de preeclampsia
[65], que es una situacin peligrosa para embarazadas
mujeres. Adems, las enfermedades alrgicas pueden caracterizarse
por anticuerpos IgE contra alergenos. En todos estos
casos, immunoproteomic diagnstico y seguimiento de la enfermedad
es factible [66]. Para el serodiagnstico de SLE, Li et al [67]
construido un microarray multiplexado con cerca de 30 conocido
antgenos asociados a la enfermedad, compuesto por colgeno, fibringeno,
heparn sulfato, miosina, proteoglicanos y las histonas.
El uso de estas matrices revel distintos grupos de IgG/IgM
autoreactivity en el suero del paciente que podran ser vinculados a la enfermedad
actividad. Esto indica que este enfoque es capaz de diagnosticar
pacientes que estn en alto riesgo de dao severo del rgano y
puede guiar el tratamiento. En un estudio antgeno microarrays
que contenan ms de 200 protenas nativas fueron desarrolladas y
pptidos lineales que representaban candidato antgenos y eptopos
en RA Tambin el uso de estas matrices en estudios clnicos
demostr que diferentes perfiles de autoanticuerpo contra eptopos
o antgenos nativos eran diagnsticos de gravedad de la enfermedad
[68]. por otra parte, el uso de estas matrices de antgeno en combinacin
con citoquinas y perfiles habilitado clasificacin molecular
de pacientes con ar temprana y podra ayudar en la enfermedad
pronstico, guiando el tratamiento y en el seguimiento de las respuestas
al tratamiento [69]. Sin embargo, la causa exacta de la AR sigue siendo
desconocido y cubre un amplio espectro de diferentes enfermedades
con la coincidencia de los sntomas, que hace que el desarrollo
y uso de una variedad de antgenos de 'RA' diagnstico bastante compleja. En
otro enfoque, empleamos nuestro recientemente desarrollado
mtodo de Inmunocaptura MS para identificar protenas placentarias
reaccionaron con los anticuerpos del suero de mujeres embarazadas
con los sntomas de la preeclampsia (Fig. 3A). Primeros datos demostrados
que ciertos antgenos podran de hecho ser capturadas, mientras que se
no reaccionaron con los anticuerpos del suero de asintomtico
propsitos. Esto a pesar de que no son ptimos para analizar los paneles extendidosantgeno ensa
yos ELISA. En
futuro, ms especializado tecnologas de array de antgeno, tales
como sistemas de fase de lquido, puede reemplazar a ELISAs para la clnica
el uso de ensayos de antgeno multiplexada en los laboratorios clnicos.
A pesar de estos desafos, anticipamos el antgeno
perfiles de enfoques ser valiosa clnica
herramientas para la deteccin, diagnstico, pronstico y seguimiento
de la intervencin teraputica en las enfermedades autoinmunes,
infeccin y cncer.
Figura 4. Tubera de protemica para la identificacin
de cncer de colonantgenos bacterianos asociados. (A) Inmunocaptura
se realiza
por el aislamiento total suero IgG de cncer de colon
pacientes con perlas de protena A (1). A continuaci
n, son protenas de S. bovis
aplicado a los depsitos inmovilizados (2), despus d
e que las protenas
se lavan. (B) capturados antgenos son eluidos y ana
lizados
por MS. Spectra representan perfiles de este procedi
miento utilizando
suero de individuos sanos (panel superior), cncer d
e colon
pacientes (panel central) y sin
tratamiento S. bovis protena
extractos (panel inferior), en A2 de esta figura. Picos
de protenas
especficamente fueron capturados por IgGs de cnc
er de colon
pacientes estn marcados. Perfiles (C) antgeno de c
ontroles sanos,
plipo pacientes y pacientes de cncer de colon que
muestra diez S. bovis
picos de antgeno. Intensidad de pico alto se indica c
on rojo; verde
indica baja intensidad [32]. (D) identificacin de ant
geno escopeta
fue realizado por aislamiento de fracciones de prote
na de bovis de S. inmunognicas
utilizando SDS-PAGE. Este procedimiento fue SIDA
paralelo a por Inmunocaptura
experimentos con suero del paciente con el antgeno
de alta
ttulos contra los antgenos de inters. Siguiente, igu
al en el enriquecido
fracciones fueron digeridas con tripsina y alta
precisin
secuenciacin de pptidos fue realizada por LCMS/MS, despus de lo cual
las
protenas que fueron identificadas por bsquedas la
protena pblica
bases
de datos. Las
protenas identificadas en ambas fracciones eran co
nsideradas
significativa. De esta manera, HlpAwas identificado c
omo antgeno diagnstico
m/z 9563. Pptidos secuenciados por digestin trpti
ca de gelde S. bovis protenas estn indicadas en maysculas
rojas, mientras que HlpAderived
pptidos que tambin fueron encontrados por Inmun
ocaptura basado
secuenciacin de pptidos se indican en gradaciones
de color gris. Del mismo modo,
antgeno de picos de m/z 7748 y 7888 podra asigna