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CULTIVO E IDENTIFICACIN DE LOS HONGOS
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Aprender a determinar las caractersticas macro y microscpicas ms sobresalientes de
algunos grupos de hongos (mohos y levaduras) patgenos humanos y comprobar su alta
distribucin en el ambiente.
INTRODUCCIN
Dentro de la divisin Eukaria se encuentra el reino Fungi que incluye a los hongos. El
cuerpo de los hongos se denomina talo, ya sea unicelular o pluricelular. Los hongos se
dividen segn su morfologa:
a) hongos filamentosos formados por hifas (pluricelulares), a stos se les conoce como
mohos y estn formados por hifas microscpicas que consisten de filamentos tubulares
ramificados, con un crecimiento apical; las hifas pueden ser cenocticas (sin divisiones y
multinucleadas) o tabicados (divididas en segmentos). La masa de hifas constituye el
micelio. En las hifas se producen diferentes clases de esporas reproductivas, tales como
esporas asexuales (conidios, esporangiosporas) o esporas sexuales, como las
ascosporas y las basidiosporas.
b) las levaduras son unicelulares, se reproducen asexualmente por blastoconidios
(gemacin).
Dimorfismo es la condicin en la que un mismo hongo puede exhibir ya sea la forma de
levadura o la forma de hifa, dependiendo de las condiciones de crecimiento, sea
parsito o saprfito.
La presencia / ausencia de conidios y su tamao, forma y ubicacin son las
caractersticas principales utilizadas en el laboratorio para identificar las especies de
hongos en muestras clnicas.
CLASIFICACIN DE LOS HONGOS HUMANOS
Los hongos patgenos humanos se encuentran en tres divisiones dentro del reino
Fingi:
Zygomycota
(zigomicetos),
Ascomycota
(ascomicetos)
Basidiomycota
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(basidiomicetos). Los Zigomicetos se caracterizan por poseer micelios cenocticos notabicados y reproduccin sexual mediante zigosporas. Los Zigomicetos del orden
Mucorales causan infecciones graves, de rpida evolucin y frecuentemente
fulminantes en pacientes inmunodeprimidos. Las especies ms frecuentes pertenecen
al gnero Rhizopus y a Mucor.
Los Ascomicetos se caracterizan por tener hifas tabicadas y producir ascosporas
endgenas en ascas. Pueden ser unicelulares o pluricelulares. Son la divisin ms
grande dentro del reino de los hongos y tambin la que cuenta con un mayor nmero
de patgenos humanos, entre ellos Candida albicans y Aspergillus sp., ltimamente
Fusarium y Scedosporium.
Los Basidiomicetos se caracterizan por producir basidiosporas en basidios, como
resultado de una reproduccin sexual. A este grupo pertenecen las setas comestibles.
El gnero Cryptococcus se compone de organismos unicelulares encapsulados,
responsables de la criptococosis que es una micosis sistmica.
CLASIFICACION DE LOS HONGOS, SEGN EL AREA ANATMICA AFECTADA
Uno de los mtodos ms comunes de clasificar las micosis humanas, se basa en la
localizacin del hongo en el husped, lo que refleja en parte su variable grado de
severidad y su grado de invasividad. De acuerdo con este tipo de enfoque, las micosis
se consideran superficiales (cutneas: piel, uas y cabello), subcutneas (capas
superiores de la piel, los huesos, los tendones y los msculos) y profundas (son
sistmicas, causadas por hongos que infectan pulmn y se diseminan a todo el
cuerpo).
Los hongos patgenos oportunistas que normalmente no estn asociados como
patgenos en personas inmunocompetentes, pueden causar infecciones severas en las
personas inmunodeficientes. As tambin, llegan a producir enfermedades que varan
en su gravedad, pudiendo asociarse con una infeccin superficial de la piel o las
mucosas hasta llegar a producir una afectacin sistmica con afectacin de mltiples
rganos internos. Ejemplos comunes de hongos oportunistas son Candida albicans,
Aspergillus, Cryptococcus y Pneumocystis carinii.
Aspergillus
Penicilium
levaduras
IDENTIFICACIN DE LEVADURAS
Forman colonias semejantes a las bacterianas. Para la identificacin de levaduras se
requiere conocer adems de la morfologa, la determinacin de caractersticas
fisiolgicas y bioqumicas, especialmente su accin sobre azcares. La identificacin de
la especie de toda levadura aislada en sangre o en cualquier otro lquido corporal
estril est plenamente justificada. Tambin es conveniente la identificacin de las
levaduras de otras procedencias, sobre todo cuando ocurre de forma reiterada en
diferentes muestras clnicas del mismo paciente, y siempre que se asuma que se trata
de un organismo responsable de patologa.
La mayora de los organismos levaduriformes crecen fcilmente en un gran nmero de
medios de cultivo usados rutinariamente en el laboratorio de microbiologa (agar
sangre, agar chocolate, agar Cled, etc.). Sin embargo, el AGS, con o sin antibiticos
aadidos, es el medio de aislamiento por excelencia para la identificacin de levaduras.
En el medio AGS las colonias de levaduras suelen ser completas, ligeramente
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abombadas o planas, de consistencia cerosa, lisa o rugosa, con olor dulzn agradable,
volvindose ms pastosas a medida que la colonia envejece. Por lo general, las
colonias de levaduras no desarrollan micelio areo, aunque en ocasiones pueden
aparecer prolongaciones aracneiformes en la periferia de las colonias.
Identificacin convencional: Si se visualiza crecimiento en cualquier medio que sugiera
posibilidad de levaduras, se realiza un frotis en fresco. Si en el mismo se observan
levaduras, se procede a la identificacin mediante subcultivo a un medio cromognico,
Cromocandida. En el caso que no se trate de ninguna de las especies que este medio
identifica, se procede a hacer la identificacin mediante alguno de los mtodos
comerciales. La identificacin bioqumica debe completarse con una identificacin
morfolgica mediante un subcultivo al medio agar harina de maz con o sin Tween 80.
Si se observa un micelio areo definido, debe considerarse la posibilidad de que se
trate de un hongo dimrfico o de ciertas especies de levaduras que pueden formar
micelio verdadero como Geotrichum, Dipodascus o Trichosporon. Una colonia de
aspecto y consistencia mucoide sugiere la formacin de cpsulas y puede ser el paso
inicial para la identificacin de C. neoformans. Las colonias de color rojoanaranjado o
naranja, de aspecto cremoso o rugoso son caractersticas de las especies del gnero
Rhodotorula ( rhodo: rojo), color que manifiesta esta levadura por su riqueza en
carotenoides.
MATERIALES Y MTODOS
I. AISLAMIENTO DE HONGOS DE DIFERENTES MATERIALES
Mantenga abierta una caja de Sabouraud-agar en el jardn, en alguna habitacin, o en
cualquier otro lugar, durante 15 min. Despus de este tiempo tpela e incbela a
temperatura ambiente o a 28oC, durante una semana, hasta observar el desarrollo de
colonias de hongos, las cuales pueden mostrar diferentes colores, con aspecto
algodonoso, aterciopelado, velloso, polvoso, granuloso, etc.
1 En otra caja espolvoree unas cuantas partculas de polvo del jardn e incube igual.
2 Guarde en una bolsa de plstico unas fruta y verduras, incube igual y revise
peridicamente, hasta observar el desarrollo de colonias de hongos en los vegetales.
3 En una caja Petri coloque tierra del jardn e introduzca verticalmente hasta la mitad,
varias uas y pequeos manojos de cabellos. Humedezca la tierra con agua
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destilada. Incube igual, por varios das. Vigile diario y vuelva a regar la tierra con agua
destilada, para impedir que se seque, hasta observar desarrollo de hongos, mismos
que colonizarn las uas y pelos. Guarde este cultivo de tierra, para observarlo en
la siguiente prctica referente a Micosis Superficiales (no se utilizar en esta
prctica).
4 Compare las colonias desarrolladas entre s, tanto en los medios de cultivo como en
los vegetales. Note las diferencias de la morfologa colonial. Haga dibujos de cada
observacin.
II. IDENTIFICACIN DE LOS HONGOS AL MICROSCOPIO
A partir de levadura para pan o cerveza, haga observaciones entre porta y cubre, en una
gota de lactofenol. Haga dibujos.
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES
PRCTICA No. 2
MICOSIS SUPERFICIALES
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Que el alumno observe al microscopio las diferencias macro y microscpicas de los
hongos causantes de infecciones superficiales y que conozca las tcnicas de diagnstico.
INTRODUCCIN
En las infecciones cutneas del hombre por hongos Dermatophytos se afectan piel y sus
anexos (pelos y uas). En general, el dao est limitado a las capas cornificadas muertas,
pero pueden presentarse diversos cambios patolgicos en el husped, debido a una
reaccin al hongo y sus productos. Causan enfermedades denominadas tias, incluyen
los gneros Epidermophyton, Microsporum y Trichophyton, con varias especies. Causan
lesiones extendidas en forma circular o de anillo, son queratinolticos y se reproducen por
conidios. La mayora se desarrollan en la tierra como saprfitos; las especies que afectan
al hombre estn restringidas a algunas zonas, siendo infludas por factores propios del
husped.
Los hongos dermatophytos en la piel, crecen en la capa crnea de manera radiada,
formando lesiones anulares con intensa reaccin inflamatoria, la cual conduce a la
destruccin y eliminacin del hongo del rea central, el micelio fngico contina su
crecimiento de manera centrfuga hacia la piel no infectada. Las lesiones se
transforman en placas anulares con un centro claro y el proceso inflamatorio se
distribuye slo en la periferia, a lo que se denomina borde activo, constituido por
ppulas y/o vesculas.
La infeccin inicial del cuero cabelludo es por la invasin del micelio dentro de la vaina
externa del pelo, con crecimiento hacia el bulbo del pelo, mismo que se detiene en la
zona de queratinizacin incompleta. El pelo se debilita y se rompe, dejando el pelo de
pocos milmetros sobre la superficie de la piel (pseudoalopecia). En la infeccin de las
uas, la destruccin de la queratina es por la formacin de canales, dentro de los
cuales se presentan hifas. Es una manera de evidenciar la capacidad queratoltica de
los hongos.
Existen otras clases de micosis superficiales causadas por hongos que se desarrollan
demasiado lejos del tejido vivo, en las cuales no hay patologa por la presencia del hongo
y suele haber una falta de respuesta celular del husped. En estos casos los pacientes
pueden no darse cuenta del trastorno. Aqu se incluyen las micosis siguientes:
- "Pitiriasis versicolor" causada por la levadura lipoltica Malassezia furfur, una infeccin
crnica, asintomtica, puede haber caspa en la cabeza o en reas cutneas en trax,
espalda y miembros, que cambian de color. "Costras de leche" en el cuero cabelludo de
neonatos.
- "Piedra" es causada por Trichosporon beigelii y Piedra hortae. Es una infeccin del talo
piloso, procuciendo ndulos firmes como costras arenosas blancas o negras.
- "Tia negra" es causada por Exophiala wernekii. Es asintomtica, con mculas oscuras
no-escamosas en la piel.
MATERIALES Y MTODOS.
I. TOMA DE MUESTRAS DE PACIENTES:
1) Piel. A partir de piel cabelluda, se pueden recolectar los pelos de las reas lesionadas,
Para recolectar las escamas de la piel, se utilizan dos portaobjetos, con uno de ellos se
raspa en el lmite de la lesin, colectando la muestra desprendida en el otro portaobjetos
2) Uas.
II. IDENTIFICACIN MICROSCPICA DE DERMATOFITOS EN LAS MUESTRAS.
1) Haga una preparacin de la muestra de Pelos. Se colocan entre porta y cubre con una
gota de KOH al 20 %, mantenindola durante 15-20 min a temperatura ambiente.
Observe al microscopio a 10 y a 40 X. Observe la abundancia de esporas y filamentos
dentro del pelo y sobre l. Haga dibujos e identifique el gnero, comparando con la
literatura, con base en el tipo de micelio y de las esporas.
2) Preparacin de escamas de piel o uas. Se montan igual entre un portaobjetos y un
cubreobjetos, con KOH. Con el microscopio se pueden observar las clulas parasitadas
por hifas. En las uas se pueden observar filamentos ms abundantes, mezclados como
una red, con muchas artrosporas en cadenas. Haga dibujos. Identifique el gnero.
3) Preparacin de pelos y uas incubados en tierra (a partir de la prctica anterior).
Igualmente, monte pelos y uas entre portaobjetos y cubreobjetos. Identifique los hongos
y comprelos con los observados en las muestras anteriores.
HONGOS DERMATOFITOS
1. Haga dibujos con las diferencias morfolgicas de las diferentes especies de
dermatofitos.
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES
PRCTICA No. 3
MICOSIS SUBCUTNEAS
OBJETIVO DE LA PRCTICA.
Que el alumno compare las diferencias macro y microscpicas de los hongos y bacterias
causantes de micosis subcutneas.
INTRODUCCIN
En las micosis subcutneas el agente causal penetra por heridas. Las micosis de este tipo
ms conocidas en Mxico son los micetomas, la esporotricosis y la cromomicosis.
- Micetoma. Es un sndrome, que se caracteriza por localizarse inicialmente en el tejido
subcutneo y de evolucin crnica. Clnicamente, se observa un aumento de volumen en
la regin afectada y la formacin de fstulas, por las que drena un material seropurulento,
conteniendo los "granos". Estos, contienen en su interior conglomerados de hifas del
patgeno con aspecto de bolas de estambre.
En los micetomas, cuando el agente etiolgico es una bacteria actinomicetal, se le
denomina actinomicetoma, por ejemplo: Nocardia brasiliensis, Nocardia asteroides,
Actinomadura madurae, Actinomadura pelletieri, Streptomyces somaliensis. En Mxico la
mayora de los micetomas son causados por bacterias, principalmente Nocardia. El
Eumicetoma es causada por hongos, y es causado por verdaderos hongo, tales como
Madurella mycetomatis, Madurella grisea, Pyrenochaeta romeroi, Scedosporium
apiospermum.
Diagnstico del micetoma: - examen directo al microscopio de la secrecin de una fstula
que est activa (la que cause prurito). Si est cerrada se abre con ayuda de una aguja de
diseccin; el exudado se recoge con el asa para cultivo y para observacin en un
portaobjetos. Los granos fngicos aunque son muy pequeos, pueden distinguirse a
simple vista, a diferencia de los de producidos por bacterias del tipo de los
actinomycetales, que slo pueden observarse bajo el microscopio, productores de una
enfermedad indistinguible, motivo por el cual se incluyen en micologa.
- biopsia de las lesiones e histopatologa
- cultivo de las lesiones o de un fragmento de biopsia
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PRCTICA No. 4
MICOSIS SISTMICAS
OBJETIVO DE LA PRCTICA.
Determinar las diferencias macro y microscpicas de los hongos causantes de micosis
profundas y conocer las tcnicas de diagnstico.
INTRODUCCIN.
Los hongos ms comunes causantes de infecciones generalizadas o sistmicas son
Histoplasma
capsulatum,
Coccidioides
immitis,
Blastomyces
dermatitidis
TCNICAS DE DIAGNSTICO
1. Examen directo: Puede ser a partir de muestras de esputo, lavados bronquiales,
exudados de las lesiones secundarias, escamas, etc. Es posible observar las esfrulas
de Coccidioides, o las levaduras correspondientes a la fase parsita de otros hongos
sistmicos.
2. Cultivo: De las mismas muestras tomadas para examen directo, se siembra una
parte en Sabouraud dextrosa agar, incubando a 28 C por ms de una semana. El
micelio desarrollar los conidios correspondientes a cada gnero. Para Coccidioides no
basta la observacin micrscopica, por su similitud con otros hongos, debiendo recurrir
a tcnicas ms exactas, como pruebas serolgicas y estudios de DNA.
3. Pruebas inmunolgicas:
- IDR a la histoplasmina: solo tiene valor de primocontacto. Es positiva 4-8 semanas
post-infeccin.
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PRCTICA No. 5
MICOSIS OPORTUNISTAS
OBJETIVO DE LA PRCTICA
Que el alumno se familiarice con los hongos oportunistas ms comunes y con las tcnicas
de laboratorio para su diagnstico.
INTRODUCCIN
En las micosis oportunistas no existe una lista precisa de hongos patgenos, ni hay
especificidad de ninguno de ellos por lo que respecta a rganos o tejidos. Casi cualquier
hongo saprfito del suelo o de los que constituyen la flora normal, puede transformarse en
parsito en sujetos inmunocomprometidos total o parcialmente; por lo tanto, las vas de
entrada tambin son variadas, ya sea travs de piel intacta, heridas o inhalacin.
Antiguamente estas enfermedades eran raras, pero en aos recientes se han vuelto cada
vez ms comunes y de gran significacin mdica, en forma paralela al incremento de
pacientes en terapia intensiva, con VIH, cancerosos o que reciben trasplantes, uso de
antibiticos, citotoxinas, inmunosupresores, esteroides, as como resultado de otros
procedimientos que provocan disminucin de la resistencia del husped. Son
microorganismos con baja virulencia, y es necesario que las defensas del husped estn
muy disminudas antes de que se establezcan como patgenos.
La candidosis o candidiasis es una micosis causada por diversas especies de
levaduras del gnero Candida. Cualquier tejido puede ser afectado por lo que se
presentan diversos cuadros clnicos, cada uno de ellos asociado directamente al estado
inmunolgico del paciente. Las candidosis de mucosas y piel son las ms frecuentes,
mientras que las sistmicas son de evolucin aguda o crnica y generalmente severas.
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varias fuentes naturales como vegetales, pero es notoria su asociacin con deshechos
aviarios, especialmente excrementos de palomas.
Candida
Aspergillus
Cryptococcus
En las micosis oportunistas se requieren diagnsticos rpidos para evitar en lo posible
que el paciente desarrolle una infeccin diseminada, por lo que el tiempo va a ser
crucial. El mdico, debe evaluar los parmetros clnicos y saber si existe realmente una
concordancia entre el resultado del laboratorio con la sintomatologa del paciente; Por
lo general estas micosis son insidiosas y algunas veces no pueden ser diagnosticadas
sino hasta la necropsia.
MATERIALES Y MTODOS
1. Haga dibujos detallados de hongos oportunistas (mencionados en introduccin de la
prctica), tomando en cuenta sus estructuras reproductivas, principalmente los conidios,
compare con la literatura para identificarlos.
RESULTADOS, DISCUSIN Y CONCLUSIONES.
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