TP1 BMC

ROMILA ISMAIL
1.1. a) Os resultados da pista 1 correspondem ao ensaio i pois o
nico ensaio que digere o plasmdeo apenas uma vez e,
consequentemente apenas forma um pedao nico de DNA. Os
Resultados da Pista 2 j correspondem ao ensaio ii pois:
ensaio ii:

ensaio iii:

c)
2.1 A nica hipotese que permite a formao de uma molcula de
DNA recombinante com o DNA I a) pois as bases de nucletidos
tm que ser complementares.

2.2 DNA Ligase

2.3 Tecnica PCR
3. 1 a)

b) Codo Start:

Codo STOP:

c) 5UTR tudo at ao codo START; 3UTR do codo STOP at ao

fim

3.2
4. 1 Isolamento da sequncia de cDNA a ser clonado;
2 Uso de m plasmdeo que sirva de vetor, com o gene que confere
resistncia ao meio seletivo (Ampicilina)
3 Seccionar com a mesma nuclease o plasmdeo e o fragmento de
DNA e formar plasmdeo recombinante
4 Introduo do plasmdeo recombinante na clula
hospedeira/plataforma de expresso
5 Coloca se as bacterias em gel de agarose e no meio seletivo
antibacteriano e as selecionadas multiplicam-se, replicando o
plasmdeo recombinante.

4.2 Produo mais rentvel e mais rpida de protenas para vacinas,

hormonas de substituio, frmacos no geral, seres transgnicos,
etc...
5. 1 Uso da BamHI para clonagem
pGEX-T2: 4948 pares de bases; BamHI 930; EcoRI 940
- Digerimos com BamHI para introduzir o cDNA

cDNA:
- clivado com BamHI (pois temos que incluir o codo START e o
codo de terminao) obtm-se um fragmento de aprox. 730
bp

20
0 280

48
0

450

93
0

Se inserirmos o Fragmento de cDNA no plasmdeo obtemos um

plasmdeo recombinante com 5678 bp no total;
5.3 Para verificar a se a insero foi feita no sentido correto
digerimos o plasmdeo recombinante com EcoRI e verificamos
os resultamos em eletroforese
Caso esteja a orientao no sentido correto a EcoRI vai clivar em
1231 e em 1691 e forma-se dois fragmentos de comprimentos 460
e 5239.
Caso esteja no sentido errado a EcoRI vai clivar em 1401 e 1691 e

280

EcoRI - 1210
BamHI - 930

5678 bp

cDNA

EcoRI - 1670

BamHI - 1660

forma-se dois fragmentos de comprimentos 290 e 5409

SENTIDO CORRETO:

730

SENTIDO
INCORRETO:

280

BamHI - 930

EcoRI - 1380
EcoRI - 1670

5678 bp

cDNA

BamHI - 1660

5.5 Procedimento a realizar para a obteno da protena

desejada:

- Isolamento da sequncia de mRNA que corresponde protena de

interesse de uma clula que a expresse.
- Uso da transcriptase reversa para se obter cDNA
- Seccionar o cDNA em 2 extremidades cegas por nucleases de
restrio
- Digerir o vetor com as mesmas nucleases de restrio
- Introduo do cDNA no vetor com DNA ligase
- Transformao da clula hospedeira (plataforma de expresso)
- Insero da clula num meio nutritivo de agarose e seletivo com
ampicilina
- Amplificao dos clones resistentes ampicilina
- Isolamento do DNA plasmdico
- Verificao da orientao correta da cadeia
- Testes de sequnciao do DNA
- Lise das clulas hospedeiras e purificao das protenas dos
restantes lisados recorrendo a: colunas de cromatografia (para a
separao da protena com GST do resto), Glutatio reduzido (para
reagir com a protena, saindo da coluna) e proteases de restrio
(para separar o glutatio reduzido da protena)
- Identificao apropriada da protena