DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

La determinacin de la actividad enzimtica en alimentos es un aspecto

importante, entre otras razones, porque:
a)

Es un indicador del estado higinico y conservacin de los alimentos, en

la medida en que algunos microorganismos que contaminan y se
desarrollan en los alimentos son capaces de producir determinadas
sustancias que alteran su calidad. Entre estas sustancias se encuentran
las enzimas que los microorganismos generan para poder aprovechar
los sustratos que encuentran en el medio; por ejemplo, la reductasa, la
peroxidasa, etc.

b)

La actividad enzimtica es un indicador de la eficiencia del tratamiento

trmico en algunos alimentos. Por ejemplo, la actividad de la fosfatasa,
la peroxidasa y la aldehdo-reductasa se usan para el control de la
pasteurizacin y esterilizacin de la leche; la prueba de la ureasa
residual en soya se usa para determinar si las sustancias con actividad
antibiolgica han sido destruidas totalmente. La actividad de la
peroxidasa es importante tambin para determinar si el tratamiento de
blanqueado o escaldado en algunos alimentos ha sido suficiente.

1.

CATALASA

La presencia de catalasa junto con la reductasa sirve para conocer el estado de

conservacin de la leche, ya que el crecimiento o desarrollo microbiano en la
leche conlleva a la produccin de estas enzimas por los microorganismos.
La catalasa reduce al perxido de hidrgeno (HO) produciendo O y HO:
2 HO

catalasa

2 HO

Prueba de la catalasa en la leche

En un catalasmetro apropiadao, que permite medir el volumen de oxgeno

que se desprende, colocar 10 ml de leche y 5 ml de agua oxigenada (3 %).

Mantener durante 2 horas a 37 C y medir luego el volumen de gas que se

desprende.

Expresar el resultado en ml de O.

La leche normal cruda desprende hasta 30 ml de O %, la pasteurizada hasta 6

ml y la leche cocida o esterilizada no presenta desprendimiento (SchmidtHebbel y Pennacchiotti, 1982).

Prueba de la catalasa en vegetales deshidratados

-

Tomar un tubo de aproximadamente 1 pulg. de dimetro y 6 pulg. de

altura y llenar con pequeos trozos del vegetal hasta ms o menos 1
pulg. de altura.

Cubrir con agua y dejar reposar por 10 min.

Agregar igual volumen de perxido de hidrgeno al 3% y mezclar

agitando suavemente.

La prueba es positiva si hay produccin de oxgeno (Ranganna, 1977).

2.

PEROXIDASA

La investigacin de la peroxidasa ha sido usada para evaluar la eficiencia del

escaldado o blanqueado de verduras y tambin en
el control de la
pasteurizacin de la leche: a la temperatura de pasteurizacin de la leche la
lactoperoxidasa se inactiva, pero se regenera; en cambio, si la leche es
sobrecalentada (ms de 80-85 C), la peroxidasa pierde su actividad en forma
definitiva (Schmidt-Hebbel y Pennacchiotti, 1982).
La peroxidasa posee la propiedad de regeneracin, o sea que al inactivarla por
medio del calor, recupera parcialmente su actividad despus de un cierto
tiempo. Esto ha sido explicado, segn Schmidt-Hebbel y Pennacchiotti (1982),
porque la fraccin proteica de la enzima sufre una desnaturalizacin slo
parcial de su estructura terciaria, si el calor se aplica un tiempo muy corto,
producindose luego una reversin de la protena a su estado normal por
recombinacin de sus grupos hidrgenos o sulfhidrlicos.
La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidacin de ciertos compuestos
dadores de hidrgeno, como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromticas
(o-fenilendiamina) slo en presencia de perxido de hidrgeno (HO). El
sustrato oxidable ms usado es el guayacol, el cual es oxidado a un complejo
coloreado de tetraguayacol en presencia de peroxidasa: La velocidad de
formacin del color rojo ladrillo puede ser utilizada como medida de la actividad
enzimtica por lectura espectrofotomtricas de las absorbancias en funcin al
tiempo.
La actividad de la peroxidasa depende del vegetal, del sustrato oxidable que se
emplea como reactivo, del pH y de la temperatura a la que se trabaja. Esta
enzima es muy estable y su inactivacin requiere mucho ms tiempo, hasta 5
min. a 85 - 95 C.

Prueba de la peroxidasa en vegetales deshidratados

Tomar una pequea cantidad de muestra y reconstituir en agua fra por

10 a 15 min.

Eliminar el exceso de agua y colocar pequeos trozos de la muestra

reconstituida en un tubo de ensayo de 1 pulg. de dimetro hasta ms o
menos 1 pulg. de altura.

Agregar 10 ml de agua y 1 ml de solucin de guayacol (2-metoxifenol) al

1% (en alcohol de 95) y 1 ml de solucin fresca de perxido de
hidrgeno al 0.5%.

Agitar el tubo para mezclar y observar la reaccin al cabo de 5-10 min.

La reaccin ser:
Negativa: Si no hay decoloracin, o aparecen pequeas manchas
rojas, o manchas alrededor de las venas.
Ligeramente positiva: Si aparecen manchas marrones esparcidas
por todo el tejido, o enmarronamiento pronunciado de algunos trozos
del producto.
Positiva: Si se produce una coloracin marrn rojiza ms
pronunciada que el caso anterior (Ranganna, 1977).

3.

FOSFATASA

La fosfatasa es una enzima que se encuentra en forma natural en la leche.

Cuando la leche es pasteurizada, esta enzima es destruida, por lo tanto, la
presencia de ella en una leche supuestamente pasteurizada indicara un mal o
insuficiente proceso trmico.
Determinacin de fosfatasa en la leche
La muestra de leche se mezcla con fenilfosfato disdico y buffer carbonato.
Esta mezcla se coloca en una bolsa de dilisis, se calienta hasta 37 C y se
mantiene as durante una hora. La fosfatasa presente reaccionar con el
fenilfosfato para liberar fenol, el cual ser dializado a travs de la bolsa. Luego
el fenol se hace reaccionar con CuSO4 y 2,6 dicloroquinonacloramina para
producir un compuesto coloreado, el cual se lee en un espectrofotmetro a 650
nm.
El proceso de dilisis permite separar el fenol de las protenas, las cuales
interfieren en el desarrollo del color ( Meloan y Pomeraz, 1980):

4.

POLIFENOLOXIDASA

Estas enzimas, presentes en los tejidos vegetales, son las principales

causantes del pardeamiento enzimtico, el cual ocurre cuando las frutas,
verduras y tubrculos se cortan o golpean. Las polifenoloxidasas, que
contienen cobre en su parte protica, catalizan la oxidacin de compuestos
fenlicos a quinonas, las cuales continuan oxidndose por la presencia del
oxgeno del aire sobre el tejido recin cortado, formndose pigmentos oscuros,
melanoides, por polimerizacin.
Los sustratos responsables del pardeamiento enzimtico son de tipo
ortofenlico, entre ellos los siguientes: cido clorognico, tirosina, catecol,
cido cafeico, cido glico, hidroquinonas, antocianos, flavonoides. Mientras
que las enzimas responsables son: tirosinasa, catecolasa, lacassa, ascrbicooxidasa y polifenol-oxidasas (Schmidt-Hebbel y Pennacchiotti, 1982).
Para que se produzca el oscurecimiento enzimtico es necesario la presencia
de los tres componentes: enzima, sustrato y oxgeno.
Determinacin de polifenoloxidasa (en peras y manzanas)
El mtodo se basa en medir espectrofotomtricamente, a intervalos de 1
minuto, el aumento en la absorbancia de una mezcla de la solucin enzimtica
con cido clorognico como sustrato. Al graficar la absorbancia contra el
tiempo, los resultados se expresan en aumento de absorbancia por minuto por
gramo de protena.
Procedimiento

En un matraz de 125 ml colocar 25 ml de solucin tampn pH 5.2 y 10 ml de

solucin de cido clorognico. Mezclar suavemente y mantener por 10
minutos a 30 C.

Agregar 5 ml de solucin enzimtica ajustada a 0.1 mg/ml de protena,

agitar suavemente por unos segundos y volver a llevar a bao de agua a 30
C (sin agitacin posterior).

A intervalos de 1 minuto o 30 segundos leer el aumento de la absorbancia a

390 nm.

Como blanco se usa una mezcla igual a la anterior, pero hervida por 10
minutos , reconstituyendo su volumen original con agua.

Clculos
Para expresar la actividad enzimtica se grafican la absorbancia por minuto y
por gramo de protena contra el tiempo (cada minuto) y se usa la pendiente
inicial de la curva obtenida (porcin recta).
Determinacin de protenas
En un tubo del fotocolormetro Klett-Summerson se colocan 5 ml de la solucin
enzimtica sobrenadante, se agregan 5 ml de cido tricloroactico al 6 % y se
mide la extincin a 515 nm, usando un filtro verde N 54. Se usa como blanco
una muestra de 5 ml de agua ms 5 ml de cido tricloroactico al 6 %. Los
valores obtenidos se pueden comparar con los de una solucin tipo de
seroalbmina de concentracin igual a 2mg /ml. El extracto enzimtico original
puede tener una concentracin en protenas mayor que 0.1 mg/ml; para poder
ajustarla despus a esta cifra se diluye con cloruro de potasio 0.3 M (SchmidtHebbel y Pennacchiotti, 1982).
Reactivos:

Solucin de enzima
Para extraer la enzima se pesan 70 g de manzana o pera mantenidas, por
lo menos 2 horas antes, en congelador a 0 C; luego se mondan y trozan.
Se homogeniza en mezcladora elctrica con KCl 0.3 M a 4 C, que acta
como lquido de extraccin. La mezcla se centrifuga por 30 minutos a
10,000 rpm en centrfuga refrigerada a 0 C. El sobrenadante se filtra al
vaco y luego se enrasa a 200 ml con la solucin de KCl.

Cloruro de potasio 0.3 m

Solucin tampn pH 5.2 :

23.3 ml de solucin de cido ctrico 0.1 M (19.21 g en 1 litro) ms 26.7 ml
de solucin de fosfato disdico 0.2 M (53.65 g de fosfato disdico ms agua
en 1 litro) ms agua destilada c.s.p. 100 ml.

5.

Solucin de cido clorognico 0.00333 M en solucin tampn.

PECTINO-ESTERASA (P.E.) O PECTINO-METIL-ESTERASA

Esta enzima produce la hidrlisis de los grupos metilo de la pectina, formando

cido pctico o poligalacturnico y metanol, al actuar de preferencia sobre los
enlaces metlicos, vecinos de grupos carboxlicos libres. Estas enzimas, al
degradar la pectina, son las causantes de la prdida de las caractersticas de
turbidez de algunos jugos y nctares, por lo que stos deben ser calentados
para inactivar dichas enzimas.
Determinacin de la actividad de la pectino-esterasa (P.E.)
La pectino-esterasa hidroliza los grupos metoxilos de la molcula de pectina,
por sto, es posible medir la liberacin de los grupos carboxilos por titulacin
potenciomtrica con lcali.
a)

Obtencin del extracto homogeneizado:

Se pesan 175 g del material (cebolla, naranja, pulpa y ccara) y se le agrega 5

g de cloruro de sodio (para activar la enzima y ayudar a su extraccin) y se
homogeniza en una juguera elctrica.
b)

Reactivos:

Sloucin de pectina al 1 % (como sustrato) disuelta en cloruro de sodio 0.2

M.
Solucin de hidrxido de sodio 0.01 N.
c)

Procedimiento:

Se miden 2 ml de jugo de limn o 5 ml de zumo de papa (rallada y filtrada).

Si se trata de cebolla se toma 1 parte del homogeneizado y 1 parte de agua;
en el caso de la naranja se toma 1 parte del extracto crudo y 2 partes de
agua. Se agita por 4 min. , dejando en reposo por un momento y luego se
toman alcuotas para efectuar la reaccin como sigue:

Se toman 50 ml de la solucin de pectina al 1 % y se le agrega 10 ml de la

solucin del extracto, se coloca en bao de agua a 30 C. Se ajusta el pH a

7.5 con Na OH 0.01 N. Cada 5 min., durante 30 min., se ajusta el pH

anotando en cada intervalo la cantidad acumulativa de lcali gastado. Las
curvas se obtienen graficando los ml gastados de lcali versus tiempo.
Se trabaja por duplicado y se calcula el promedio. El blanco, preparado con la
solucin enzimtica calentada a bao de agua hirviente por 5 min., no debe
presentar gasto de hidrxido de sodio, de lo contrario, su valor debe ser
restado del consumo total.
d)

Clculos:
G x 3.1
Unidades de pectino-esterasa/ml de solucin enzimtica = ---------E
Donde,

G
E
3.1

= Gasto total de ml de NaOH 0.1n

= Mililitros aplicados de la solucin de enzima
= Factor de Kertesz

Las unidades de pectino-esterasa por ml de solucin enzimtica tambin

representa los mg de grupos metoxilo separados por 1 ml de solucin de
enzima en 30 minutos.
6.

UREASA

La ureasa es una enzima que se encuentra en algunos productos vegetales,

como por ejemplo en la soya, la cual, segn Cheftel et al. (1989), contiene una
ureasa termolbil, cuyo grado de inactivacin es un indicador de la destruccin
de inhibidores de proteasas durante el tratamiento trmico de las tortas de soya
destinadas a la alimentacin animal.
La ureasa cataliza la siguiente reaccin (Pomeraz y Meloan, 1982):
NH
O=C

HO

CO + 2 NH

NH
Ambos productos de esta reaccin pueden ser medidos y, por lo tanto, usados
para la determinacin del contenido de rea de una muestra. El CO puede ser
medido gasomtricamente o colorimtricamente; el amonaco puede ser
determinado directamente despus de la destilacin sobre un recipiente
adecuado, o por titulacin despus de una difusin. El amonaco tambin
puede ser determinado colorimtricamente con el reactivo de Nesslers despus
de su separacin por destilacin o por cromatografa de intercambio inico.
La reaccin que cataliza esta enzima sobre la rea, la liberacin de amonaco,
es el principio sobre el cual se basa la siguiente prueba (Schmidt-Hebbel y
Pennacchiotti, 1982) para determinar la presencia de ureasa:

a)

b)

Reactivos

Substrato:
C (pH 6.1).

HCl 0.1 N

Solucin de rea 0.17 M en agua bidestilada, a 30

Preparacin del extracto problema

El material a ensayar (poroto de soya) se muele, y se extrae la enzima con

agua destilada a temperatura de 30 C. Se filtra o centrifuga, usndose el
sobrenadante para la determinacin de la actividad enzimtica.
c)

Procedimiento:

Colocar 50 ml del substrato (solucin de urea) en un matraz Erlenmeyer y

agregar una alcuota del extracto enzimtico en estudio.

Dejar la mezcla a 30 C durante 10 minutos.

Valorar el amonaco liberado con HCl 0.1 N, ajustando el pH a 6.1 con

ayuda de un potencimetro.

d)

Unidad enzimtica (U)

1 U corresponde a la cantidad de enzima que bajo las condiciones de ensayo

disocia 1 micromol de rea por minuto.
7.

ACTIVIDAD DIASTASICA

La Actividad Diastsica es la capacidad que tienen las enzimas diastsicas

para convertir el almidn en azcar. Las principales enzimas diastsicas en una
harina son las y amilasas.
A la Actividad Diastsica tambin se le conoce como Indice de Diastasa o
Poder Diastsico.
En el caso de la miel, la Actividad Diastsica se define como la cantidad, en
centmetros cbicos, de una solucin de almidn al 1 % hidrolizada en una hora
por la enzima contenida en 1 g de miel.
8.

REDUCTASA

La reductasa es una enzima que puede estar presente en la leche y que puede
tener su origen como producto de la accin microbiana, y bajo la forma natural

como aldehdo- reductasa (componente de la leche). Por lo tanto, la

determinacin de la reductasa sirve para inferir sobre el estado higinico de la
leche, as como para controlar el tratamiento trmico (pasteurizacin) al que ha
sido sometida la leche.
Prueba de la reductasa

En un tubo de ensayo, grande y estril, verter ascpticamente 20 ml de

leche (dentro de las 4 horas siguientes a la extraccin de la muestra) y 1 ml
de solucin de azul de metileno (mezcla de 5 ml de solucin alcohlica
saturada de azul de metileno + 195 ml de agua).

Tapar el tubo y calentar a 37 C por 5 minutos.

Invertir el tubo varias veces para asegurar la distribucin uniforme de la

crema e incubar a 37 - 38 C en posicin vertical, invirtiendo cada media
hora y protegido de la luz solar o elctrica.

Medir el tiempo desde que se inicia la incubacin hasta que por lo menos
los 4/5 de la leche se han decolorado.

La leche cruda y la pasteurizada deben resistir ms de 5 1/2 horas sin

decolorarse, y la destinada a la pasteurizacin, por lo menos 3 horas.
BIBLIOGRAFIA

Meloan, C. Y Pomeraz, Y. 1980. Food Analysis Laboratory Experiments.

Segunda edicin. The AVI Publishing Company, Inc. : Connecticut (USA).

Pomeraz, Y. Y Meloan, C. 1982. Food Analysis: Theory and Practice. The

AVI Publishing Company, Inc. : Connecticut (USA).

Ranganna, S. 1977. Manual of Analyisis of Fruit and Vaegetable Products.

Tata McGraw Hill Publishing Company limited. New Delhi (India).

Schmidt-Hebbel y Pennacchiotti. 1982. Las Enzimas en los Alimentos.

Editado por Fundacin Chile: Santiago.