18-10-2012

BASES TERICAS PARA LAS

TCNICAS DE HIBRIDACIN
MOLECULAR

HEBRAS
ANTIPARALELAS

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APAREAMIENTO o HIBRIDACIN DE HEBRAS COMPLEMENTARIAS

INTERACCIONES NONO-COVALENTES
Hidroflicas
fosfato y azcar
afuera
Hidrofbicas
las bases nitrogenadas
aromticas
adentro
Fuerzas de apilamiento
entre anillos aromticos
de las bases

2,0 nm

Puentes de hidrgeno
entre las bases
G C (tres)
A=T (dos)
Entre OHs del azcar
y el agua

Cargas negativas de los grupos fosfato de las hebras

deben ser neutralizadas para evitar repulsin
electrosttica y desnaturacin
Na+
Na+
Na+
Na+

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DENATURACIN y RENATURACIN DE AC. NUCLEICOS

SECUENCIAS COMPLEMENTARIAS SE APAREAN o HIBRIDAN
DEPENDIENDO DE:

- la secuencia
- temperatura
ds (doble hebra)

- concentracin de
sal en el medio

ss (hebra simple)

Las bases nitrogenadas de los cidos nucleicos absorben a 260 nm, siendo
adenina la que ms absorbe a esa longitud de onda y citosina la que absorbe
menos.

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Al estar ms expuestas al solvente las bases nitrogenadas en un cido nucleico

desnaturado absorben ms y a 260 nm se observa un efecto hipercrmico

DNA desnaturado
DNA nativo

ds DNA: una solucin de 50 g/ml presenta una absorbancia a 260 nm de1.0

ss DNA: una solucin de 33 g/ml presenta una absorbancia a 260 nm de1.0

Corrimiento hipercrmico

Tm = melting temperature o temperatura media de

fusin se define como: la temperatura a la cual aprox. la
mitad de las bases de un cido nucleico inicialmente doble
hebra se encuentran desapareadas.

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Efecto de la secuencia
Dado que el par GC tiene 3 enlaces puente hidrogeno y el par AT solo tiene 2, es
ms fcil o requiere menos energa desnaturar un DNA o hbrido rico en AT que
uno rico en GCs.

Existen diferentes frmulas para calcular la temperatura de fusin (Tm) de

un oligonucletido.
Todos los mtodos dan diferentes resultados ya que todos son clculos
tericos.
Los valores ptimos de Tm deben ser determinados experimentalmente.
La ms sencilla es la frmula de Wallace:

1. (A+T) x 2

Ej:

+ (G+C) x 4

Tm (C)

5'-CTCTGCTTCGTCCAGCCACTT-3'
(9 x 2) + (12 x 4) = 18 + 48 = 66
Tm = 66C

Sin embargo, esta frmula es vlida para oligos entre 18 - 24 bases y

asume que la reaccin es realizada en presencia de una concentracin de
cationes monovalentes de 50
50mM
mM..

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Partidor Heterlogo
No 100%
complementario

Partidor Homlogo
100% complementario
DNA templado

3
5

5
3

3
5

Oligonucletido o partidor

5
3

missmatch
o mal apareamiento

Un par de bases desapareadas disminuye

significativamente la estabilidad del hbrido

REACCIN DE LA POLIMERASA EN CADENA

PCR

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Partidor directo o sentido

5
3
3
5
Partidor reverso o antisentido

Producto (amplicn)

PRIMER CICLO DEL PCR

DNA doble
hebra

Separar
hebras
T

+ DNA polimerasa
Hibridar
partidores

Sntesis de
DNA
elongacin

Mg2+

Etapa 1

Etapa 2

Etapa 3

Primer ciclo

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Etapas de un ciclo
Etapa 1: Desnaturacin de la doble hebra (separacin)
94 -95 C

30 a 60 s

La Temperatura de desnaturacin depende del templado

Etapa2: Apareamiento de partidores
~50 - 60 C

30 - 60 s

La Temperatura de apareamiento depende de la Tm de

los partidores
Etapa 3: Sntesis o extensin de partidor
72 C (30(30-90 s)
El tiempo depende de la longitud del producto (~1min/1 kb)
y la procesividad de la enzima

Recin en el tercer ciclo

aparece el producto
final el amplicn
delimitado entre los 2
partidores

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St

15

20

25

30

Ciclos de amplificacin

En teora, ciclos sucesivos de la reaccin de amplificacin doblan la cantidad

de DNA sintetizado de manera que debera acumularse exponencialmente el
amplicn de inters en 2n, dnde n es igual al nmero de ciclos.
ESTO NO OCURRE EN LA REALIDAD Y LA EFICIENCIA DE LA REACCION VA DISMINUYENDO EN
EL TRANSCURSO DE ESTA, PRESENTANDO UNA CURVA HIPERBLICA.

Porqu?

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Vida media de la Taq polimerasa a 95 C es aproximadamente 30 min.

Esta es una de las razones por las cuales cae la eficiencia de la
reaccin.

Tambin influye fuertemente la disminucin de los sustratos para la

enzima (dNTPs, partidores) y el aumento de la concentracin de
templado.

Durante la reaccin de amplificacin tambin se acumula pirofosfato,

el cual afecta negativamente la actividad de la enzima.

Diferencias entre PCR convencional y de tiempo real

convencional

Tiempo real

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PARMETROS QUE AFECTAN LA ESPECIFICIDAD, FIDELIDAD Y

RENDIMIENTO DEL PCR
La reaccin de PCR debe ser optimizada en cada caso particular,
especialmente cuando se aplica al diagnstico.
Una reaccin estndar contiene: Templado DNA
(1 g DNA genmico
0,1-1ng DNA plasmidial en 10 l de
reaccin
20 pmoles de cada uno de los
partidores
50 M de cada dNTP
1 unidad de la enzima Taq DNA pol
buffer enzima pH ptimo
concentracin de Mg+2 (2 mM
mM))
En general, dependiendo del largo y secuencia del segmento a amplificar, los
cuatro dNTP deben usarse a baja concentracin (20-200M) para minimizar la
extensin de partidores apareados en otras regiones del templado.

Es importante optimizar la concentracin de Mg+2 pues afecta el apareamiento de

partidores, desnaturacin de las hebras, actividad de la enzima, fidelidad de copia
y formacin de dmeros de partidor. La concentracin ptima debe ser determinada
experimentalmente y en general flucta entre 0,5 y 3 mM Mg+2.

Curvas de magnesio

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Determinacin de la temperatura de
apareamiento de los partidores
La Tm de los partidores y por lo tanto la temperatura de
apareamiento de stos depende de:
la longitud de los partidores
el % G-C
la secuencia de stos
la concentracin salina en el medio

Un criterio simple es partir probando con una temperatura de

apareamiento que est 5oC bajo la Tm de aquel partidor que
tiene la Tm ms baja.

Las condiciones inicas y la mantencin del pH son

fundamentales para el xito de la reaccin de
amplificacin.

La

Taq

ADN

concentraciones

polimerasa
de

iones

es

sensible

magnesio

a
y

las
iones

monovalentes.

La

concentracin

de

Mg+2

depender

de

la

concentracin de dNTP ya que estos tienen la

capacidad de unir el in.

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Cul es la temperatura de apareamiento ptima?

La Tm de apareamiento a utilizar con
un templado purificado (ej.plasmidio)
no

necesariamente

coincide

con

aquella ptima para el templado en

una muestra biolgica ms compleja
(ej. tejido).
Muy alta - muy poco producto
Muy baja productos inespecficos
Conclusin: Es necesario optimizar

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