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Western blot

Resultado del Western blot: una membrana con las protenas separadas en la electroforesis unidas,
de las que slo se disciernen aquellas contra las se ha aadido un anticuerpo.

El Western blot, inmunoblot o electrotransferencia , es una tcnica analtica usada para


detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de
protenas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las
protenas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad,
etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son
transferidas a una membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para
poder buscar la protena de inters con anticuerpos especficos contra ella.1 2 Finalmente,
se detecta la unin antgeno-anticuerpo por actividad enzimtica, fluorescencia entre otros
mtodos. De esta misma forma se puede estudiar la presencia de la protena en el extracto
y analizar su cantidad relativa respecto a las otras protenas.
Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa, como
la biologa molecular, la bioqumica, la biotecnologa o lainmunologa. Existe toda una
industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra
decenas de miles de protenas diferentes.3 4
El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de
Stanford.2 El nombre (Western, occidental en ingls) le fue dado por W. Neal Burnette,5 y
consiste en un juego de palabras con una tcnica anloga pero que usa DNA, el Southern
(sureo) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras
tcnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern blot (en el que se
separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwestern blot.

ndice
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1Pasos del Western blot


o

1.1Preparacin de la muestra

1.2Electroforesis en gel

1.3Transferencia

1.3.1Difusin simple

1.3.2Transferencia al vaco

1.3.3Electrotransferencia

1.4Bloqueo

1.5Deteccin
1.5.1Mtodo en dos pasos

1.5.1.1Anticuerpo primario

1.5.1.2Anticuerpo secundario

1.5.1.2.1Radiactividad

1.5.1.2.2Anticuerpo unido a una enzima

1.5.1.2.3Marcaje fluorescente

1.5.1.2.4Sistema avidina/estreptavidina

1.5.1.2.5Deteccin con oro


1.5.2Mtodo en un paso

1.6Anlisis

1.6.1Deteccin colorimtrica

1.6.2Deteccin quimioluminiscente

1.6.3Deteccin radioactiva

1.6.4Deteccin fluorescente
1.7Exploraciones secundarias
2Aplicaciones

2.1Investigacin

2.2Diagnstico

3Protocolos

4Vase tambin

5Enlaces externos

6Referencias

Pasos del Western blot[editar]


Preparacin de la muestra[editar]
Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular:

Una pequea cantidad del tejido se introduce en un buffer de extraccin.


Despus se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes
volmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras pequeas) o
por sonicacin. Por ltimo se centrifuga para obtener las protenas en el
sobrenadante, la fraccin no precipitada.6

Las clulas pueden lisarse por uno de esos mtodos mecnicos. Tambin
pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y
solubilicen las protenas. A veces se
aaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la digestin por las
enzimas celulares de las protenas y de las fosfoprotenas, respectivamente.7

Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 C) para evitar


la desnaturalizacin proteica. Para separar protenas de compartimentos
y orgnulos celulares es preciso combinar tcnicas mecnicas - como filtraciones y
centrifugaciones - y bioqumicas.

Electroforesis en gel[editar]
Artculo principal: Electroforesis en gel

Las protenas de la muestra sern separadas mediante una electroforesis en gel en


funcin de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto
isoelctrico, peso molecular y carga elctrica. La naturaleza de la separacin depende
del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.
La electroforesis en gel ms frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de
poliacrilamida y de tampn con dodecilsulfato (SDS). En esta tcnica las protenas
sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la prdida de las
estructuras secundaria y terciaria y mantiene los polipptidos en este
estado desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional de las protenas no
influye en la electroforesis, y pueden separarse nicamente en funcin del tamao y
forma causando enfermedad.

Transferencia[editar]
Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos, se las
transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF.
Esta transferencia puede realizarse por difusin, por vaco o por accin de un campo
elctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad
de unir protenas de forma inespecfica (es decir, se adhieren a todas las protenas con
idntica afinidad):

las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza


de las interacciones membrana - protena, se sabe con cierta seguridad que se
trata de interacciones no covalentes de naturaleza hidrfba.

en las membranas de PVDF, la unin est basada en interacciones hidrofbicas y


de dipolos entre la membrana y las protenas. Como particularidad, deben ser
humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos,
debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.

Las membranas de nitrocelulosa son ms baratas que las de PVDF, aunque son
tambin ms frgiles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden
ser sometidas a varias pruebas consecutivas.8
Tambin pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel
activado. Sin embargo, no son tan usados como los anteriores.
Difusin simple[editar]
En la transferencia por difusin simple se ponen en contacto las superficies del gel
electrofortico y de la membrana y, sobre sta, se dispone un taco de papeles de filtro.
Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto
pesado. Este montaje se coloca sobre un tampn, que ascender por capilaridad hacia
el papel de filtro arrastrando consigo las protenas. Al llegar a la membrana, quedarn
retenidas en ella.
Este protocolo no est muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de protena
transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia.
Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificacin que permite obtener
mltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias
pruebas sobre geles virtualmente idnticos. Esta modificacin es viable cuando no es
necesaria una transferencia cuantitativa de protena.9 10
Transferencia al vaco[editar]

En esta tcnica, se aade el poder de succin de una bomba conectada a un sistema


de secado de planchas de gel, el cual lleva las protenas desde el gel hasta la
superficie de la membrana de nitrocelulosa.11 Este mtodo es vlido tanto para
protenas de alto como de bajo peso molecular.10
Electrotransferencia[editar]
Este mtodo se basa en una corriente elctrica y un tampn de transferencia para
llevar las protenas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden
descrito los siguientes elementos (del polo negativo o ctodo al positivo o nodo):
esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel,
membrana, ms papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado
coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una
corriente elctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo
disponible,... Las protenas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan
atrapadas por la membrana.1

Tras la transferencia, se suele proceder a la tincin del gel con Coomassie Brilliant
Blue (un colorante de protenas) para comprobar que en efecto una parte importante
del material proteico ha pasado a la membrana.
La electrotransferencia es hoy en da la tcnica de transferencia ms usada gracias a
la velocidad del proceso y al elevado porcentaje de protena que se transfiere
(especialmente en comparacin con las otras tcnicas).

Bloqueo[editar]
Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse protenas de forma
inespecfica, es preciso bloquear los lugares de unin que han quedado libres tras la
transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la
deteccin puede unirse a ellos, dificultando la distincin del complejo antgenoantgeno que se forma con la protena que se busca.
En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin de protenas, tpicamente
de albmina de suero bovino o ASB (ms conocida por sus siglas en ingls,
BSA), leche en polvo o casena, con una diminuta fraccin de detergente, como Tween
20 o Tritn X-100. Las protenas en solucin se unirn a todos aquellos lugares de
unin de la membrana que no estn ya ocupados por las transferidas desde el gel. De
este modo, el anticuerpo slo podr unirse a su antgeno especfico, reduciendo as el
ruido de fondo y los falsos positivos.

Deteccin[editar]

En la deteccin se comprueba la presencia en la membrana de una determinada


protena. Para ello se emplea un anticuerpo especfico contra ella unido a enzima que,
en presencia de su sustrato, catalice una reaccin colorimtrica (produce color). De
esta forma, se hace patente la unin con el antgeno, la protena, as como su
localizacin.
El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la
deteccin en un nico paso, lo cual es til en ciertos campos.
Mtodo en dos pasos[editar]
Los dos pasos de los que consta este mtodo de deteccin son la unin del anticuerpo
primario y la del anticuerpo secundario.

Anticuerpo primario[editar]
El primer paso es permitir la unin de un anticuerpo primario contra la protena
buscada. ste se consigue inoculando dicha protena o uno de sus eptopos (regiones
capaces de desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como un conejo o
una cabra) o a un cultivo celular. Adems, como la protena se ha desnaturalizado
durante laelectroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo reconozca
especficamente la protena desnaturalizada. La presencia del elemento extrao
debera desencadenar una respuesta inmune cuyo resultado incluya la produccin del
anticuerpo, primario en este caso, ya que reconoce la protena.
As pues, tras el bloqueo se incuba en agitacin moderada la membrana con una
disolucin de anticuerpo primario (0,5 - 5 g/ml). La disolucin consiste en un tampn
salino, con cloruro de sodio por lo general, con un pH cercano a la neutralidad, una
pequea fraccin de detergente y, en ocasiones, protenas disueltas,
como ASB o leche en polvo. La membrana junto con la disolucin pueden ser
introducidas en una pequea bolsa de plstico. Esta incubacin puede durar desde 30
minutos a una noche entera. La temperatura a la que puede tener lugar es igualmente
variada; en general, las elevadas temperaturas favorecen las uniones ms especficas.
Anticuerpo secundario[editar]
Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se
expone al anticuerpo secundario. ste reconoce de forma especfica una regin
concreta del anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser detectables (unin
a biotina, a una enzima reporter como la fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rbano
(HRP), etc.). Varios de estos anticuerpos se unirn a cada anticuerpo primario,
amplificando la seal.
Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de
origen animal. Por ejemplo, un anticuerpo secundario "anti-ratn" es aquel capaz de

reconoces casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Igualmente hay
anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas: econmicas,
por permitir a un laboratorio compartir una nica fuente de anticuerpos secundarios; y
dan resultados mucho ms consistentes.
Tambin pueden emplearse protenas no anticuerpos, como las protenas A y G.
Radiactividad[editar]

Unin del anticuerpo primario a la protena de inters. A este se une la protena A o la


protena G para ser detectada.

Es una alternativa al uso de anticuerpos secundarios que consiste en protenas de


unin a anticuerpos marcadasradiactivamente. Esta protena puede ser, por ejemplo,
la protena A de Staphylococcus aureus12 o la protena G13marcadas con 125I
(un istopo radiactivo de yodo). Las protenas mencionadas tienen la capacidad de
unirse a anticuerpos de forma inespecfica, por lo que se unirn al primario.
Este mtodo apenas se usa actualmente, por ser significativamente ms caro,
peligroso y lento que los otros. Sin embargo, presenta ventajas: es muy sensible, da
bandas que permiten una precisa cuantificacin; y la imagen autoradiogrfica puede
ser reproducida fcilmente y con gran precisin para su publicacin.10
Anticuerpo unido a una enzima[editar]

Anticuerpo secundario unido a la peroxidasa de rbano, de modo que puede catalizar la


reaccin quimioluminiscente.

Un mecanismo de deteccin simple y rpido consiste en unir al anticuerpo secundario


enzimas que catalicen la transformacin de un sustrato soluble en un producto
insoluble. De esta forma, en el posterior anlisis quedar una mancha all donde est
la protena de inters. Enzimas como la peroxidasa de rbano (HRP) o una fosfatasa
alcalina son vlidas para este mecanismo.10 Por ejemplo, la peroxidasa puede catalizar
la oxidacin del 4-cloronaftol en presencia de un 1% deperxido de hidrgeno. El
resultado es que el primero forma una mancha de precipitado oscura. 14 Otras tcnicas,
comoELISA o ELISPOT, tambin emplean este mtodo de deteccin.

Otro mtodo ms sofisticado consiste en la unin de una enzima que catalice una
reaccin quimioluminiscente. Las anteriormente citadas enzimas tambin son vlidas
en este caso, aunque cada una usa un agente quimioluminiscentediferente. En el caso
de la peroxidasa, cataliza la oxidacin del luminol en presencia de perxido de
hidrgeno. La fosfatasa alcalina cataliza la defosforilacin del adamantil-1-2-dioxetano
fosfato, reaccin que genera luz. Si se coloca una pelcula fotogrfica sobre la
membrana, la exposicin a la luz que se desprende en la reaccin permite detectar la
actividad enzimtica.
Marcaje fluorescente[editar]
Otro mtodo basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos
a fluorocromos del infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) furanona (MDPF) o el rojo Nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz
constante (estado esttico) cuando se excitan de manera constante, permitiendo una
deteccin muy precisa y una cuantificacin del antgeno ms exacta que la de la
quimioluminiscencia, que se realiza durante un estado dinmico.
El rojo Nilo no es puede usarse para teir bandas en membranas de PVDF; sin
embargo es posible realizar la tincin en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la
membrana de PVDF. Esto ltimo presenta una ventaja, y es que no es necesario
realizar una tincin del gel para comprobar la transferencia proteica.15
Sistema avidina/estreptavidina[editar]
Otra opcin es emplear un anticuerpo primario unido covelentemente a molculas
de biotina. Despus la deteccin se llevar a cabo con una protena de unin a la
misma, como la estreptavidina o la avidina.
Deteccin con oro[editar]
Otra tcnica, conocida como Golden blot, consiste en la deteccin de los anticuerpos
primarios con protena A unida a partculas de oro. El resultado es una membrana con
manchas rojas, causadas por el oro, all donde est la protena. 16 La sensibilidad del
mtodo puede incrementarse con una tincin fotoqumica de plata: el oro cataliza la
reduccin de los iones plata a plata metlica en presencia de otro agente reductor,
como la hidroquinona; la plata forma de este modo unas manchas visibles bajo
microscopio ptico. Se consigue as una sensibilidad comparable a la de las tcnicas
radiactivas.10 17
Mtodo en un paso[editar]
Histricamente la deteccin se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad que
supone producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto
ofrece a investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se
refiere, y aade un efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la llegada de
los anlisis de protenas de alto rendimiento y los menores lmites de deteccin ha
crecido el inters por desarrollar sistemas de deteccin en un solo paso que
aumentaran la rapidez del proceso al tiempo que reducen los consumibles. Esto
requiere un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo la protena de inters y una
"etiqueta" detectable. Se incuba de manera similar al anticuerpo primario del proceso
en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya se puede detectar directamente.

Anlisis[editar]
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la deteccin de
aquellas que s se han unido a la protena de inters.
Deteccin colorimtrica[editar]
La deteccin colorimtrica depende de la incubacin del Western blot con un sustrato
que reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida al
anticuerpo secundario. Pasa as de ser un compuesto soluble a una forma insoluble de

otro color que precipita cerca de la enzima tiendo as la membrana. Se procede


despus a un lavado en el que se elimina el tinte soluble. La cuantificacin proteica se
evala por densitometra (cuan intensa es la mancha) o por espectrometra.
Deteccin quimioluminiscente[editar]
La deteccin quimioluminiscente requieren la incubacin de la membrana con un
sustrato, que emitir luminiscencia al ser expuesto al reporter que trae unido el
anticuerpo secundario. La luz emitida es captada por una pelcula fotogrfica o, ms
recientemente, por cmaras CCD, que toman una imagen digital del Western blot. Se
analiza la imagen por densitometra para evaluar la cantidad relativa de mancha y
cuantifica el resultado en trminos de densidad ptica. Actualmente hay programas
que permiten realizar anlisis ms profundos si se aplican ciertos estndares, como la
obtencin del peso molecular.

Deteccin radioactiva[editar]
Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimticos; en su lugar se coloca
una pelcula fotogrfica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcador
provoca la aparicin en ella de regiones oscuras. stas se correspondern con las
bandas de las protenas de inters. Su alto precio y su riesgo para la salud y la
seguridad han provocado su desuso en los ltimos tiempos.
Deteccin fluorescente[editar]
En la deteccin con marcadores fluorescentes se procede a la excitacin lumnica de
stos que les provoca una excitacin. sta es detectable por un fotosensor, como una
cmara CCD equipado con los filtros de emisin apropiados. Se consigue as una
imagen digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso
molecular o la cuantificacin proteica. La fluorescencia es considerada uno de los
mtodos de anlisis ms sensibles.

Exploraciones secundarias[editar]
Una caracterstica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de nitrocelulosa,
es su capacidad de quitar los anticuerpos y volver a explorar la membrana con otros
anticuerpos. Aunque hay protocolos que permiten hacer lo mismo en membranas de
nitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la eliminacin de los anticuerpos,
permitiendo ms reusos antes de que el ruido de fondo es tan grande que impide
continuar con los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa,
el PVDF debe ser empapado en etanol, isopropanol o metanol al 95% antes de ser
usado. Adems, las membranas de PVDF tienden a ser ms delgadas y ms
resistentes a los daos durante su uso.

Aplicaciones[editar]

Investigacin[editar]
Actualmente, el Western blot es una de las tcnicas ms usadas en el estudio de la
biologa molecular.18

Diagnstico[editar]

Prueba de VIH: Aunque el VIH suele detectarse mediante la tcnica ELISA, el


Western Blot se usa como prueba confirmatoria cuando el ELISA da un resultado
positivo en un grupo que no es de riesgo o en una poblacin donde la prevalencia
del virus es muy baja. Mediante el Western blot se buscan los anticuerpos anti-VIH
en una muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las protenas
de clulas que, se sabe, estn infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero
que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la incubacin
con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, sern estos los
que realicen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos
no unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario antihumano unido a una enzima-seal. La aparicin de bandas indica la presencia de
protenas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el
paciente es seropositivo.

Se emplea como prueba definitiva de la encefalopata espongiforme bovina,


comnmente llamada "enfermedad de las vacas locas".

Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot.

En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la


presencia del FIV en gatos.

En la prctica clnica, el Western Blot se utiliza para diagnosticar enfermedades


infecciosas, ms frecuentemente famoso, el VIH. Algunos laboratorios clnicos
inmunofluorescencia emplean tcnicas de Western Blot como confirmacin as
como pruebas (tales como la deteccin de anticuerpos circulantes anti-colgeno VI
anticuerpos en la epidermlisis ampolla adquirida o varios anti-protenas propias
en pnfigo paraneoplsico). A menudo, Sin embargo, estas aplicaciones clnicas
son suplantados por ms productivos ELISA con costo reducido y el rendimiento
acelerado.