UNIVERSIDAD NACIONAL TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

ESCUELA DE SEGUNDA ESPECIALIDAD

ESPECIALIDAD EN
LABORATORIO DE ANALISIS CLINICO Y BIOLOGICOS

TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR Y

GENETICA COMO APOYO AL DIAGNSTICO
LUIS A. RODRIGUEZ DELFIN, MSc. PhD.
Laboratorio de Biologa Molecular y Gentica
Facultad de Ciencias Biolgicas
Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo
lard_20@hotmail.com
TRUJILLO

MARCADORES

MOLECULARES

Los marcadores moleculares se han aplicado a diferentes campos y su

disponibilidad ha mejorado nuestro conocimiento sobre:

Patognesis e historia natural de ciertas infecciones

Deteccin de brotes y epidemias, identificacin de reservorios y de mecanismos
de transmisin de patgenos

Diseo de medidas de control de propagacin de la infeccin

Evolucin gentica de poblaciones microbianas

TECNICAS MOLECULARE MARCADORES

MOLECULARES

La seleccin de la tcnica molecular depender de la capacidad tcnica y

tecnolgica de cada laboratorio, de la situacin epidemiolgica especfica a
estudiar y de la rapidez necesaria en la respuesta del laboratorio
TCNICAS

PCR convencional y variantes (PCR anidada, RT-PCR, PCR mltiple, etc.)

PCR tiempo real

Hibridacin (micromatrices o microarrays)

PCR-RFLPs

PCR-AFLPs (Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin
amplificados)

Secuenciamiento, etc.

MARCADORES

MOLECULARES

La capacidad de discriminacin de un marcador depende de la variabilidad gentica existente

en la regin del cromosoma que analiza.

Marcador al debera permitir calcular la distancia gentica existente entre las cepas
estudiadas.

Permitir establecer la relacin entre las cepas y, por lo tanto, conocer con precisin su historia
evolutiva

Las diferencias detectadas deberan corresponder a cambios evolutivos neutros cuya
acumulacin fuera proporcional al tiempo transcurrido.

Ello requiere que la estructura poblacional del microorganismo estudiado sea
fundamentalmente clonal.

CARACTERSTICAS DE LOS MARCADORES MOLECULARES

Reproducibilidad

Poder
Discriminacin

Facilidad
Tcnica

Marcador

Tipabilidad

Ribotipado

Excelente

Excelente

Buena

Buena

PFGE

Excelente

Excelente

Excelente

Buena

PCR

Excelente

Regular

Excelente

AFLP

Excelente

Buena

MLST

ptima

Excelente

Interpretacin Disponibilidad Costo

Buena

Variable

Alto

Buena

Variable

Alto

Buena

Regular

Buena

Medio

Excelente

Buena

Regular

Baja

Alto

Excelente

Difcil

Excelente

Baja

Alto

REA: anlisis del ADN total con enzimas de restriccin de alta frecuencia de corte
PFGE: digestin del ADN total con enzimas de baja frecuencia de corte y resolucin de los fragmentos generados por electroforesis de campo pulsante;
PCR: polimorfismo de amplificacin
AFLP: polimorfismo del tamao de los fragmentos de amplificacin
MLST: tipado por secuenciacin de mltiples loci.

EVALUACIN DE LOS MARCADORES MOLECULARES: EFICACIA

TIPABILIDAD
Proporcin de cepas que un marcador puede clasificar como pertenecientes a un tipo
determinado.
Un marcador ser tanto ms til cuando ms se acerque su tipabilidad al valor 1.
REPRODUCIBILDAD
Capacidad de un marcador para clasificar a una cepa en el mismo tipo cuando se realizan varios
ensayos independientes.
En aquellos marcadores complejos no debe tenerse en cuenta la variabilidad que se acepta entre
patrones dentro de un mismo tipo.
Los experimentos destinados a valorar la reproducibilidad deben tener en cuenta todas las
variables posibles.
El valor de reproducibilidad de un marcador afecta de manera muy significativa su capacidad de
discriminacin,
El valor de reproducibilidad debe ser superior a 0,95.

EVALUACIN DE LOS MARCADORES MOLECULARES: EFICACIA

ESTABILIDAD
Mide la capacidad de un marcador para reconocer y dar el mismo resultado antes y despus de
almacenar la muestra
Estabilidad in vivo (mantener en un modelo animal) y in vitro (almacenamiento durante un
periodo determinado de tiempo)
PODER DISCRIMINATIVO
Probabilidad promedio de que el marcador utilizado clasifique en 2 tipos distintos a 2 cepas no
relacionadas escogidas al azar de la poblacin
El poder discriminativo se cuantifica con el Indice de Diversidad de Simpson, segn la frmula:
ID= 1-1/N (N-1)s j=1 nj (nj-1)
N= n de cepas; S=n tipos distintos; nj= n cepas pertenecientes al tipo J. El valor de ID debe ser
superior a 0,95. Puede utilizarse una combinacin de marcadores.

ANALISIS DE ARN RIBOSOMAL

Linaje

Patrones obtenidos mediante REP-PCR en cepas de Acinetobacter

baumannii. (palindroma repetitiva extragenica).
Lnea M, Marcadores
moleculares de ADN.

MARCADORES USADOS EN EL ANALISIS

LA VARIABILIDAD GENOMICA

DE

MICROSATELITES:

RFLPs: polimorfismo en longitud de fragmentos de restriccin

MINISATELITES: nmero variable de repeticiones al azar
MICROSATELITES: secuencias simples repetidas
AFLPs: polimorfismo de longitud de fragmentos de amplificados
RAPD: fragmentos de ADN amplificados al azar
PCRs: marcadores basado en la reaccin en cadena de la polimerasa

MICROSATELITE CROMOSOMA
dys390

Tetranucletido
atgctgca(ATCG)nctt..gtaat
Locus = 208 pb
n: 1,2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,..
P

Personas
1 = 2x = 212 pb
2 = 3x = 216

atgctgca(ATCGATCG)ctt...gtaat
atgctgca(ATCGATCGATCG)ctt...gtaat

3 = 4x = 220

atgctgca(ATCGATCGATCGATCG)ctt...gtaat

4 = 5x = 224

atgctgca(ATCGATCGATCGATCGATCG)ctt...gtaat

5 = 6x = 228

atgctgca(ATCGATCGATCGATCGATCGATCG)ctt...gtaat

6 = 7x = 232

atgctgca(ATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCG)ctt...gtaat

MARCADORES MOLECULARES VNTRs

Individuo A
/3x,8x/3x,6x/2x,4x/

4x
Individuo B
/7x,8x/3x,4x/3x,4x/

1x

Individuo C
/4x,6x/2x,6x/5x,7x/

3x
8x

3x

8x
7x

3x
6x

2x
4x

4x

3x
4x

4x
6x
VNTR I
3x=1; 4x=1; 6x=1;
7x=1; 8x=2

2x
6x

5x
7x

VNTR II
2x=1; 3x=2; 4x=1;
6x=2

VNTR III
2x=1; 3x=1; 4x=2;
5x=1; 7x=1

ORIGEN POSIBLE DE
LOS POLMORFISMOS
DE LOS VNTRs

atgctgca(ATCGATCGATCG)ctt...gtaat
atgctgca(ATCGATCGATCGATCGATCG)ctt...gtaat
atgctgca(ATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCG)ctt...gtaat

ANALISIS GENOMA
TECNICAS HIBRIDACION

SOUTHERN

ADN, E. Restriccin, Desnaturalizacin, Nitrocelulosa

NORTHERN

RNA fijado a Nitrocelulosa

Slot/dot blot

Run on

ADN o ARN, Nitrocelulosa

ARN marcado in vivo, sonda normal, Nitrocelulosa

HIBRIDACION
Cadenas de simple y de distinto origen de ADN, de ARN o una de ADN y
otra de ARN se unen, formando un hbrido.

1.
2.

ENZIMAS DE RESTRICCIN
SONDAS
Radiactiva

No Radiactiva

SOUTHERN BLOTTING

ANALISIS DE GENOMA

Enzimas Restriccin
Sondas

Patrones Restriccin

Polimorfismos genticos en el
Tn1546 tras digestin con enzimas
de
restriccin
y
posterior
hibridacin con sondas especficas
de regiones parciales de este
elemento. Los nmeros del 1-9
representan los fragmentos tras
hibridacin con las sondas
anteriores.
Las letras sobre los pocillos de la
membrana
reflejan
los
polimorfismos
de
Tn1546
encontrados (imagen reproducida
con permiso del autor, Willems et
al. 1999. Antimicrob. Agents
Chemother 1999; 43:483-91).

ENZIMAS DE RESTRICCION
DEFINICION
ENZIMAS QUE CORTAN SECUENCIAS CORTAS Y ESPECIFICAS DEL ADN
TIPOS
EXONUCLEASA : Hidrlisis las bases de los extremos 5o 3
ENDONUCLEASA: Hidrolizan enlaces fosfodister en el ADN, reconocen secuencia
palindrmica, simetra central

EXTREMOS PLANOS
Enzima
Alu I

Secuencia
AGCT
TCGA

Hinf

GANTC
CTNAG

Eco RI

GAATTC
CTTAAG

5.TGAGCTCT.
3.AGTCGACA.

5.TGAG CTCT.
3.AGTC GACA.

EXTREMOS COHESIVOS
5.AAGACTCGG.. 5.AAG ACTCGG.
3.TTCTGAGCC.. 3.TTCTGA GCC.

SONDA o PROBE
Secuencia conocida de ADN (ARN) marcada con istopos
radiactivos (32P,

35S, 3H)

o no radiactivo (biotina o digoxigenina)

350 bases
5 aaggtaatgtctgaGCTCTTGACGGTGGAATCTGACTGATctaacgtaactttcaaaagttggctcat..3
3.CGAGAACTGCCACCTTAGACTGACTA.5

Marcaje Radiactiva de la sonda en el extremo 5

SONDA o PROBE

BIOTINA DIGOXIGENINA

SONDA

FOSFATASA
PEROXIDASA

ADN

Marcaje de
la Sonda

E
B

Hibridacin

E
B

E
B

E
B

ENZIMA
ANTICUERPO

SUSTRATO INCOLORO
PRODUCTO COLOREADO

ELIMINACION DE CADENAS SIMPLES DE LA HIBRIDACION

ESTABILIDAD DEL HIBRIDO

Tamao de la unin de la sonda y el ADN

Temperatura. Altas T slo mantienen hbridos muy estables

Concentracin de formamida. Inestabilidad

Fuerza inica. Concentracin de sales

Comparacin de Tcnicas
de Hibridacin

Patrones de restriccin-hibridacin asociados a IS6110: Lnea 1,

cepa control MT1423. Obsrvese como las cepas de las lneas
5, 6, 7 y 8 comparten el mismo patrn constituyendo un cluster.
Ello tambin ocurre con las cepas en las lineas 10 y 11.

POLIMORFISMO EN LONGITUD DE FRAGMENTOS DE RESTRICCION

RFLPs
350 bases
5 aaggtaatgtctgagctcttgacggtggaatctgactgatctaacgtaactttcaaaagttggctcat..3
3 ttccattacagactcgagaactgccaccttagactgactagattgcattgaaagttttcaaccgagta..5
Alu I AGCT
TCGA

nt. 15
300 bases

50 bases
5 aaggtaatgtctgag
3 ttccattacagactc

ctcttgacggtggaatctgactgatctaacgtaactttcaaaagttggctcat..3
gagaactgccaccttagactgactagattgcattgaaagttttcaaccgagta..5

350 bases

Eco RI GAATTC
CTTAAG

nt. 340

5 aaggtaatgtctgagctcttgacggtggaatctgactgatctaacgtaactttcaaaagtgaattctggctcat...3
3 ttccattacagactcgagaactgccaccttagactgactagattgcattgaaagttttcacttaagaccgagta5
Alu I AGCT
TCGA

nt. 15
20 bases

50 bases
5 aaggtaatgtctgag
3 ttccattacagactc

290 bases
ctcttgacggtggaatctgactgatctaacgtaactttcaaaagtg
gagaactgccaccttagactgactagattgcattgaaagttttcacttaa

aattctggctcat...3
gaccgagta5

AISLADOS DE Leishmania
RFLP Sal I
1

L. peruaviana

L. brasiliensis

1: DP; 2-3: SD; 4: DP

RFLP Eco RI
L. peruviana
PCR M

LC-26

1,300pb

800pb

500pb

M: X174/HaeIII

1-2: DP, 3: DT, 4: SD

Folia Dermatolgica
Peruana 14 (2), 2003

PCR -RFLPs
pSRY
M
1 kb

6d

8f

PCR

390

266

86

38

11g

Padrn

PCR

P1

P2 123

PCR -RFLPs

209 pb
144 pb
102 pb

209 pb

65 pb

144 pb
102 pb

65 pb
42 pb

65 pb

P2
P1

42 pb

65 pb

1 kb

Mapeo de Sitios de Restriccin

5

Hae III

Alu I
5

Mapeo de
Sitios

ANALISIS DE FRAGMENTOS DE
ADN AMPLIFICADO AL AZAR

RAPD

RAPD: SEGREGACION

GEL: RAPD

Vamos a otro Descansito???

ORGANIZACIN GENOMICA ESTRUCTURAL : GEN

CROMOSOMA

Intron 1

DNA

Intron 2
UTR- 3

5- UTR
Exon 1

Exon 2

Exon 3

ARN primario

ARNm maduro

PROTEINA 1

PROTEINA 2

ORGANIZACIN GENICA EN TANDEM

SOLO EXONES - INTRONES?

ETS

ETS

ETS

ITS 2

SECUENCIA ESPACIADORA INTERGNICA (ETS)

ITS 1

ITS 2

ITS 1

ITS 2

ITS 1

ITS 2

ITS 1

SECUENCIA ESPACIADORA INTRAGENICA (ITS)

ETS

FISH

FISH

SECUENCIAMIENTO DE ADN

. El mtodo de Sanger se basa en la elongacin 5' a 3' de las molculas de DNA por la DNA polimerasa.
Ambas estrategias generan un conjunto de molculas de DNA de cadena sencilla de diferentes longitudes.
Un mtodo de secuenciacin de DNA diseado por Alan Maxam y Walter Gilbert utiliza productos qumicos
para cortar el DNA. Este mtodo se utiliz para determinar la secuencia de bases de los 4.362 nucletidos del
plsmido pBR322. El segundo mtodo, que es el que generalmente se utiliza, lo desarrollaron Frederick
Sanger y sus colaboradores

Mtodo Qumico de Maxam y Gilbert

ATGTCTACTGTTACCTCAAGTTCTAACTATCTAACTC

37 bases

ATGTCTACTGTTACCTCAAGTTCTAACTATCTGACTC*
ATgTCTACTgTTCCACTCAgTTCTAACTATCTgACTC*
AT TCTACTgTTACCTCAgTTCTAACTATCTgACTC*
ATgTCTACT TTACCTCAgTTCTAACTATCTgACTC*
ATgTCTACTgTTACCTCA TTCTAACTATCTgACTC*
ATgTCTACTgTTACCTCAgTTCTAACTATCT ACTC*
Dimetil Sulfato Ac. Frmico
G

T+C

Hidracina
C

Hidrazina+Sal
C
G
A
A
T
C

Mtodo de Sanger o
Enzimtico

DNA
Denaturacin
3

3P

CH2

PCR: ADNpol + dNTP

HH

Reacciones didesoxirribonucletido

OH

3P
BASE

H H
H

CH2

HH
H

dNTP
A

T C G A

A
A

T
G

Electroforesis

C
T

5-32P-TAGC-3
3-ATCGACTGAGTCAAGAACTATTGGGCTTA-5
5-32P-TAGCT g-3
3-ATCGACTGAGTCAAGAACTATTGGGCTTA-5
32
5- P-TAGCTGACTCA g-3
3-ATCGACTGAGTCAAGAACTATTGGGCTTA-5

H H
H

ddNTP

BASE

3
A
C
T
A
T
G
T
C
T
G

ANALISIS DE SECUENCIA DE ADN

ATCTCGGCGTGTTTACTCAAGTGTCTTAACTAGGCTGAACT

Secuenciamiento Shotgun

CLONACION

CLONACION
Vectores y tamao de insertos
(pb)

Plsmido
Fago
Csmido
Fago
BAC
YAC

20
25
45
100
300
1000

CLONACION
EXPRESION

ELABORACION DE
BIBLIOTECA
GENOMICA

ELABORACION
DE BIBLIOTECA
DE cDNA

CONTIGS: serie de clones solapados

STS: sitios marcados por su

secuencia

EST: marcadores de secuencia

expresada