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TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

Pgina 59

Gentica bacteriana
L. Betancor, M. Gadea, K. Flores

Introduccin
Las bacterias son microorganismos con una capacidad extraordinaria de adaptacin a diferentes
condiciones ambientales. Para comprender la esencia de esta capacidad es importante conocer
sus bases genticas, es decir como est organizada la informacin gentica, como realizan y
regulan su expresin y que mecanismos de variacin gnica poseen.
La capacidad infecciosa de las bacterias patgenas radica en que poseen la informacin
gnica necesaria para colonizar los tejidos del husped, invadirlos y/o producir sustancias
txicas que causarn la enfermedad.
Por otro lado, el conocimiento del funcionamiento gentico de las bacterias, sumado al
hecho de que son de fcil manejo en el laboratorio y que tienen crecimiento rpido, ha permitido usarlas para sintetizar productos tiles a la medicina, tanto para el diagnstico como
para la prevencin y tratamiento de algunas enfermedades. Estas posibilidades se han visto
incrementadas con el desarrollo de la ingeniera gentica y la disponibilidad de tcnicas de
biologa molecular.

Estructura del genoma bacteriano

Toda la informacin gentica esencial para la vida de la bacteria est contenida en una nica
molcula de cido desoxirribonucleico (ADN) de doble cadena y circular, cerrado por enlace
covalente. Dicha molcula se denomina cromosoma bacteriano. Muchas bacterias poseen
adems ADN extracromosmico, tambin circular y cerrado, denominado ADN plasmdico
por estar contenido en los plsmidos. stos, portan informacin gnica para muchas funciones
que no son esenciales para la clula en condiciones normales de crecimiento.
En trminos bioqumicos la composicin y estructura de los cidos nucleicos bacterianos, es la misma que para cualquier clula. Conviene recordar brevemente, que los cidos
nucleicos son macromolculas compuestas de nucletidos unidos en forma covalente por
medio de enlaces fosfodiester entre los carbonos de las posiciones 3 y 5 de dos residuos
de azcares adyacentes. Esta estructura forma un esqueleto de azcares y fosfatos constante
en toda la macromolcula. La variacin entre los nucletidos que constituyen la cadena de
cido nucleico, esta dada por sus bases nitrogenadas; para el ADN son: adenina (A), timina
(T), citocina (C) y guanina (G) y para el cido ribonucleico (ARN) son en lugar de timina,
el uracilo (U). La A y G se denominan bases pricas o purinas, mientras que T, U, y C se

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denominan bases pirimidnicas o pirimidinas. As, una cadena o hebra de cido nucleico,
tendr una estructura primaria determinada por la secuencia de las bases que la componen.
El ADN como macromolcula, esta compuesto por dos cadenas nucleotdicas o hebras
antiparalelas que se enlazan entre s formando una doble hlice. Los enlaces entre ambas
hebras de ADN estn determinados por puentes de hidrgeno entre las purinas de una cadena, con las pirimidinas de la otra. Entonces, la A forma dos puentes de hidrgeno con la
T, mientras que la C forma tres puentes de hidrgeno con la G. Dicho fenmeno se conoce
como complementariedad de bases, es decir que la A es complementaria a la T y la C lo es
para la G (ver figura 1). Estos enlaces mantienen estable la estructura de doble hlice de
ADN, en la cual se pueden distinguir pares de nucletidos o pares de bases (pb). Estos pb
pueden usarse como unidad de tamao o longitud para las molculas de ADN, de esta manera
podemos decir por ejemplo que el ADN cromosmico de Escherichia coli tiene un tamao de
4,2 millones de pb o lo que es lo mismo de 4.200 kilobases (Kb).
Todas las clulas deben enfrentarse al problema de como lograr contener en su estructura
molculas tan grandes como el ADN. Volviendo al ejemplo de E. coli, los 4.200 Kb de su
genoma implican una longitud de 1,3 mm es decir unas mil veces la longitud de la clula. Las
bacterias no poseen histonas asociadas a su genoma y en consecuencia no tienen la posibilidad
de compactar su ADN en estructuras tipo nucleosomas como las clulas eucariotas. Por lo
tanto, deben compactar su ADN de otra manera. Esto se logra porque el ADN circular cerrado
es capaz de adoptar una estructura terciaria denominada superenrollamiento, que implica el
enrollamiento del eje de la doble hlice sobre si mismo (ver figura 2). Este superenrollamiento
se dice que tiene sentido negativo porque tiene el sentido contrario al enrollamiento de una
hebra de ADN sobre la otra. Esto supone para la bacteria una fuente de almacenamiento
de energa para ser usada en muchos procesos fisiolgicos que la requieren, por ejemplo la
separacin de las dos hebras de ADN necesaria para la replicacin y la transcripcin.
El cromosoma bacteriano es suficientemente largo como para formar muchos lazos circulares, que como tales pueden superenrollarse formando una serie de dominios topolgicos
independientes. Esta organizacin en dominios colabora a la compactacin general del genoma
bacteriano e impide que, con la ruptura de una hebra (en cualquier sitio del cromosoma) se
pierda el superenrollamiento total, manteniendo la energa almacenada.
Las bacterias poseen enzimas (topoisomerasas) capaces de alterar la estructura del ADN,
modificando su superenrrollamiento. Estas topoisomerasas actan agregando o eliminando
vueltas superhelicoidales y cumplen un rol importante en los procesos de replicacin y transcripcin del ADN. Adems, es interesante mencionar que algunas de las topoisomerasas
como la ADNgirasa, son blanco de accin de los antibiticos del grupo de las quinolonas,
como el cido nalidxico.

Los plsmidos son ADN extracromosmico

Como ya dijimos, muchas bacterias poseen informacin gnica contenida en molculas de
ADN distintas a las del cromosoma bacteriano, denominadas plsmidos. Estos, son molculas
circulares de ADN de doble cadena que constituyen una unidad de replicacin independiente
del cromosoma. Por esto puede encontrarse ms de una copia del mismo plsmido dentro de
la clula bacteriana. En general los plsmidos de mayor tamao se encuentran en una o unas
pocas copias, mientras que los ms pequeos pueden estar en hasta cien copias por clula
(plsmidos multicopia).
Aunque el ADN plasmdico no porta informacin gentica esencial para la vida de la

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!CIDODEOXIRIBONUCLEICO!$.
CADENADEAZCAR FOSFATO
!

PUENTESDEHIDRGENO

'

3
!

'

PARDEBASES

'

Figura 1. Estructura
del ADN. Apareamiento
de dos hebras de ADN
basado en la complementariedad de bases. A
(adenina) se aparea con
T (timina) por medio de
2 puentes de hidrgeno,
mientras que C (citocina) se aparea con G
(guanina) por medio de
3 puentes de hidrgeno,
formando los llamados
pares de bases.

61

NUCLETIDO

3
0

bacteria, s porta genes que le confieren nuevas propiedades fenotpicas y que en algunos casos
le son tiles para su adaptacin al crecimiento en determinados ambientes.
Muchas bacterias potencialmente patgenas para el hombre, solo son capaces de comportarse como tales cuando portan un plsmido que contiene genes que le permiten expresar
molculas de adhesin a los tejidos del husped o sintetizar sustancias txicas para ste.
Como ejemplo la toxina tetnica producida por Clostridium tetani, est codificada plasmdicamente.
En otros casos, los plsmidos contienen genes que codifican enzimas capaces de degradar
algunos antibiticos, permitiendo que la bacteria sobreviva a la accin de los mismos. Por
ejemplo la produccin de -lactamasas por cepas Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus aureus
y Haemophylus influenzae est codificada plasmdicamente.
Los plsmidos pueden clasificarse segn distintos criterios, por ejemplo por su tamao,
su nmero de copia o el tipo de genes que contiene (plsmidos de virulencia, plsmidos de
resistencia a antibiticos, etc.). Tambin pueden clasificarse en grupos de incompatibilidad;

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DISOCIACINLOCAL

Figura 2. Superenrollamiento del

ADN. Una molcula
de ADN circular
relajado puede ser
retorcida para
formar una molcula
superenrrollada
negativamente. Esta
reaccin es catalizada por una enzima
girasa, mientras
que la reaccin
inversa lo es por una
topoisomerasa.

!$.SUPERENROLLADO
CRCULORELAJADO

se dice que dos plsmidos pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad si son incapaces
de coexistir en la misma bacteria. Muchos plsmidos, en general los de mayor tamao (que
pueden portar hasta 50 o 100 genes), suelen ser capaces de transferirse de una bacteria a
otra mediante un proceso llamado conjugacin (vase mas adelante). Estos plsmidos de
conjugacin codifican todos los factores necesarios para su transferencia. Algunos plsmidos
mas pequeos, no conjugativos, pueden ser movilizados, es decir que poseen la secuencia
necesaria para permitir su transferencia, pero ellos mismos no codifican las protenas necesarias
para ser transferidos. Por ltimo, otros plsmidos no se transfieren en absoluto. La adquisicin de ADN plasmdico por una cepa bacteriana, puede realizarse por medios distintos a la
conjugacin como transformacin, la transduccin mediada por fagos o la incorporacin en
el cromosoma, como veremos mas adelante.

Genes "saltarines" de las bacterias

Los elementos transponibles son segmentos de ADN capaces de moverse desde una posicin
a otra en el genoma. Es decir que pueden transponerse o saltar desde un sitio determinado
del genoma, separndose del resto del ADN, hasta otro sitio distinto al cual se integran.
Tambin pueden transponerse desde el cromosoma a un plsmido o viceversa o a distintos

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sitios dentro de la misma molcula de ADN. Los elementos transponibles estn ampliamente
distribuidos en la naturaleza, tanto en virus, como en clulas procariotas y eucariotas. Existen dos tipos de elementos transponibles: las secuencias de insercin (elementos IS) y los
transposones (Tn).
Los elementos IS son segmentos pequeos de ADN, de aproximadamente 1 a 2 Kb que
contienen la informacin gentica mnimamente necesaria para la transposicin. Poseen
secuencias especficas en ambos extremos del fragmento que consisten en repeticiones
invertidas una respecto de la otra. Estas secuencias, son reconocidas especficamente por
enzimas codificadas en el mismo elemento IS, denominadas transposasas, responsables de la
integracin del elemento al sitio blanco del genoma.
Los Tn son segmentos de ADN que adems de portar la informacin necesaria para la
transposicin, contienen genes que pueden codificar diferentes propiedades fenotpicas. Dentro
de stas se destaca la resistencia a ciertos antibiticos, como es el caso de la resistencia de alto
nivel a la gentamicina que tienen algunas cepas de Enterococcus sp. Algunos plsmidos poseen
uno o mas Tn que portan determinantes de resistencia a antibiticos; la capacidad de estos
elementos para transponerse de un plsmido a otro, proporciona a la bacteria gran flexibilidad
para desarrollar resistencia, dado que dichos plsmidos son generalmente conjugativos, por
lo que pueden transferirse entre distintas bacterias.
La insercin de un elemento transponible puede producir diferentes efectos sobre la
expresin de la informacin gnica como impedir la funcionalidad de un gen o activar la
expresin de otro.

Replicacin del ADN bacteriano

El genoma completo de una clula, sea procariota o eucariota, debe replicarse con exactitud
una vez por cada divisin celular. Por lo tanto, la iniciacin de la replicacin compromete a
la clula a una divisin posterior. Si se inicia la replicacin, la divisin consiguiente no debe
ocurrir hasta que se haya completado la replicacin y, de hecho el final de la replicacin
puede disparar la divisin celular.
Las bacterias, a diferencia de las clulas eucariotas, son capaces de replicar su ADN a lo
largo de todo su ciclo celular.
Se denomina replicn a cada unidad de replicacin del ADN que contiene todos los
elementos requeridos para regular este proceso.
El cromosoma bacteriano se replica a partir de un nico origen que se mueve linealmente
hasta completar la duplicacin total de la molcula, por lo que constituye un replicn. Esto
facilita la regulacin que est centrada en la etapa de iniciacin; una vez que la replicacin
del cromosoma se inicia en su origen, todo el cromosoma ser duplicado. Los plsmidos,
constituyen replicones independientes del cromosoma, generando una replicacin por ciclo
celular que se coordina con la replicacin genmica (plsmidos unicopia) o permitir varias
replicaciones por ciclo (plsmidos multicopia).
El sitio de ADN que se est duplicando, se llama horquilla de replicacin. La replicacin
puede ser unidireccional o bidireccional, segn se formen una o dos horquillas en el origen.
Generalmente, los cromosomas bacterianos tienen replicacin bidireccional, mientras que
algunos plsmidos pueden replicarse unidireccionalmente. En la replicacin unidireccional,
una horquilla sale del origen y progresa a lo largo del ADN. En la bidireccional, se forman
dos horquillas que se alejan del origen en direcciones opuestas hasta que se encuentran
completando la duplicacin. Esto permite a la bacteria duplicar su ADN mas rpido que si

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Figura 3. Replicacin del ADN. El proceso

de replicacin del ADN es semiconservativo,
ya que cada nueva molcula posee una
hebra sintetizada de novo apareada a su
complementaria proveniente de la molcula
que le dio origen. El poroceso genera dos
moleculas de ADN idnticas.

.EWSTRAND

el proceso fuera unidireccional, pudiendo replicar mas de mil pb por segundo. Es importante
destacar que, aunque la velocidad de replicacin es muy elevada, la fidelidad de la misma
tambin es grande, siendo la frecuencia de mutaciones espontneas del orden de una cada
107 a 1011 pb replicados.
La replicacin es semiconservativa porque cada molcula de ADN posee una cadena del
ADN original y una nueva. Esto resalta la importancia de la complementariedad de bases en
la estructura del ADN (ver figura 3).
Las enzimas encargadas de catalizar el proceso de replicacin, se denominan ADN polimerasas. Si bien en E. coli se conocen tres tipos distintos, la responsable de la mayora de
los procesos de replicacin es la polimerasa III, mientras que las polimerasas I y II cumplen
principalmente funciones de reparacin de rupturas o de errores en las molculas de ADN.
Tambin participan otras enzimas, como las helicasas responsables de desenrollar el ADN
en el origen o cerca de l, paso indispensable para iniciar la replicacin.

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Figura 4. Colaboracin de protenas en la horquilla de replicacin. La ADN polimerasa

III necesita para iniciar la sntesis un cebador o primer que es sintetizado por una ARN
polimerasa especial. Algunas protenas desenrrollan la hlice de ADN y otras se unen a
los fragmentos de ADN unicatenario para estabilizarlo. Como la polimerasa solo sintetiza
ADN en direccin 5 a 3, una de las cadenas se sintetiza en forma discontinua, dejando
una serie de fragmentos de ADN y de huecos sin replicar. La ADN polimerasa I rellena los
huecos y una enzima ligasa sella los fragmentos entre si.

CADENANUEVA
!$.POLIMERASA
@
#ADENAMOLDE

PROTENASDEUNIN
AL!$.
@

HELICASA
PRIMER

@
!$.POLIMERASA

@

MOLCULAORIGINAL

@

!$.PRIMASA

FRAGMENTODE
/KASAKI

Esquemticamente, podemos decir que la replicacin consta de tres fases: iniciacin,

elongacin y terminacin. La primera se produce desde el origen del replicn donde se forma
la o las horquillas de replicacin, gracias a la accin de las helicasas que desenrollan el ADN.
De esta forma se constituye una porcin monocatenaria de ADN que estar en condiciones
de formar un complejo con protenas de unin al ADN, encargadas de estabilizar la cadena
sencilla, evitando la formacin de puentes de hidrgeno. Se sintetiza un corto oligonucletido
de ARN con un grupo 3 oxidrilo libre, que actuar como cebador o primer, en el cual la
ADN polimerasa agrega los nucletidos.
La elongacin consiste en el avance de la horquilla de replicacin, conforme se van
agregando nucletidos a la nueva cadena, siguiendo un orden establecido por las reglas de
complementariedad de bases (A con T y C con G), entre la cadena molde y la nueva. En
esta etapa participa fundamentalmente la ADN polimerasa III. Todas las polimerasas conocidas agregan nucletidos en direccin 5- 3 para el crecimiento de la cadena y requieren
una cadena de ADN molde, un cebador y los nucletidos. (Ver figura 4).
La terminacin se produce despus de que ambas horquillas de replicacin han atravesado
la mitad del cromosoma en direcciones opuestas y se encuentran en la regin terminal del
genoma. En esta regin, existen secuencias de ADN que actan como bloqueadores para el
avance del las horquillas, por lo tanto se asegura que la replicacin termine en esa pequea
porcin del genoma.

Expresin de los genes procariotas

TRANSCRIPCIN Y TRADUCCIN

La expresin gentica de todas las clulas depende de los procesos secuenciales de transcripcin y traduccin que, en conjunto transfieren la informacin contenida en una secuencia
de nucletidos de un gen, a una secuencia de aminocidos de una protena. Esto implica que
a partir de la dotacin gnica portada por la clula (genotipo), se expresarn un conjunto de
caractersticas evidenciables y que constituirn el fenotipo celular.
Durante la transcripcin, las reglas del apareamiento de bases son aplicadas por la ARN

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Figura 5. Comparacin entre la expresin de los genes eucariotas y procariotas. Los

ARNm procariotas son a menudo polignicos, es decir que contienen informacin para mas
de una protena. El extremo 5 se traduce cuando todava se est transcribiendo el extremo 3.
Los ARNm eucariotas son monognicos y requieren de modificaciones postranscripcionales
antes de atravezar la membrana nuclear y llegar al citoplasma donde son traducidos.
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PROTENA

polimerasa para sintetizar un producto complementario a una cadena del ADN usada como
molde, que es el ARN. Una de las clases mas importantes de ARN es el llamado mensajero
(ARNm), que porta la informacin para la sntesis de protenas. La ARN polimerasa bacteriana,
es distinta de la que tienen las clulas eucariotas; de hecho, algunos antibiticos que tienen
como sitio blanco de accin la ARN polimerasa (por ejemplo la rifampicina) son efectivos
exclusivamente ante clulas procariotas.
La ARN polimerasa reconoce un sitio especfico en el ADN, llamado promotor, al cual se
une iniciando la transcripcin. Un mismo transcripto, ARNm, puede contener la informacin
correspondiente a ms de un gen, por lo tanto se traducir luego en ms de un polipptido.
El conjunto de genes que son transcriptos en un nico ARNm y que por tanto se expresan
en conjunto se denomina opern. (Ver ms adelante).
Los genes procariotas no poseen intrones como los eucariotas, es decir que una vez
transcripto el ARNm, ste ser traducido directamente en una secuencia polipeptdica, sin
necesidad de realizar ningn procesamiento despus de la transcripcin.
Otra diferencia importante con la expresin de los genes eucariotas, es que como las
bacterias no tienen un compartimento nuclear definido, los procesos de transcripcin y traduccin estn acoplados. Es decir que mientras se est sintetizando una molcula de ARNm,
el ARN naciente puede tomar contacto con los ribosomas e iniciar la sntesis proteica (ver
figura 5). sto es una ventaja para la bacteria y constituye una importante causa de su elevada
capacidad para adaptarse a diferentes ambientes, porque le permite responder rpidamente a
los estmulos sintetizando las protenas necesarias, en el momento adecuado.
La traduccin es un proceso por el cual el ARN ribosmico, el ARN de transferencia
(ARNt) y muchas protenas ribosomales, realizan la lectura del cdigo gentico. Dicho
cdigo est escrito en tripletes de nucletidos o codones portados por el ARNm; de la

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escritura de la secuencia correspondiente de aminocidos, surge el producto polipeptdico.

El ribosoma desempea un rol fundamental, reuniendo al ARNm y a los ARNt cargados de
aminocidos.
La estructura y composicin de los ribosomas procariotas (ARN y protenas), difiere en
cierta medida de los ribosomas eucariotas. Tienen menor masa y por lo tanto, menor coeficiente de sedimentacin (la subunidad mayor 50 S y la menor 30 S, ambas suman 70 S).
Estas diferencias entre los ribosomas procariotas y eucariotas, igual que otras diferencias en la
expresin gnica (polimerasas, topoisomerasas, protenas, mecanismos regulatorios y factores
de elongacin), tienen una serie de implicancias. Una de stas es la sensibilidad diferencial
de procariotas y eucariotas a toxinas y antibiticos. Por ejemplo los macrlidos, los aminoglucsidos, el cloramfenicol y otros son antibiticos que actan en el ribosoma bacteriano o
en el proceso de sntesis proteica; en cambio, algunas toxinas bacterianas como la diftrica,
actan selectivamente en la sntesis proteica eucariota.
Existen dos sitios en el ribosoma: el aceptor (sitio A), donde los ARNt cargados se asocian
en primer lugar y el sitio peptdico (sitio P), donde se sujeta la cadena polipeptdica en crecimiento. En cada adicin de aminocidos, el ARNm avanza un codn y el nuevo aminocido
se traslada del sitio A al P, incorporndose a la protena en formacin.
Como el cdigo gentico es universal, el significado de los codones es similar al de los
eucariotas, aunque cabe mencionar que existen algunas diferencias en los codones que determinan la iniciacin y la terminacin de la traduccin, as como en la preferencia de uso
de ciertos codones.
Como en los procesos de replicacin y transcripcin, el paso inicial de la traduccin es
un importante punto de regulacin.

Regulacin de la expresin gnica de las bacterias

Las bacterias tienen muchos mecanismos para controlar la expresin de sus miles de genes,
con cual logran que el producto de un gen determinado, solo se sintetice cuando es necesario y, en lo posible en la cantidad ptima. Esto les confiere una importante capacidad de
adaptacin a cualquier cambio de concentracin de nutrientes del medio en que habitan,
activndose determinadas vas metablicas solo cuando son necesario. As, las bacterias evitan
sintetizar enzimas cuando falta el sustrato correspondiente, pero siempre estn preparadas
para fabricarlas cuando aparece dicho sustrato en el entorno.
Un importante mecanismo de regulacin desarrollado por las bacterias, se basa en la
activacin o desactivacin de la transcripcin de un grupo de genes cuyos productos tienen
funciones relacionadas y que estn organizados en una regin del genoma que permite regular
su expresin. Esta forma de organizacin gentica se denomina opern y le permite a la clula
administrar en forma ptima sus reservas energticas.
Un opern consiste en: un promotor, sitio blanco de la regulacin; genes adyacentes que
codifican cada una de las enzimas de una va metablica y una secuencia de terminacin de
la transcripcin. As, todos los genes constituyentes de un opern son transcriptos de forma
coordinada como ARNm policistrnico, es decir multignico. Dicho ARNm es traducido
secuencialmente en protenas por los ribosomas.
La iniciacin de la transcripcin puede regularse positiva o negativamente. Los genes bajo
control negativo se expresan constantemente, excepto que sean inhibidos por una protena
represora que evitar la expresin del gen por su unin a una secuencia especfica del ADN,

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denominada operador. Este operador impide que la ARN polimerasa inicie la transcripcin
en el promotor.
Aquellos genes cuya expresin se encuentra bajo control positivo, no sern transcriptos
excepto que est presente una protena activadora que se une a una secuencia especfica del
ADN y ayuda a la ARN polimerasa en los pasos iniciales de la transcripcin.
Los operones pueden ser inducibles o reprimibles. Se considera inducible, cuando la
introduccin de un sustrato en el medio aumenta la expresin de las enzimas necesarias para
su metabolismo. stos solo funcionan en presencia de una pequea molcula, el inductor.
Por otro lado, en el mecanismo de regulacin por represin, disminuye la sntesis de algunas
enzimas cuando existen cantidades suficientes de los productos terminales de la va metablica
correspondiente. Esto se denomina represin por producto final; los metabolitos terminales
son molculas llamadas correpresores (ver figura 6).
Un ejemplo clsico es el opern lactosa (lac), descrito en E. coli. Contiene un conjunto
de genes cuyos productos son las enzimas responsables de la degradacin de la lactosa. En
ausencia de lactosa en el medio, el opern es reprimido por la unin de una protena represora
a la secuencia del operador, esto impide la accin de la ARN polimerasa. La adicin de lactosa
al medio anula dicha represin, dado que el propio azcar acta como inductor unindose a

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Figura 6. Mecanismos de regulacin de la expresin gnica. a)

Induccin: Un gen regulador (reg)
codifica para una protena represora en su estado activo que se
une al operador (O) bloqueando
la unin de la ARN polimerasa al
promotor (P). En presencia del
inductor, la protena represora es
inactivada y el operador se encuentra disponible para el inicio
de la transcripcin. b) Represin:
El gen regulador codifica para
una protena represora en su
estado inactivo. En ausencia de
la molcula correpresora, ocurre
la transcipcin. En presencia del
correpresor, la protena represora
es activada para su unin al operador, bloqueando de este modo la
transcripcin.

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la protena represora e impidiendo que sta contine asociada al operador. Este mecanismo
de control negativo, asegura que el opern lac se transcriba solo cuando hay lactosa en el
medio. Sin embargo, existe un mecanismo para aumentar al mximo la expresin del opern
lac, basada en un mecanismo de control positivo mediado por protenas activadoras. En E.
coli existe una protena llamada protena activadora del gen por el catabolito (PAC), que
forma un complejo con el monofosfato de adenosina cclico (AMPc) y adquiere la capacidad
de unirse a una secuencia especfica del ADN presente en el promotor. La unin del complejo
PAC-AMPc al ADN, potencia la unin de la ARN polimerasa al promotor y permite aumentar
la frecuencia de iniciacin de la transcripcin. As, no solo se regula la sntesis, sino tambin
la cantidad que se sintetiza, segn los requerimientos de las enzimas responsables de la degradacin de la lactosa. Este tipo de mecanismo regulador de la transcripcin, se encuentra
en muchas bacterias para diferentes vas metablicas.
Tambin existen operones que son regulados en la terminacin de la transcripcin por
un mecanismo especial llamado atenuacin qu es caracterstico de las vas biosintticas de
aminocidos y se basa en el acoplamiento entre transcripcin y traduccin. Este es el caso del
opern triptfano (Trp), en el cual el promotor codifica un pequeo pptido que contiene do
Trp en posicin crtica. Cuando hay suficiente cantidad de este aminocido en el medio, el
pptido se sintetiza rpidamente a partir del promotor que es transcripto y luego traducido.
Esto provoca un cambio en la conformacin del ADN correspondiente al opern, que permite reconocer una seal de terminacin de la transcripcin entre el promotor y los genes
estructurales; sitio donde la ARN polimerasa se separa del ADN y termina la transcripcin.
Por el contrario, cuando no hay suficiente Trp, el pptido no podr sintetizarse y la ARN
polimerasa continuar transcribiendo los genes del opern. As, la clula solo sintetizar el
aminocido, cuando no haya suficiente cantidad de ste en el medio para ser usado en las
vas biosintticas.
No solo en la transcripcin existe regulacin, tambin existen en la traduccin y luego de
ella. La velocidad de la traduccin de las diferentes secuencias de ARN transcriptos, puede
variar ms de mil veces segn el sitio de unin del ribosoma con el mensajero. Generalmente,
el control de la traduccin se basa en la obstruccin del sitio de unin del ribosoma, ya sea por
la unin de una protena al ARN ribosmico en ese sitio o por el apareamiento de bases de
ste con otro fragmento de ARN. Este es el mecanismo usado para la regulacin de la sntesis
de las protenas ribosomales, cuyos genes tambin se encuentran organizados en operones.
Por ltimo, existe tambin la regulacin postraduccional que la bacteria usa para inactivar
enzimas innecesarias. Si bien existen mecanismos para suprimir la produccin de enzimas
cuando no son necesarias, hay que considerar que estas enzimas tienen una vida media relativamente larga y que en algunas ocasiones es ms redituable energticamente inactivar las
enzimas de una va biosinttica, que asumir el gasto de ATP correspondiente al funcionamiento
de dicha va cuando el producto est disponible en el medio.

Mecanismos de variacin genotpica

Como vimos, las bacterias tienen mecanismos que les permiten cambiar su expresin gnica
favoreciendo la sntesis de los productos de ciertos genes y reprimiendo la de otros. Estos
mecanismos pueden llamarse de variacin fenotpica, ya que implican una serie de cambios
en el fenotipo celular o de la poblacin bacteriana. Tambin existen mecanismos de variacin
genotpica, que sern igualmente traducidos en cambios fenotpicos, pero que se basarn en
una modificacin de la informacin gentica contenida en la clula.

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Bsicamente, existen dos formas de variacin genotpica en las bacterias. Por un lado,
en el genoma se producen cambios debidos a mutaciones y por otro, las bacterias pueden
intercambiar material gentico y sufrir recombinacin.
MUTACIONES

Una mutacin es un cambio heredable en la secuencia de bases de los cidos nucleicos que
constituyen el genoma de un organismo; sta se produce en condiciones naturales con baja
frecuencia y se deben fundamentalmente a errores en los procesos de replicacin del ADN.
Adems de las mutaciones espontneas, pueden ocurrir mutaciones inducidas, provocadas
por agentes mutagnicos (qumicos, fsicos o biolgicos) que proporcionan una herramienta
para introducir cambios en el genoma bacteriano en el laboratorio. La mayora de estos errores
o alteraciones introducidos en el genoma, son corregidos por los mecanismos de reparacin
del ADN, pero algunos escapan a la correccin y pueden originar cambios heredables que
proporcionan una diversidad gentica. Dada la baja frecuencia de mutaciones, solo los microorganismos con alta tasa de crecimiento, pueden alcanzar cifras suficientemente altas
como para que sean detectables. Las mutaciones en las bacterias, frecuentemente afectan
propiedades fcilmente reconocibles como requerimientos nutricionales, morfologa o resistencia antibitica.
Algunas mutaciones pueden conferir al mutante una ventaja frente a la cepa que le dio
origen, bajo ciertas condiciones ambientales, de manera que la progenie de dicha clula mutante es capaz de superar el crecimiento de la cepa original y sustituirla. Este es el caso de las
mutaciones que confieren resistencia a los antibiticos, en las que el mutante resistente se
seleccionar en un ambiente en el que las bacterias estn expuestas al antibitico en cuestin.
Este tipo de mutaciones se denominan selectivas. En cambio, frente a una mutacin no selectiva la bacteria no adquiere beneficios en relacin a su progenitor, por ejemplo la prdida de
pigmento de las colonias de Serratia marcescens que se observa cuando se cultivan en agar.
Las mutaciones puntuales, son aquellas que implican un cambio en una nica base; pueden
provocar que se cambie un aminocido por otro en el producto proteico (mutacin por cambio
de sentido). Otras veces no se traducen en ningn cambio (mutacin silenciosa), dado que
como sabemos existe ms de un codn para cada aminocido. Tambin puede suceder que
el codn se convierta en una seal de terminacin (mutacin sin sentido) y en ese caso se
traducir una protena incompleta no funcional.
Las deleciones y las inserciones producen cambios ms notorios en el ADN, provocando
la prdida o la incorporacin de cualquier nmero de pares de bases. Por lo tanto, siempre
que ste no sea mltiplo de tres se producirn mutaciones por desplazamiento del marco de
lectura, que suele provocar la prdida total del fenotipo.
Muchas mutaciones que originan un producto proteico defectuoso, pueden ser suprimidas por un segundo evento de mutacin en otro sitio del genoma (mutaciones supresoras),
restaurndose el fenotipo original.
TRANSFERENCIA DE GENES ENTRE BACTERIAS

La recombinacin gentica es el proceso mediante el cual los elementos genticos contenidos

en el genoma de diferentes individuos se combina. Esto permite que el individuo origine alguna nueva funcin que pueda dar como resultado una adaptacin a los cambios en el medio
ambiente. Este es un evento evolutivo importante y las clulas tienen mecanismos especficos
que aseguran que dicha recombinacin se efecte. A diferencia de los eucariotas donde la
recombinacin gentica ocurre en asociacin a la reproduccin sexual, en los procariotas

TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

71

comprende una serie de mecanismos independientes del evento de reproduccin celular.

Estos mecanismos son llamados transformacin, transduccin y conjugacin.
La transformacin es el proceso por el cual ciertas bacterias (llamadas competentes),
son capaces de incorporar ADN exgeno proveniente de otras bacterias, que est libre en
el medio.
La virulencia del Streptococcus pneumoniae est relacionada con la presencia de una
cpsula polisacardica a su alrededor. Las bacterias con cpsula tienen un aspecto liso (S)
cuando se cultivan en placas de agar y son capaces de matar a los ratones que son inyectados
experimentalmente con una suspensin bacteriana. Las colonias con bordes rugosos (R)
de S. pneumoniae, carecen de cpsula y no son letales al infectar ratones. Frederick Griffith
en 1928 observ por primera vez la transformacin cuando mezcl bacterias S muertas con
bacterias R vivas y encontr que al inyectar la mezcla en ratones, tambin resultaba letal.
De esto concluy que las cepas R haban sido transformadas en bacterias S, ahora capaces
de fabricar el polisacrido capsular virulento.
La capacidad de captar el ADN exgeno, conservarlo en forma estable e interaccionar
con l, se denomina competencia. Este fenmeno depende de la presencia de un sistema de
captacin de ADN especfico asociado a la membrana. (Ver figura 7). Ejemplos de bacterias
con competencia natural son Haemophilus influenzae, Neisseria sp., Streptococcus pneumoniae
y ciertas especies de Bacillus. Aunque la mayora de las bacterias no presentan capacidad
natural para captar ADN, es posible inducir en el laboratorio la competencia, generando
por distintos medios distorsiones en la membrana celular; por ejemplo con pulsos elctricos
(electroporacin) o con cambios osmticos y trmicos. Estos procedimientos son muy usados
para introducir experimentalmente ADN extrao, por ejemplo un plsmido, en una bacteria
y as transformarla para que adquiera un fenotipo de inters. Las bacterias tambin pueden
ser transformadas con ADN viral, en cuyo caso el proceso se llama transfeccin.
La transduccin es la transferencia de ADN de una bacteria a otra por intermedio de
un bacterifago. Existen dos formas de transduccin la especializada y la generalizada. La
primera ocurre cuando un fago temperado porta genes bacterianos adquiridos durante un
ciclo infeccioso anterior y al infectar una nueva bacteria e integrar su genoma al cromosoma
bacteriano, incorporar a ste la informacin gentica correspondiente a la bacteria infectada
previamente. La transduccin generalizada se produce por partculas virales defectuosas que
se originan como cpsides vacas durante la replicacin viral y que luego incorporan ADN
de una bacteria; as, al infectar una nueva bacteria podr introducir en ella dicho material
gentico.
La conjugacin se basa en el intercambio unidireccional de informacin gentica desde
una bacteria donante a otra receptora mediante un contacto real. (Ver figura 8). Los plsmidos son los elementos genticos que con mayor frecuencia se transmiten de esta forma. La
capacidad de conjugacin depende de la presencia en la bacteria de plsmidos conjugativos
que contienen los genes necesarios para tal proceso. Un ejemplo muy conocido de plsmido
conjugativo es el plsmido F de E. coli que codifica las protenas necesarias para la conjugacin,
incluyendo el pili sexual. ste, es una estructura especializada esencial para el contacto entre
la bacteria donadora y la receptora. Generalmente, los plsmidos conjugativos solamente
causan la transferencia de su propio material gentico pero en ocasiones el plsmido puede
integrarse al cromosoma bacteriano y en el momento de conjugar se transferir no solo a s
mismo, sino tambin a los genes cromosmicos que se encuentran tras l. Tericamente todo
el cromosoma podra ser transferido lo que requerira ms de dos horas, pero la unin entre
las bacterias por medio del pili persiste menos tiempo. Las cepas bacterianas con el plsmido

72

TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

Figura 7. Modelo para el proceso

de transformacin natural. Para la
induccin del estado competente se
requiere de un factor de competencia (FC). El DNA exgeno bicatenario
se une a las clulas competentes en
dos pasos diferentes, la unin laxa
y la fuerte. Fragmentos de DNA
monocatenarios son transportados
al interior celular unidos a protenas.
Estos complejos DNA-protenas facilitan la recombinacin posterior
de los fragmentos exgenos en el
cromosoma husped.

#ROMOSOMA

&#

#LULA
COMPETENTE
$.!EXGENO
5NINLAXA

5NINFUERTE

4RANSPORTEDE$.!

2ECOMBINACIN

F tienen gran capacidad de recombinacin por lo que se denominan cepas hfr por su sigla
en ingls (high frecuency of recombination). Debemos recordar que este es un mecanismo muy
efectivo para la transferencia de genes de resistencia antibitica.

TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

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Figura 8. Transferencia del plsmido F mediante conjugacin. Una clula F+ es capaz

de sintetizar un pili especial (factor F) que le permite iniciar el proceso de conjugacin para
transferir el plsmido F a una clula receptora F-.

&

CLULA&

LASCLULASENTRANENCONTACTO
YCOMIENZANLACONJUGACIN

&

@
@

CLULA&

%LPLSMIDO&SEREPLICA
PRODUCIENDOUNFRAGMENTO
UNICATENARIOAL

%L!$.MONOCATENARIOESTRANSFERIDO
@

@
SESINTETIZALAHEBRA
COMPLEMENTARIA

,ASCLULASSESEPARAN
LUEGODELATRANSFERENCIA

&

&

3EOBTIENENCLULAS&H

Aportes de la biologa molecular y la gentica bacteriana a la

medicina
Una de las contribuciones ms importantes de la ingeniera gentica de bacterias, es su uso
para desarrollar vectores o vehculos que permitan el clonado de cualquier secuencia de ADN.
Los vectores ms usados con este fin son los plsmidos bacterianos.

74

TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

Clonar implica introducir un fragmento de ADN en un vector. Los vectores de clonacin

deben permitir la insercin de un fragmento de ADN extrao y ser capaces de replicarse
normalmente dentro de la bacteria. Como vimos, los plsmidos tienen la capacidad de autoreplicarse y son elementos gnicos factibles de ser transferidos entre bacterias e introducidos
en una cepa deseada, por lo tanto constituyen buenos vectores de clonacin. Actualmente
existen varios tipos de vectores, algunos plasmdicos (como el pBR322 o el pUC) y tambin
virales (como el bacterifago lambda) o, los ms modernos llamados csmidos que combinan
algunas de las ventajas de los plmidos con las de los fagos.
Para clonar un gen cualquiera en un plsmido, es necesario primero cortar el ADN plasmdico y el ADN del cual procede el gen a clonar, para luego ligarlos de la forma deseada. Para
esto, se utilizan enzimas de restriccin. Muchas bacterias sintetizan estas enzimas, que son
capaces de cortar hebras de ADN (extrao a la propia bacteria), en secuencias nucleotdicas
especficas. Por ejemplo, una cepa determinada de E. coli, produce una enzima denominada
EcoRI, que reconoce la secuencia GAATTC y la corta (ver figura 9). Despus que EcoRI ha
cortado el ADN, quedarn bases sin aparear que estarn disponibles para aparearse con otro
fragmento de ADN que tenga las bases complementarias. Si cortamos dos fragmentos de
ADN con esta enzima y mezclamos los productos de esa reaccin, se obtendr un producto
recombinante por combinacin de los dos ADN originales.
Estas enzimas que han sido purificadas hace tiempo y que hoy se producen comercialmente, son usadas para clonar genes en por ejemplo un plsmido bacteriano. De esta manera,
es posible incorporar en un plsmido bacteriano un gen eucariota que codifique para una
protena determinada que nos interese producir en grandes cantidades, siempre que se conozca su secuencia nucleotdica y se disponga de enzimas de restriccin que sean capaces de
cortar especficamente el fragmento que contiene el gen. Una vez obtenido el fragmento de
ADN de inters y cortado el plsmido que ser usado como vector con las mismas enzimas

%CO2)

2ESTRICCIN

,IGACIN

!$.2ECOMBINANTE

Figura 9. Mecanismo
de accin de la endonucleasa EcoRI. La
enzima EcoRI reconoce
la secuencia GAATTC
en el DNA de doble
cadena. En ese sitio
es capaz de cortar el
DNA dejando extremos
cohesivos. Esto permite
restringir dos molculas
de DNA diferentes y luego ligarlas (utilizando
una enzima ligasa), para
producir una molcula
de DNA recombinante.

TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

75

de restriccin, estaremos en condiciones de ligar ambos fragmentos de ADN, valindonos

de las propiedades de complementariedad de bases del ADN; as se construye el plsmido
recombinante. Este plsmido podr ser introducido por transformacin en una cepa bacteriana apropiada y se podr producir la protena de inters en un cultivo bacteriano de E. coli,
purificndola luego a partir del cultivo (ver figura 10).
Usando estos procedimientos de clonado y expresin de genes, actualmente se producen
muchas protenas que son usadas en el tratamiento de algunas enfermedades humanas (por
ejemplo la diabetes), al producir hormonas humanas como la insulina, la hormona de crecimiento o el interfern, en bacterias recombinantes obteniendo cantidades suficientes como
para su aislamiento y uso teraputico.
Adems, la disponibilidad de antibiticos naturales para el tratamiento de las infecciones
bacterianas no es infinita, por lo que otra importante rea de investigacin se centra en la
aplicacin de la ingeniera gentica a la creacin de nuevos antibiticos. Por manipulacin
gentica se intenta producir mutaciones especficas en los genes encargados de la codificacin
de protenas con efecto antibitico o producir molculas de antibiticos hbridos, logrados
por tcnicas de ADN recombinante.
Otra importante aplicacin de la biologa molecular a la medicina, es la produccin de
vacunas recombinantes. Este procedimiento se basa en la expresin en bacterias de genes
propios de patgenos contra los que se desea vacunar, por ejemplo virus, parsitos u otras
bacterias. El procedimiento consiste bsicamente en el clonado de genes que codifican para
antgenos de superficie del virus o del parsito contra el que se desea vacunar. Estos antgenos
sern expresados en la cepa recombinante y purificados a partir del cultivo de la misma cepa,
usndose luego como inmungenos. As, clonando los genes apropiados en los microorganismos adecuados, podrn producirse grandes cantidades del antgeno puro. Este mtodo
proporciona la ventaja de que evita trabajar con microorganismos patgenos. El desarrollo
de la vacuna contra la hepatitis B representa el primer xito de las vacunas recombinantes.
sta, es producida en una levadura que ha sido transformada previamente con un vector
recombinante que contiene el gen del antgeno de superficie del virus.
Estos mtodos pueden usarse tambin para la produccin de vacunas vivas, es decir vacunas
que son administradas con virus o bacterias vivas que han sido manipuladas genticamente
para perder su virulencia, pero que mantienen intactas sus propiedades inmunognicas.
Adems, estos microorganismos denominados atenuados, pueden usarse como vectores de
genes de otros grmenes patgenos para producir vacunas que inmunicen contra ms de
una enfermedad infecciosa a la vez. Estos procedimientos son motivo de investigacin en los
laboratorios de desarrollo de vacunas en todo el mundo.

Biotecnologa aplicada al diagnstico clnico

Otro uso de la produccin de antgenos a escala industrial en bacterias, es para realizar
pruebas diagnsticas que detecten anticuerpos especficos contra antgenos microbianos en
el suero de pacientes. En estos casos, interesa clonar en una bacteria de rpido crecimiento
como E. coli, el gen que codifica para un antgeno determinado del microorganismo contra
el cual se desea detectar la respuesta inmune desarrollada por el paciente. De esta manera, se
producir el antgeno proteico en cantidad suficiente como para capturar los anticuerpos
en la tcnica elegida para la prueba diagnstica, ya sea por enzimoinmunoensayo (ELISA),
inmunofluorescencia, aglutinacin de partculas de ltex u otras. Un ejemplo de esto, es el
reciente desarrollo de una tcnica de ELISA para la deteccin de anticuerpos dirigidos contra

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TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

Figura 10. Clonacin de un fragmento de DNA en un plsmido. Un gen de inters

puede ser clonado en un plsmido. Para eso, el DNA plasmdico y el DNA exgeno son
tratados con la misma enzima de restriccin y mezclados en presencia de una enzima
ligasa. El producto de la ligacin es introducido en una cepa bacteriana por transformacin, y se seleccionan los clones recombinantes por la resistencia al antibitico portada
por el plsmido.

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TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

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el antgeno del core del virus de hepatitis B, habindose este antgeno clonado y expresado
en E. coli.
Las bacterias patgenas se comportan como tales porque poseen ciertos genes, tanto en
cromosomas como en plsmidos, que le confieren la capacidad de expresar determinadas caractersticas fenotpicas denominadas factores de virulencia o determinantes de patogenicidad.
El estudio detallado de la gentica bacteriana, ha permitido identificar algunos de estos genes
y hoy somos capaces no solo de identificar a una bacteria como patgena cuando la aislamos
produciendo enfermedad, sino tambin cuando encontramos en ella los genes responsables
de la expresin de determinantes de patogenicidad. Esto es importante cuando no alcanza
con identificar a nivel de especie una cepa bacteriana aislada de una muestra biolgica patolgica, para afirmar que esa bacteria es el agente causal del proceso infeccioso. Este es el
caso de las enfermedades diarreicas causadas por ciertas cepas de E. coli. Como sabemos, E.
coli es parte de la microflora normal del aparato intestinal del hombre y por supuesto esas
bacterias no actan como patgenos en el intestino. Sin embargo, algunas cepas especiales
de la misma especie, cuando colonizan el aparato gastrointestinal, a travs de la ingesta de
alimentos o agua contaminados, son capaces de multiplicarse y causar un proceso infeccioso
que se manifiesta con diarrea. Estas cepas productoras de diarrea, difieren en su carga gentica de las pertenecientes a la flora normal en que poseen genes que codifican para factores
de virulencia, por ejemplo pueden ser capaces de producir toxinas cuyo blanco de accin es
el enterocito o producir determinadas protenas de membrana externa para adherirse a la
mucosa intestinal.
Entonces, cuando en una enfermedad diarreica hay que establecer el diagnstico clnico
microbiolgico, por ejemplo en un lactante (edad en la que E. coli es el primer agente causal
de diarrea), no alcanzar con identificar fenotpicamente como E. coli a una cepa aislada
en el coprocultivo, sino que habr que determinar la presencia de ciertos determinantes
de patogenicidad para afirmar que se trata de una cepa patgena. Una opcin para esto es
identificar la presencia de los genes que codifican para estos determinantes. Para esto se han
desarrollado tcnicas de hibridacin por sondas, que se basan en las propiedades de complementariedad de bases del ADN. Una sonda, es un fragmento de ADN complementario a
una regin de un gen que nos interesa identificar, la cual ha sido previamente marcada con
algn indicador que pueda ser detectado luego de la hibridacin. El marcado puede realizarse
incorporando nucletidos radioactivos o biotinilados o marcados con digoxigenina. Si en un
cultivo bacteriano interesa saber si posee el gen X, cuya secuencia es conocida, podremos
construir una sonda especfica para dicho gen, extraer el ADN del cultivo y mezclarlo con
nuestra sonda. Esto se realiza en condiciones que puedan desnaturalizar la estructura de doble
cadena de ADN, para permitir que la sonda logre hibridar con su secuencia complementaria.
As, podremos evidenciar si nuestro cultivo posee o no el gen buscado, porque de estar presente
encontraremos la marca correspondiente a la sonda incorporada en la estructura del ADN.
Esta tcnica puede usarse aplicando la sonda directamente sobre una muestra clnica, por
ejemplo una seccin tisular y en ese caso se denomina hibridacin in situ.
Hoy se disponen de muchas sondas especficas de ADN usadas para el diagnstico de
muchas enfermedades bacterianas. La hibridacin por sondas y otros mtodos para detectar
un gen en particular, es til para realizar el diagnstico etiolgico de las infecciones producidas por microorganismos cuyo cultivo es dificultoso, ya sea por crecimiento lento como
en Mycobacterium sp., o por tener requerimientos especiales de cultivo y aislamiento como
Chlamydias sp., Rickettsias sp. o virus.
El mayor problema diagnstico usando hibridacin por sondas, es la baja sensibilidad de

78

TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

la tcnica, dado que es necesario que en la muestra existan suficientes copias del gen buscado como para que la marca correspondiente a la sonda sea detectada. Generalmente, las
tcnicas de hibridacin in situ con sondas no radioactivas, son capaces de detectar ms de
200 copias del gen. Por esto, muchas veces la sensibilidad de la tcnica no es suficiente como
para descartar aquellas muestras en las que se obtienen resultados negativos.
Uno de los ms interesantes avances en diagnstico clnico, ha sido el desarrollo de un
mtodo que permite amplificar el nmero de copias de un determinado fragmento de ADN
de inters. Esta tcnica, llamada reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), permite generar
millones de copias exactas de un fragmento de ADN a partir de una copia original en dos o tres
horas. La PCR se basa en las propiedades de replicacin del ADN la cual puede reproducirse
in vitro si se coloca el ADN molde en una mezcla de ADN polimerasa, nucletidos y cebadores
especficos (primers) para las regiones del fragmento que se desea amplificar. Esta mezcla, se
coloca en condiciones de pH y osmolaridad tales que permitan el funcionamiento adecuado de
la polimerasa. Primero se coloca la mezcla a altas temperaturas (94 o 95C) para lograr que el
ADN se desnaturalice, es decir que se separen ambas hebras. Luego se somete a temperaturas
adecuadas para que los cebadores hibriden con el ADN molde (entre 40 y 55C, segn la
secuencia de los cebadores). En una tercera etapa, se coloca a la temperatura adecuada para
que la polimerasa de ADN acte catalizando la replicacin. Las polimerasas que se usan para
estos fines, deben ser capaces de tolerar las altas temperaturas de desnaturalizacin del ADN,
por lo que la enzima utilizada proviene de una bacteria termfila. La polimerasa ms usada
en PCR, proviene de Thermus aquaticus (Taq polimerasa) cuya temperatura ptima es 72C.
Hoy se usa sta y tambin otras enzimas, producidas en forma recombinante en E. coli.
Estos cambios de temperatura se realizan en un termociclador, que es capaz de variar entre
rangos muy amplios de temperatura en tiempos muy cortos. Este ciclado de temperaturas,
por ejemplo: 94C por un minuto, 45C por un minuto y 72C por un minuto y medio, se
repite aproximadamente 30 veces. As, se logra que en cada ciclo se duplique el nmero de

Figura 11. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN molde se desnaturaliza

(aprox. 94 ) y los primers se unen en sus secuencias complementarias en los extremos de
la regin a amplificar ( aprox. 55, segn la secuencia de los primers). Luego la polimerasa
sintetiza una nueva hebra de ADN a partir de cada primer copiando la cadena molde ( a 72).
Asi se completa un ciclo, repitiendose el proceso unas 35 veces, amplificando la secuencia
de inters en forma exponencial.

TEMAS DE BACTERIOLOGA Y VIROLOGA MDICA

79

copias de cada una de las hebras del ADN molde,

con lo que se logra un crecimiento exponencial (ver
figura 11).
Este procedimento puede aplicarse directamente
a una muestra clnica, para determinar la presencia
o ausencia de un microorganismo en particular,
mediante la deteccin de una secuencia especfica
en su cido nucleico.
Para revelar el resultado del ensayo, la mezcla de
reaccin debe ser sometida a electroforesis en gel de
agarosa o de poliacrilamida. En esta, el ADN migra
desde el polo negativo al positivo en diferentes grados
segn el peso molecular, es decir su tamao en pares
de bases. El fragmento a amplificar es por supuesto
de tamao conocido, por lo que podr determinarse
la presencia del gen buscado en la muestra, porque
se habr amplificado en la reaccin y aparecer una
Figura 12. Corrida electrofortica banda del tamao correspondiente en el gel (ver
en gel de agarosa, para revelar figura 12).
una reaccin de PCR. En el carril de
Los geles debern ser revelados para que desala derecha se observa un marcador de
rrollen
una reaccin de color visible que nos ayude
peso molecular y en los dos carriles
anteriores el producto de la amplifi- a determinar la presencia o ausencia de la banda de
cacin del tamao esperado. En el inters. En los geles de agarosa, el revelado se hace
primer carril la muestra no contena la generalmente con bromuro de etidio, que es un agensecuencia de inters.
te intercalante del ADN, es decir que su molcula
se intercala entre las bases del cido nucleico. Este
procedimiento colorea el gel porque el bromuro de etidio fluoresce bajo luz ultravioleta; por
lo tanto cuando el gel se expone a la luz ultravioleta, se evidenciar o no la banda correspondiente. En los geles de poliacrilamida, el revelado puede realizarse con nitrato de plata.
El resultado de la PCR tambin puede evidenciarse, combinado la PCR con una tcnica
de hibridacin por sondas. Esto se logra transfiriendo el ADN del gel a una membrana (por
ejemplo de nitrocelulosa) y ponerla en contacto con una sonda especfica. En este caso el
revelado lo brinda la marca de la sonda. Este procedimiento de transferencia de ADN a una
membrana combinado con hibridacin por sondas, se denomina Southern Blott.
Aunque hemos centrado el inters de estas tcnicas de deteccin de cidos nucleicos para
el diagnstico de las enfermedades infecciosas, tambin son usadas para diagnosticar algunas
enfermedades neoplsicas y hereditarias.
La aplicacin de la biotecnologa molecular a la medicina, representa un campo de intensa investigacin y vertiginoso desarrollo. La prevencin, el tratamiento y el diagnstico de
muchas enfermedades que hasta hace pocos aos resultaba imposible, hoy son una realidad y
cada vez la biologa molecular aporta ms conocimientos y tecnologa aplicables a la mejora
de la calidad de vida y la salud humana.

Bibliografa

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