PROCESO DE LABORATORIO IN VITRO PARA EL DIAGNOSTICO DEL VIRUS DE

LA NECROSIS PANCREATICA INFECCIOSA (IPNV)

Becario: Arturo Morales Lpez, Unidad Acadmica de Ciencias Qumico Biolgicas de la
Universidad Autnoma de Guerrero, becario del programa AMC xrthur90@hotmail.com, rea II.
Asesor-Investigador: Dr. Csar Ortega Santana, Responsable del rea de Sanidad Acucola en el
Centro de Investigacin y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA) de la Universidad
Autnoma del Estado de Mxico, cortegas@uaemex.mx.
RESUMEN
El virus de la necrosis pancretica infecciosa (IPNV) es el agente etiolgico de una
enfermedad sistemtica aguda, altamente contagiosa, usualmente letal para peces salmnidos
jvenes. El virus tiene distribucin mundial y provoca severas prdidas; una forma de control y
prevencin es realizar su diagnstico oportuno en granjas donde llevan a cabo cultivos de trucha
arcoris. En este trabajo se usaron muestras ciegas para el diagnstico de IPNV utilizando
clulas de cultivo de la lnea RTG-2 (Rainbow trout gonad) y CHSE-214 (Chinook salmon
embryo). El proceso inici con la toma y obtencin de rganos para el diagnstico viral (hgado,
rin y bazo), seguido de la preparacin de placas de clulas para inoculacin de las muestras
biolgicas, luego de la inoculacin las muestras que presentaron efecto citoptico (CEP)
sugestivo de la presencia de IPNV fueron sometidas a la prueba de inmunofluorescencia indirecta
(IFAT). En la prueba de inmunofluorescencia indirecta, la muestra positiva debe presentar una
fluorescencia especfica de color verde nicamente en el citoplasma de las clulas infectadas. El
proceso realizado en este estudio est basado en la recomendacin de la Organizacin
Internacional de Salud Animal (OIE, 2006), considerada la prueba de oro para el diagnstico de
IPNV y otros virus de peces, especficamente salmnidos, el cual es un proceso nico en el pas e
inclusive en Latinoamrica. En este trabajo, las lneas celulares (RTG-2 y CHSE-214) mostraron
ser aptas para la deteccin de IPNV.
PALABRAS CLAVE: IPNV, infeccin, virus, clulas, inmunofluorescencia.

INTRODUCCIN
En Mxico, el cultivo de la trucha arcoris comenz a finales del siglo XIX, con
importaciones de huevo de Estados Unidos. Sin embargo, esta actividad se vio afectada por la
ocurrencia de la necrosis pancretica infecciosa (IPNV) en enero del ao 2000, en una granja de
trucha de la regin central del pas, reportando los sntomas tpicos de IPNV en alevines, con
prdidas de aproximadamente 5,000 alevines en solo 5 semanas. Este grupo de peces fue
originalmente importado en un lote de 300,000 huevos en Noviembre de 1999 (Ortega et al.,
2002).
La introduccin y movimiento de los huevos de trucha y alevines en distintas partes del
pas son prcticas comunes, ya que el gran dficit de este insumo para poblar las granjas fuerza a
los productores de depender en la importacin de peces, lo cual incrementa el riesgo de propagar
el IPNV y otros agentes infecciosos, poniendo en riesgo los recursos econmicos que generaran
las granjas productoras de trucha arcoris (Ortega et al., 2007).
Ya que el cultivo de la trucha arcoris es prcticamente mundial, el problema con IPNV no
es exclusivo de Mxico, de igual manera, la industria acucola chilena se ha convertido en los
ltimos aos en una de las ms importantes del mundo, en donde se estiman prdidas de cerca de
US$ 100 millones debido a enfermedades que afectan en distintas etapas de produccin de
salmnidos, incluyendo IPNV. El mercado chileno cuenta actualmente con una vacuna de
administracin oral contra IPNV reconocida por la autoridad de salud pecuaria nacional, no
obstante, an existen barreras clnicas, tecnolgicas y econmicas que subsanar para mejorar su
aceptacin dentro de la industria (Aranda et al., 2007).

El virus de la necrosis pancretica infecciosa (IPNV)

El virus de la necrosis pancretica (IPNV), miembro de la familia Birnaviridae es el
agente etiolgico de una enfermedad sistemtica aguda altamente contagiosa, usualmente letal
para salmnidos jvenes, cuya distribucin mundial provoca severas perdidas econmicas en
varias especies de peces. Los animales que sobreviven a la enfermedad clnica y los infectados
despus de los 6 meses de edad se convierten en portadores asintomticos, perpetuando el riesgo
de infeccin (Wolf, 1998; Rodrguez et al., 2001; Vega et al., 2011). El desarrollo y resultado
final de la infeccin es influido por factores que dependen del virus y del hospedero, los cuales a
su vez son afectados por el ambiente (Rodrguez et al., 2003). Por consiguiente, para comprender
los mecanismos que facilitan el establecimiento y la evolucin de la infeccin es importante
considerar no solo las propiedades del virus, sino tambin aquellos elementos del hospedero que
median la interaccin inicial entre virus y clula y que determinan que una infeccin sea o no sea
productiva en especies susceptibles (Ortega y Enrquez, 2007). En Mxico, la presencia de IPNV
fue confirmada en cras de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) importadas como ovas ojo
desde Norteamrica, creando una situacin de emergencia para la produccin de trucha en el pas
(Ortega et al., 2002).
La virulencia, que es la habilidad relativa del agente patgeno para causar enfermedad, es
una manifestacin de la interaccin entre los efectos adversos producidos por componentes del
virus y los mecanismos de defensa desarrollados por las clulas para tratar de eliminar la
infeccin; sin embargo, el resultado de tal interaccin siempre es determinado por el virus a
travs de sus factores de virulencia, funcin que puede ser ejercida por cualquier componente de
la partcula viral (Lyles, 2000). Las diferencias en el nivel de virulencia observadas entre distintas
cepas de IPNV han sido atribuidas a su variacin gentica (Dobos, 1995), y con la propiedad del
virus para modificar las vas de sealizacin celular a travs de las protenas virales de

sealizacin celular a travs de las protenas virales codificadas por su segmento A, capaces de
manipular la maquinaria celular para facilitar la sntesis viral y evadir la respuesta de defensa
(Larsen et al., 2004). En este sentido, las protenas virales consideradas como los principales
factores de virulencia de IPNV son la VP2, componente de la cubierta externa de la cpside viral
que participa en el reconocimiento del virus a las clulas; la protena VP5 de funcin no
concluyente, dado que se ha observado no ser necesaria para establecer la infeccin y la
multiplicacin viral, pero con actividad antiapopttica que aparentemente no tiene relacin en el
establecimiento del estado portador (Liu y Vakharia, 2004; Nanda y Baron, 2006).
IPNV presenta alta variabilidad antignica y genotpica, caracterstica que influyen en la
interaccin virus-clula, la virulencia y el desarrollo del estado portador; sin embargo, los
mecanismos involucrados en dichos procesos no estn plenamente determinados (Rodrguez et
al., 2003). Debido a las diferencias existentes en las caractersticas del agente, la fisiologa de los
animales y las condiciones ambientales en que viven, se hace necesario generar un conocimiento
dirigido a identificar estos mecanismos en organismos acuticos, que permita comprender los
procesos celulares, involucrados en el desarrollo de la enfermedad y con ello establecer mejores
estrategias para su manejo o evitar su ocurrencia (Ortega y Enrquez, 2007).
La trucha arcoris Oncorhynchus mykiss (Walbaum, 1792)
La trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) tiene un cuerpo de forma alargada, fusiforme
con 60-66 vertebras, 3-4 espinas dorsales, 10-12 radios dorsales, 3-4 espinas anales, 8-12 radios
anales y 19 radios caudales. Presenta una aleta adiposa, usualmente con borde negro. Tiene una
coloracin azul a verde oliva sobre una banda rosada a lo largo de la lnea lateral y plateada por
debajo de ella. El lomo, los costados, la cabeza y aletas estn cubiertas con pequeos puntos
negros. La coloracin vara con el hbitat, tamao y condicin sexual. Existe una tendencia de los

desovantes en corrientes a ser ms oscuros con color ms intenso, mientras que los desovantes de
lagos son ms brillantes y ms plateados. La ausencia de dientes hioideos es la caracterstica que
ms fcilmente permite distinguirla de Oncorhynchus clarki (FAO, 2006).
La trucha arco iris es nativa de las cuencas que drenan al Pacfico en Norte Amrica. Las
pesqueras de trucha son mantenidas, o su cultivo es practicado, en las cuencas altiplnicas de
muchos pases tropicales y sub-tropicales de Asia, este de frica y Sudamrica. Como resultado,
se han desarrollado varios linajes o cepas locales domesticadas, mientras que otras han surgido a
travs de seleccin masiva y entrecruzamiento para mejorar la calidad de los peces para cultivo.
Muchos pases estn reportando produccin de trucha arco iris cultivada, de los cuales, algunos
tienen produccin relativamente insignificante en comparacin con la produccin de los sistemas
ms grandes que se localizan en los principales pases productores en Europa, Norte Amrica,
Chile, Japn y Australia (FAO, 2006).
La trucha arco iris es un pez resistente y fcil de desovar, de crecimiento rpido (3 a 4
aos de vida), tolerante a una amplia gama de ambientes y manipulaciones. Es capaz de ocupar
muchos hbitats diferentes, que abarcan desde un ciclo de vida andromo (que vive en el ocano
pero desova en ros y corrientes con fondos de grava, flujos rpidos y bien oxigenados) hasta
habitar de manera permanente en lagos. La especie puede soportar amplias gamas de variacin de
temperatura (0-27 C), pero el desove y crecimiento ocurren en una gama ms estrecha (9-14 C).
La seleccin de caractersticas superiores tambin se logra por entrecruzamiento, aumentando las
tasas de crecimiento, resistencia a las enfermedades, fecundidad y mejorando la calidad y sabor
de la carne. Las hembras no desovarn naturalmente en sistemas de cultivo; de modo que los
juveniles deben ser obtenidos ya sea por desove artificial en un partidero o por recoleccin de
huevos de poblaciones silvestres. Las larvas estn bien desarrolladas al momento de la eclosin.
En la naturaleza, las truchas adultas se alimentan de insectos acuticos y terrestres, moluscos,

crustceos, huevos de peces y otros peces pequeos, pero el alimento ms importante son los
camarones de agua dulce, que contienen los pigmentos carotenoides responsables del color
rosado-naranja en la carne. En acuicultura, la inclusin en los alimentos de los pigmentos
sintticos astaxantina y cantaxantina causa que se produzca esta coloracin rosada (FAO, 2006).
En base a lo previamente establecido, es importante diagnosticar el virus de la necrosis
pancretica (IPNV) en las granjas donde llevan a cabo los cultivos de trucha arcoris como una
forma de control y prevencin.
MATERIAL Y MTODO
El procedimiento de diagnstico de la necrosis pancretica infecciosa (IPN) consiste en
pruebas de aislamiento del virus en cultivos celulares, seguido de la identificacin inmunolgica
(OIE, 2006).
Peces: Las muestras utilizadas fueron muestras ciegas previamente obtenidas con fines
acadmicos para el diagnstico de IPNV; cabe mencionar que en el CIESA se reciben muestras
provenientes de distintos comits establecidos en el pas (Quertaro, Michoacn, Guerrero,
Morelos, Hidalgo, Tlaxcala, Veracruz y del Estado de Mxico) y pblico en general (Sinaloa,
Tabasco, Oaxaca, etc.). Los peces pertenecen a la especie Oncorhynchus mykiss (trucha arcoris)
y los rganos que se utilizan para este diagnstico es el hgado, rin y bazo.
Control positivo: Cepa Mexicana de IPNV (VR-299) previamente obtenida (Ortega et al., 2002).
Lnea celular: RTG-2 (Rainbow Trout Gonad), y CHSE-214 (Chinook Salmon Embryo) de la
especie Oncorhynchus tshawytscha.
Toma y obtencin de rganos para diagnostico viral (OIE, 2006)

Sacrificar a los peces por un mtodo humanitario dependiendo de su tamao.

Colocar los peces muertos o insensibilizados sobre una charola o sobre una toalla de papel.
Rociarlos con alcohol al 70%. Realizar grupos de 5 peces. Diseccionar a los peces y extraer

aspticamente trozos de rion, hgado y bazo en proporcin 3:1:1 respectivamente hasta

completar 1 g aproximadamente. Colocar los rganos en el tubo de plstico que contiene 9
ml de MEM (Medio Mnimo Esencial) al 2% de suero fetal bovino, quedando una disolucin
1:10.
El contenido del tubo (el cual debe estar en un recipiente frio) se deposita en un mortero
esteril y frio; despus se regresa parte del medio al tubo.
En el mortero que contiene los rganos y parte del medio se adiciona arena de rio esteril,
para macerar los rganos. La mezcla resultante se vacia nuevamente en el tubo de origen.
Se centrifugan los tubos de 3500 rpm durante 15 minutos a una temperatura de 4 C.
El sobrenadante obtenido se extrae con una jeringa y se hace pasar a travs de un filtro esteril
con una membrana de 0.2 m de dimetro. La mezcla filtrada se coloca en otro tubo estril
identificado y se coloca en refrigeracin a 4 3 C, estando lista para ser inoculado.

Preparacin de placas de clulas para inoculacin viral (OIE, 2006)

Calcular el nmero de pozos que se requieren preparar y la cantidad necesaria de medio

MEM 10% para las placas y la botella de cultivo celular.
Retira el MEM contenido en el frasco o botella con monocapa celular. Lavar las clulas
adicionando a la botella 0.5 ml de tripsina, procurar que la solucin recorra toda la superficie
de la monocapa e inmediatamente retirarla. Repetir este procedimiento una vez ms.
Adicionar 1 ml de tripsina a la botella con clulas, dejndola actuar durante 5 a 10 min,
observando al microscopio cada minuto. Cuando las clulas se observan redondas, se golpea
suavemente con la mano en un extremo de la botella para desprender las clulas. Una vez
que las clulas se han despegado se adiciona 1.5 ml de MEM 10% para bloquear la actividad
de la tripsina sobre las clulas, y se realiza un pipeteo suave sobre la pared de la botella para
homogenizar el contenido de la botella. Acto seguido se adiciona la cantidad necesaria de
medio MEM al 10% para completar el total de cultivo que se desea preparar.
Separar 20 ml de la suspensin de clulas para la botella de cultivo celular; el resto del medio
se adiciona, segn corresponda. En la placa de 24 pozos, colocar 1 ml 100 l, sellar e
identificar cada botella a una temperatura de 20 C.

Inoculacin de muestras biolgicas (OIE, 2006)

En un tubo de plstico estril se depositan 900 l de MEM con 2% de suero fetal bovino y
posteriormente se le adicionan 100 l de muestra, quedando a una dilucin 1:100. Agitar en
vortex e identificar con el nmero de la muestra original.
INOCULACIN: Inicialmente, a cada pozo de la placa de cultivo se le retiran 900 l del
medio MEM, sin tocar el fondo para no daar la monocapa de clulas. Acto seguido, se
inoculan con 100 l de cada muestra debidamente identificada en diluciones 1:10 y 1:100
por duplicado, sin tocar la monocapa celular. En la misma placa se dejan dos pozos sin
inocular para usarse como control negativo y como control positivo tambin se inoculan dos
pozos con 100 l del virus de referencia.

La placa se sella con cinta aislante blanca para permitir la adsorcin, se incuba durante 1
hora a 15 C. Despus de este tiempo, a cada pozo de la placa se adiciona 1 ml 100 l de
MEM al 2% de suero fetal bovino. Las placas inoculadas son selladas con cinta aislante y se
colocan en incubacin para permitir la replicacin viral a una temperatura de 15 C por 7
dias; en este tiempo es necesario checar las placas cada 24 horas, buscando el efecto
citopatico (ECP) causado por el virus citopatognico a las clulas.

Inmunofluorescencia indirecta (IFAT; OIE, 2006).

Se debe preparar una placa de 6 pozos con anterioridad para esta prueba, en la cual se
colocan en cada poco un cubreobjetos cubreobjetos (esto depender del nmero de muestras
que hayan mostrado ECP) y se repite el procedimiento de inoculacin.
Se espera a que se observe ECP en ms del 50% de los pozos inoculados con las muestras
ciegas y se procede a realizar la tincin.
TINCIN: Se deben extraer los cubreobjetos de los pozos de la placa de 6 pozos y dejarlos
secar a temperatura ambiente con ayuda de la campana de flujo laminar.
Agregar acetona fra (-20 C) hasta tapar el cubreobjetos y dejar secar (entre 15 a 30 min).
Lavar los portaobjetos en un recipiente y agregar abundante solucin de lavado previamente
diluida (1:25) y dejarlos reposar por 3 a 5 min. Repita este procedimiento 2 veces ms.
Remover los portaobjetos del recipiente y eliminar el exceso de solucin evitando que el
tejido se seque.
Agregar sobre cada portaobjetos 100 l del reactivo oligoclonal, previamente diluido 1:100
con la solucin de dilucin e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente por 30 min en
una cmara humeda cerrada. Evitar que se seque la solucin del anticuerpo.
Repetir el lavado con la solucin de lavado.
Agregar sobre cada portaobjetos 100 l del conjugado-FITC, previamente diluido 1:100 con
la solucin de dilucin. Incube los portaobjetos a temperatura ambiente por 30 min en una
cmara hmeda cerrada y en oscuridad.
Repetir el lavado con la solucin de lavado y dejar secar en la oscuridad a temperatura
ambiente.
Colocar una gota de resina para la fijacin sobre el cubreobjetos evitando la formacin de
burbujas. Las muestras se deben de examinar en un microscopio de fluorescencia con un
aumento de 1000x para realizar el diagnstico.

RESULTADOS
Una muestra positiva en las placas debe presentar el efecto citoptico (ECP) ocasionado
por IPNV. La presencia de IPNV ocasionara una desnaturalizacin en la monocapa formada por
las clulas, provocando que se redondeen y se desprendan de la pared de la placa (figura 1). Se
diagnostica una muestra negativa cuando las clulas, despus de 7 das no muestran ECP y se
observa la monocapa sin ningn dao.

Figura 1: Clulas CHSE-214 mostrando ECP despus de 4 das de haber sido inoculadas con las muestras ciegas.

En la prueba de inmunofluorescencia indirecta, una muestra positiva debe presentar una

fluorescencia especfica de color verde del tejido. La presencia de IPNV aparece como una
fluorescencia verde difusa en el citoplasma de las clulas infectadas (figura 2). Se diagnostica una
muestra negativa por la ausencia de fluorescencia en las clulas o tejido.

Figura 2: Prueba de inmunofluorescencia indirecta en clulas RTG-2, mostrando la presencia de IPNV en el citoplasma.

DISCUSIN
Para el diagnstico de IPNV, se llev a cabo en base al protocolo recomendado por la OIE
(2006), en el cual se sigue un proceso ciertamente complicado y tardado debido a los multiples
pasos que se deben realizar con suma cautela y el tiempo que tardan las clulas en crecer y
mostrar el Efecto citoptico (ECP), sin embargo, es considerado como la prueba irrefutable para
el diagnstico del virus de la necrosis pancretica infecciosa (IPNV) en peces, especficamente
salmnidos, y otras enfermedades virales con caractersticas particularmente parecidas. Cabe
mencionar que el trabajar con cultivo de clulas requieren de condiciones de laboratorio
especificas al igual que de equipo apto (esterilizacin y calibracin). De igual manera, ambas
lneas celulares (RTG-2 y CHSE-214) mostraron ser aptas para la deteccin de IPNV.
Se us el virus de referencia utilizado por el laboratorio, y de igual manera, se analizaron
muestras ciegas en las cuales se obtuvieron resultados positivos que contrastan lo observado en
el control positivo por lo cual indica que se est llevando un desequilibrio en las clulas ya que
IPNV induce muerte celular por represin del gen del factor de sobrevivencia Mcl-1 (molculas
pro y antiapoptosis). Se sugiere que las protenas virales podran estar relacionadas de forma
directa o indirecta en este proceso; sin embargo, el mecanismo responsable an no es claro. Al
parecer en la batalla virus-hospedero, la clula en un intento por contrarrestar al virus responde
induciendo apoptosis. En contraste, el virus trata de producir la mayor progenie posible
liberndola de la clula infectada a travs de la lisis celular. Por tanto, el resultado de la infeccin
podra depender de la habilidad del hospedero para montar una respuesta apopttica (Ortega y
Enrquez, 2007).
IPNV-Fluoro Test es un ensayo de inmunofluorescencia indirecta para la deteccin del
virus de la necrosis pancretica infecciosa (IPNV) en muestras de tejidos de peces as como en

lneas celulares infectadas con el patgeno. IPNV-Fluoro Test indirecto utiliza una mezcla de
anticuerpos monoclonales que son especficos para el virus IPN del serotipo Sp como VR-299. Al
agregar este reactivo a preparaciones de tejidos que contienen el patgeno, los anticuerpos
reaccionan con las protenas VP2 y VP3 del IPNV. Despus de una etapa de lavado para remover
el anticuerpo libre, la presencia del virus se detecta con un anticuerpo anti-IgG de ratn
conjugado con FITC y posterior observacin en un microscopio de fluorescencia. La presencia de
virus se visualiza como una intensa fluorescencia verde en el citoplasma de las clulas infectadas
(OIE, 2006). En cuanto al desarrollo del protocolo para la deteccin de IPNV en Mxico, este
proceso es nico en el pas e inclusive en Latinoamrica, ya que laboratorios similares solo
existen en Chile.
CONCLUSION
Durante la realizacin de este trabajo, se recalca que el proceso de laboratorio para el
diagnstico de IPNV de acuerdo al protocolo recomendado por la OIE (2006) es bastante
complicado y tardado, pero sus resultados para la deteccin de enfermedades emergentes en
peces causadas por virus son inequvocos, por lo cual es de suma importancia realizar este tipo de
procedimientos para lograr llevar un sistema de control y prevencin entre las granjas de trucha
arcoris que existen en Mxico. Su diagnstico ayuda en el mejoramiento de los sistemas de
inocuidad dentro de las mismas granjas para exportar y vender productos de calidad. De igual
manera, sera deseable trabajar con muestras de animales sospechosos o en muestras de animales
supuestamente libres del virus como medida de confirmacin.
Es importante sealar que no cualquier laboratorio est calificado para llevar a cabo este
tipo de diagnstico, ya que se requieren de condiciones de laboratorio y conocimientos o
habilidades tcnicas que mejoren la calidad del servicio brindado a la sociedad.

REFERENCIAS
Aranda, M., Reyes, M. y Ramrez, C. (2007). Transfeccin de la lnea clular de salmn
CHSE-214 usando un liposoma no comercial. Arch. Med. Vet. (39): 173-178
Fenner, F., Bachmann, P.A., Gibbs, E.P.J., Murphy, F.A., Studdert, M.J. y White, D.O. (1992).
Virologia veterinaria. Acribia S.A., Espaa. 691 p.
Larsen, R., Rokenes, T.P. y Robertsen, B. (2004). Inhibition of infectious pancreatic necrosis
virus replication by Atlantic salmon Mx 1 protein. J. virol. (78): 7938-7944.
Liu, M. y Vakharia, V.N. (2004). VP1 protein of infectious bursal disease virus modulates the
virulence in vivo. Virol. (330): 62-73
Lyles, D. (2000). Cytopathogenesis and inhibition of host gene expression by RNA viruses.
Microbiol. And Mol. Biol. Rev. (64): 709-724.
Nanda, S. y Baron, M. (2006). Rinderpest virus blocks type I and type II interfern action:
role of structural and nonstructural proteins. J. virol. (80): 7555-7568
Organizacin Mundial de Salud Animal (OIE). (2006). Manual of diagnostic tests for aquatic
animals. 5a ed. Organisation Mondiale de la Sant Animale. France. 358 p.
Organizacin Mundial de las Naciones Unidas para la Alimentacin y la Agricultura (FAO).
(2006). Programa de informacin de especies acuticas. Departamento de Pesca y
Acuicultura. 13 p
Ortega, C., Montes de Oca, R., Groman, D., Yason, C., Nicholson, B. y Blake, S. (2002). Case
report: Viral infectious pancreatic necrosis in Farmed rainbow trout from Mxico. J.
Aquat. Anim. Health. (14): 305-310
Ortega, C. y Enrquez, R. (2007). Factores asociados a la infeccin celular por el virus de la
necrosis pancretica infecciosa (IPNV). Arch. Med. Vet. (39): 7-18
Ortega, C., Vega, F. y Enrquez, R. (2007). Occurrence of the infectious Pancreatic necrosis
virus in Rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) farms in Hidalgo State, Mexico. Bull.
Eur. Ass. Fish Pathol. (27): 100-107
Rodrguez, S., Alonso, M. y Prez-Prieto, S. (2001). Detection of infectious pancreatic necrosis
virus (IPNV) from leukocytes of carrier rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Fish
Pathol (36): 13-46
Rodrguez, S., Borrego, J.J. y Prez-Prieto, S.I. (2003). Infectious pancreatic necrosis virus:
biology, pathogenesis, and diagnostic methods. Adv. Vir. Res. (62): 113-165
Vega, L.F., Montes de Oca, R., Valladares, B., Martnez-Castaeda, S., Alonso, U., Enrquez, R.
y Ortega, C. (2011). Evaluacin de la respuesta clnico-patolgica e inmune humoral
en cras de trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss) infectadas experimentalmente
con el virus de la Necrosis Pancretica Infecciosa (IPNV). Arch. Med. Vet. (43): 27-34
Wolf, K. (1998). Infectious pancreatic necrosis. In: Fish viruses and fish disease. Cornell
University Press, Ithaca, NY, USA. 157 pp.